优化慢病毒生产和细胞培养必要条件，成功转导初级人支气管上皮细胞

摘要

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

摘要

在使用空气-液体界面条件下提供了一个有用的模型来研究气道细胞分化和功能的处理原代人支气管上皮（HBE）细胞的体外培养。在过去的几年中，为转基因递送中使用的慢病毒载体的成为普遍的做法。虽然有完全分化的呼吸道上皮细胞与某些非HIV伪类型的慢病毒转导的报道，整体转导效率通常低于15％左右。这里介绍的协议提供了可靠和有效的方法，以产生慢病毒和转导原代人支气管上皮细胞。用未分化的支气管上皮细胞，支气管上皮生长培养基转导，而细胞附着，具有4感染因子的多个提供接近100％的效率。本协议描述的，一步一步的，高滴度的慢病毒载体及日的准备和浓度Ë传导过程。它讨论了确定的最佳培养条件，以实现初级人支气管上皮细胞的高效转导的实验。

引言

复制缺陷型，假慢病毒的发展（LV）也为研究人员提供一个安全和有效的方法， 在体外 ¹提供转基因。由于它们的长期表达，这些LV也可以用于治疗剂的体内 ^2,3的输送。生产的LV需要人胚胎肾（HEK）细胞的几个质粒共转染:转移载体，包装的gag / POL，包装转速 ，和包络水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）的质粒。第三代包装系统被认为比第二代系统更安全，因为转速基因被编码在一个单独的包装质粒，从而降低重组的可能性，以产生具有复制能力的慢病毒。虽然第二代包装系统收率五倍高的总转导单元，原病毒基因组的分割以创建第三代系统已降低转导的水平仅最低限度^3,4。

而细胞系可更容易和有效地转导，研究人员已经将重点转向主细胞，因为这些是更具有代表性的体内组织中^5,6。然而，原代细胞是难治转导。而完全分化呼吸道上皮细胞的转导已经报道，整体效率还没有超过15％的^7。

这里描述的是一个协议，允许生产高滴度的LV的。一个一步一步的方法概述实现近100％的转导效率分为原发性支气管上皮细胞。更具体地，该协议描述器乐成功³的最佳培养条件。简言之，HEK 293T细胞使用的是带有增强型绿色荧光的EF-1启动子驱动表达慢病毒载体转染PCDH蛋白（EGFP）或mCherry，红色荧光蛋白，和一个第三代包装系统。释放到介质的LV被收集24至72小时后。病毒颗粒集中用聚乙二醇（PEG），病毒浓度的方便和简单的方法，采用了p24抗原的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒滴度估计之前。随后，未分化的初级HBE细胞被转导在增殖培养基（支气管上皮生长培养基或^BEGM）8，而安装（被胰蛋白酶处理后），在感染复数的4（MOI）因子，加入聚凝胺和温育16小时（过夜）。然后允许细胞分化。由于病毒的转基因被表达长期（使用适当的启动子，见讨论），表达将在整个分化维持成假呼吸道上皮或可以（使用诱导型启动子）的分化后诱导。

此协议是广泛的兴趣谁想要使用原HBE细胞，而不是细胞系的研究人员，并可能适用于其他难以转导的细胞类型。

研究方案

1.第一阶段:HEK 293T文化

1. 制备HEK细胞培养基中添加10％（V / V）胎牛血清（FBS）和1％（体积/体积）青霉素/链霉素，以高糖的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基（DMEM）（简称为HEK介质）。
2. 涂布一10厘米组织培养皿胶原I.混合30胶原微升我在2ml蒸馏水中。扩散混合到培养皿孵育在37℃下2小时和5％ _的 CO _2。
3. 取出混合物，并让在层流柜的菜干燥15分钟。
4. 板HEK细胞上以在10毫升的HEK媒体1×10 ^6个细胞的密度涂布培养皿孵育在37℃和5％的CO _2。
5. 当HEK细胞50-60％融合（ 图1a，电镀后2-3天），进行第2阶段的Visual汇合的评估就足够了。不需要定量。
   注意:HEK细胞是在HEK培养基（见上文）。当他们到达汇合，T哎可以分割（ 例如 1/5）或冷冻下来以后使用。

2.第二阶段:在HEK细胞生产和慢病毒（LVS）的浓度

注:本协议应与机构和政府规章线以下的BSL-2在美国+（增强BSL-2）的条件下执行。

1. 使用钙沉淀过程转染（脂质体和其它转染剂不如钙沉淀步骤，有效）。市售的转染试剂盒的用途，建议以保证再现性，虽然该过程修改如下。将所有试剂置于室温。这为0的一天。
2. 对于HEK293细胞每10 cm培养皿，搭配4.5微克包膜DNA PMD2-VSVG的，7.5微克包装DNA pMDLg / pRRE，3.75微克DNA PRSV-REV，慢病毒表达载体的10微克DNA，86微升的2M钙溶液和无菌水在一15ml离心管，以700微升的最终体积（在商业转染试剂盒中提供的后两个解）。
3. 逐滴添加2×HEPES-缓冲盐水的700微升（HBS，在转染试剂盒中提供），而涡旋（在层流柜）并在室温下温育30分钟（执行步骤4在等待）。
4. 在早期的孵化时间，定金5微升幻灯片上的搭配。检查液滴是10X的目标，在显微镜下，重点慢慢向上和向下。一种细的沉淀物应该是可见的，证实了磷酸钙沉淀法（ 图1b）。
5. 通过加入10ml的HEK细胞介质和移液器上下的混合停止30分钟后的沉淀。
6. 以HEK细胞的培养皿步骤2.1-2.5，并取出介质（0天）。小心缓慢地添加来自步骤2.5的沉淀溶液沿着盘的边缘。
7. 次日（第1天），除去并丢弃培养基含有沉淀并更换瓦特第i个10毫升HEK培养基。检查在显微镜下精细沉淀物:它应该是在细胞（ 图1C和D）之间的空白空间的菜可见。
8. 第2天，收集培养基用注射器，过滤器通过0.45μm针筒过滤器进含有3.8毫升40％聚乙二醇（PEG）溶液15毫升离心管中。倒置5倍以混合并储存在4℃下至少24小时（对于PEG沉淀形成，但超过5天不再），直到所有的病毒集合是完整的。
9. 天3和4。第4天，重复步骤2.8不HEK中等取代但10％的漂白粉消毒和丢弃的菜。
10. 离心机所有收集管（通常在第5天在一起的所有集合）于1650×g离心20分钟，在4℃以沉淀病毒。除去并弃去上清液，并在4℃下于1650 xg离心再次旋转5分钟以收集和去除的PEG上清的任何剩余。
11. Resus挂起在200μl支气管上皮生长培养基（BEGM）的每个管的无两性霉素B ⁸沉淀。池他们在一起，并在200微升等分试样。在-80°C储存病毒。分装额外的10微升进行HIV-1加格（P24）抗原ELISA检测。
12. 使用商业ELISA试剂盒，根据制造商的协议来执行一个p24抗原测定。该试验给出了以pg / ml的病毒的p24的估计。

3.第三阶段:培养初HBE细胞

1. 在10ml BEGM介质板HBE细胞（用100μl两性霉素B，如果通道0细胞用于消除可能的真菌污染）在我涂覆10厘米组织培养皿胶原一个1×10 ^6个细胞的密度。在37℃和5％的CO _2。
2. 次日，除去培养基并用10ml BEGM取代（用100μl两性霉素B为通道0细胞），共4天。返回到孵化器。
3. 经过4天AYS，只使用不BEGM两性霉素B更改媒体隔日1次。
4. 当细胞为80-90％汇合（ 图2a;〜铺板后7天），则继续转导（注意3.5用于制备转导之前）。再次，汇合的视觉评估是足够的。不需要定量。
5. 前转导，外衣用IV型胶原溶液的透气性支承插入物稀释1/10用无菌蒸馏水。加入200μl到每个插入，并让在层流柜干燥过夜。

4.第四阶段:支气管上皮细胞转导

1. 除去介质，用磷酸盐缓冲盐水（EDTA / PBS）中加入3毫升0.1N％胰蛋白酶在1mM的乙二胺四乙酸和孵育在37℃5分钟和5％ _的 CO _2。检查显微镜（10X物镜）下，看看是否所有单元被分离。如果没有，返回到培养箱中另外5分钟。
2. 当所有的细胞分离，加入3毫升大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI 1毫克/毫升），混合并转移至15毫升离心管中。通过在460 xg离心纺丝在室温下5分钟沉淀细胞。
3. 除去上清液，重悬沉淀于3ml BEGM并具有计数继续。
4. 悬浮HBE细胞（现在通道1或P1）以2×10 ^5个细胞每112毫米透气性支承插入于400μlBEGM的（ 见表2）的比率。推断基于将要转导的透气性支承插入物的量这些数字。

表面	表面积	细胞计数	媒体	体积（媒体）
10cm皿	52.7厘米2	1×10 6个	BEGM	10毫升
12毫米过滤器	1.13厘米2	2×10 5个	BEGM	400微升
24毫米过滤器	4.52厘米2	8×10 5个	BEGM	800微升

表2:每个细胞计数媒体推断。

5. 使用的4感染复数（MOI）因子的多个，添加病毒的适当体积的细胞悬浮液。
6. 聚凝胺添加至2微克/毫升的最终浓度。
7. 免除400微升每透水支持插入混合（BEGM，HBE细胞，病毒和聚凝胺）进入顶部隔室，独自加入1ml BEGM到基底仓。在37℃和5％的CO ₂总是板HBE细胞孵育过夜无病毒作为对照和测试嘌呤选择（如果适用）。
8. 第二天，对物OVE根尖和基底外侧培养基，用PBS洗，并替换为空气-液体界面（ALI）媒体⁸两个室。
9. 当细胞汇合，除去心尖流体（称为建立气 - 液界面）。继续隔日舱底部改变介质（ALI），直到他们达到完全成熟;通常为3至4周后。
   注意:如果慢病毒载体含有一个选择基因，如嘌呤霉素，细胞可以通过根据选择浓度曲线加入嘌呤霉素进行选择。对于HBE细胞，1微克/ ml的浓度被确定为理想的转导的细胞的一致的选择。然而，这个浓度可能会有所不同其他细胞或条件，应由杀死曲线来确定。媒体已经更换后ALI媒体或更高版本（2-3天），允许选择基因充分表达嘌呤霉素的加入可以开始，早一天。一定要嘌呤霉素添加到一个插入使得h因为没有被转导。可以加入嘌呤霉素直至细胞完全分化。

结果

图1描绘了在转染过程评估细胞和溶液的不同的关键步骤。 图1A示出的HEK293T细胞的转染病毒的产生之前最佳汇合。重要的是，将细胞在整个培养皿均匀分布。 图1b中揭示了在使用明视野光学系统和一个10X物镜的转染混合物一滴沉淀。越的析出物像砂粒，而不是附聚物，更有效的转染将。在这张图片中，沉淀物是有点粗糙。该沉淀物是?...

讨论

这里所概述的协议保证接近100％转导效率。但是，也有在此过程中是实现这一目标的重要步骤。例如，在转染过程中，析出物中的转导结构的存在（下降），或在培养皿后转导（ 图1b和d）该天是一个良好的转染都相关。没有沉淀物或附聚物的存在可能是由于在转染试剂中的一个的遗漏，pH值的问题，或坏质粒制备。如果沉淀缺失，有很高的可能性，没有将可见的第二天。...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	12306C	use at 10%
DMEM	Thermo Scientific	11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x)	Thermo Scientific	15140-122	use at 1x
Collagen I	BD Biosciences	354231	dilute 1:75 in distilled water
Calphos	Clontech	631312	Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000	VWR scientific	101108-210	stock of 40%
Amphotericin B	Sigma	A9528	use at 1x
Trypsin	Sigma	T4799
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9128
Transwell 12mm	Corning	3460
Collagen IV	Sigma	C7521	dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide	Sigma	H9268	stock of 2mg/ml
Puromycin (10.000x)	Thermo Scientific	A11138-03	use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA	PerkinElmer	NEK050001KT
F12	Thermo Scientific	11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro	System Biosciences	CD532A-2	lentiviral expression vector
pMD2-VSVG	Addgene	12259	packaging DNA
pMDLg/pRRE	Addgene	12251	packaging DNA
pRSV-rev	Addgene	12253	packaging DNA