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요약

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

초록

호흡기 세포 분화 및 기능의 처리를 연구하는 유용한 모델을 공기 - 액체 계면 상태를 제공하여 기본 인간 기관지 상피 (HBE) 세포의 시험 관내 배양한다. 지난 몇 년 동안, 유전자 전달에 대한 렌티 바이러스 벡터의 사용은 일반적인 관행이되었다. 특정 비 HIV 의사 입력 렌티 완전히 분화 된기도 상피 세포의 형질 도입의보고가 있지만, 전체의 전달 효율이 일반적으로 15 % 미만이다. 여기에 제시된 프로토콜은 신뢰할 수 있고 효율적인 방법 렌티 바이러스를 제조하고,이 차 인간 기관지 상피 세포를 형질 도입하기를 제공한다. 세포가 부착하는 동안 4 감염 인자의 다양성과 함께, 미분화 기관지 상피 세포, 기관지 상피 성장 배지에서 형질을 사용하여 100 %에 가까운 효율을 제공한다. 이 프로토콜은, 단계적으로 높은 역가 렌티 바이러스 벡터 및 제의 제조와 농도를 설명전자 전달 방법. 이는 일차 인간 기관지 상피 세포 transductions 고효율을 달성하기 위해 최적 배양 조건을 결정 실험을 설명한다.

서문

복제 결함, pseudotyped 렌티 바이러스의 개발 (LV)는 관내 1 유전자를 전달하기 위해 안전하고 효율적인 방법으로 연구자를 제공하고 있습니다. 그들의 장기 표현이 LV는 또한 생체 내에서 2,3- 치료제의 전달을 위해 사용될 수있다. LV의 생산은 여러 플라스미드 인간 배아 신장 (HEK) 세포의 공동 - 형질 필요 전이 벡터 포장 개그 / 폴, 포장의 회전을하고, 수 포성 구내염 바이러스 당 단백질 (VSV-G) 플라스미드 봉투. 레브 유전자하여 복제 가능 렌티 바이러스를 생산하는 재조합의 가능성을 감소시키는, 별도의 패키징 플라스미드 인코딩되기 때문에 제 3 세대 포장 시스템은 제 2 세대 시스템보다 안전한 것으로 간주된다. 2 세대 포장 시스템 다섯 배 더 높은 총 전달 유닛을 수득하지만, 원래의 바이러스 게놈의 분할 만드는3 세대 시스템은 최소한 3,4- 전달 레벨이 감소하고있다.

세포주를보다 쉽고 효율적으로 형질 도입 될 수 있지만 이러한 생체 더 대표는 5,6 어떤 조직이 있기 때문에, 연구자들은 일차 전지에 그들의 초점을 이동하고있다. 그러나, 일차 전지는 전달하는 내화물이다. 완전히 분화 ​​된기도 상피 세포의 형질 도입이보고되었지만, 전체 효율은 15 % 7을 초과하지 않았다.

높은 역가의 정맥 주사의 생산을 가능하게하는 프로토콜은 여기에 설명한다. 단계별 접근법은 기본 HBE 세포로 거의 100 % 형질 도입 효율을 달성하기 위해 설명된다. 구체적으로는, 프로토콜은 3 성공 쓸모 최적 배양 조건을 설명한다. 간단히, HEK의 293T 세포는 향상된 녹색 형광의 EF-1 프로모터 구동 식으로 렌티 바이러스 발현 벡터 pCDH를 사용하여 형질단백질 (eGFP는) mCherry 또는 적색 형광 단백질, 및 제 3 세대의 패키징 시스템. 미디어에 발표 정맥 주사 이후 24 시간 (72)에 수집된다. 바이러스 입자는 P24 항원의 효소 면역 분석법 (ELISA) 키트를 사용하여 역가를 추정하기 전에, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 바이러스의 농도를 더욱 간편한 방법에 집중된다. 4 (MOI) 인자 감염 다중도에서 (트립신 처리 후)에 부착하는 동안 계속해서, 미분화 차 HBE 셀 (hexadimethrine 브로마이드를 첨가하고, 16 시간 동안 배양하고, 증식 배지 (기관지 상피 성장 배지 또는 BEGM) (8)에 형질 도입되고 밤새). 세포는 분화 할 수있다. 바이러스 유전자는 (설명을 참조 적절한 프로모터를 사용하는) 장기간 발현되므로, 발현은 pseudostratified기도 상피 세포로의 분화에 걸쳐 유지된다 또는 분화 후 (유도 성 프로모터를 사용하여) 유도 될 수있다.

이 프로토콜은 세포주 대신 차 HBE 세포를 사용하고자하는 연구자들에게 폭 넓은 관심, 그리고 세포 유형을 형질 도입하는 다른 어려움에 적용 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 1 단계 : HEK 293T의 문화

  1. 고 글루코스 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에 10 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS), 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 첨가하여 (HEK 매체로 칭함) HEK 세포 매체를 준비한다.
  2. 코트 콜라겐 콜라겐 I. 믹스 30 μL I 증류수 2 ㎖에 한 10cm 조직 배양 접시. 접시에 믹스를 확산하고 37 ° C에서 2 시간 5 % CO 2 품어.
  3. 믹스를 제거하고 15 분 동안 층류 캐비닛의 접시를 건조하게 할 수 있습니다.
  4. HEK 10 ㎖ 배지에서 1 × 106 세포의 밀도로 피복 된 접시 상에 플레이트 HEK 세포를 37 ℃에서 배양한다, 5 % CO 2.
  5. HEK 세포 (2~3일 도금 후 그림 1a) 50-60% 합류 경우, 포화 상태의 2 비주얼 평가를 충분한되는 무대로 진행합니다. 어떤 정량화가 필요하지 않습니다.
    참고 : HEK 세포 (위 참조) HEK 미디어에서 배양한다. 그들이 포화 상태에 도달 t헤이 분할 (예 : 1/5) 또는 나중에 사용하기 위해 아래로 고정 할 수 있습니다.

2. 2 단계 : HEK 세포의 생산 및 렌티 (정맥 주사)의 농도

참고 : 프로토콜은 BSL-2 미국에서 + (강화 BSL-2) 조건에서 기관 및 정부 규제에 맞춰 실행해야합니다.

  1. 칼슘 침전 절차를 사용하여 형질 (리포 펙 타민과 다른 형질 에이전트는 칼슘 침전 절차와 효율적하지 않았다). 다음과 같은 절차가 변경 되더라도 상업 형질 전환 키트의 사용은, 재현성을 보장하는 것이 좋습니다. 실온에 모든 시약을 가져와. 이 날 0입니다.
  2. HEK293 세포의 각 10cm 접시를 들어, 봉투 DNA pMD2 - VSVG의 4.5 μg의 7.5 μg의 DNA pMDLg / pRRE을 포장, 3.75 μg의 DNA pRSV 반전, 렌티 바이러스 발현 벡터의 10 μg의 DNA, 2 M 칼슘 용액 86 μl를 혼합 및 700 ㎕의 최종 부피로 15 mL의 원심 분리 튜브 내의 멸균(후자의 두 솔루션은 상업 형질 전환 키트에 제공된다).
  3. 현명한 드롭 (트랜 키트에 HBS) 배 HEPES 완충 식염수 700 ㎕를 (층류 캐비닛) 텍싱하면서 추가하고 30 분 (기다리는 동안 4 단계를 수행)을 실온에서 품어.
  4. 초기 배양 시간 동안, 슬라이드에 믹스의 예금 5 μL. 천천히 위아래로 초점을 10 배 목표와 현미경으로 액체 방울을 확인합니다. 미세한 침전물은 인산 칼슘 침전 방법을 확인하는 표시한다 (도 1B).
  5. 혼합하는 상하 HEK 세포 미디어와 피펫 10 ㎖를 첨가하여 30 분 후 침전를 중지합니다.
  6. 단계 2.1-2.5에서 HEK 세포의 접시를 타고와 매체 (0 일)을 제거합니다. 접시의 가장자리를 따라 조심스럽게 천천히 단계 2.5에서 침전물 솔루션을 추가합니다.
  7. 다음날 (1 일)에서 분리하고, 침전물을 함유하는 배지를 버리고 승 대체HEK 배지 10 ㎖ 번째. 현미경 미세 침전물 확인 : 그것은 세포 (도 1C 및 d) 사이의 빈 공간에 접시에 볼 수 있어야합니다.
  8. 제 2 일에, 40 %의 폴리에틸렌 글리콜 3.8 ㎖ (PEG) 용액을 함유하는 15 mL의 원심 분리 튜브에 0.45 ㎛의 주사기 필터를 통해 주사기, 필터 매체를 수집한다. 합니다 (PEG가 형성 침전,하지만 더 이상 오일보다 용) 바이러스 컬렉션의 모든 때까지 완료 반전 5 배는 최소 24 시간 동안 4 ℃에서 혼합하지 않고 저장합니다.
  9. 일 3 일 4 4. 단계를 반복 2.8 HEK 매체를 대체하지만 10 %의 표백제로 오염을 제거하고 요리를 폐기하지 않습니다.
  10. 4 ° C에서 20 분 동안 1,650 XG에 원심 분리기 모든 컬렉션 튜브 (함께 5 일에 일반적으로 모든 컬렉션) 바이러스 펠렛합니다. 제거하고 뜨는을 폐기하고, 수집 및 PEG 상등액의 나머지를 제거하기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 1,650 XG에 다시 스핀.
  11. ResusPEND 암포 테리 신 B (8)가없는 기관지 상피 성장 배지 (BEGM) 200 ㎕를 각 튜브의 펠렛. 함께 수영장과 200 μL에서 나누어지는. -80 ° C에서 보관 바이러스. 에이즈-1 개그 (P24) 항원 ELISA 분석을 수행하기 위해 추가로 10 μl를 나누어지는.
  12. 시판 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 P24 항원 분석을 수행한다. 분석은 pg / ml 인에서 바이러스 P24의 추정치를 제공합니다.

3. 3 단계 : 문화 차 HBE 세포

  1. 10 ㎖ BEGM 매체에 플레이트 HBE 세포 I은 10cm 조직 배양 접시 코팅 콜라겐 1 × 106 세포의 밀도로 (100 μL 암포 테리 신 B와 통로 0 세포 수 진균의 오염을 제거하기 위해 사용되는 경우). 37 ° C에서 품어 5 % CO 2.
  2. 다음날, 배지를 제거하고 사일 총 (100 μL 통로 암포 테리 신 B와 0 세포)를 10 ㎖ BEGM 교체. 인큐베이터로 돌아갑니다.
  3. 4 D 후,AYS는 매일 암포 테리 신 B를 변경 매체없이 만 BEGM를 사용합니다.
  4. 세포가 80-90% 합류 (그림 2a; ~ 칠일 도금 후) 때, 전달 진행 (전달하기 전에 준비를 위해 3.5에주의). 또, 포화 상태의 시각적 평가는 충분하다. 어떤 정량화가 필요하지 않습니다.
  5. 전달에 앞서, 외투 콜라겐 IV 용액 투과성지지 인서트는 멸균 증류수로 1/10 희석 하였다. 각 삽입에 200 μl를 추가하고 층류 캐비닛 건조 하룻밤을 할 수 있습니다.

4. 4 단계 : HBE 세포의 형질 도입

  1. 용지를 꺼내 인산염 완충 생리 식염수 (EDTA / PBS)에 1 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 0.1 % 트립신 3 ㎖를 추가하고 37 ° C에서 5 분 5 % CO 2를 품어. 모든 세포가 분리되어 있는지 확인하기 위해 현미경 (10X 목적)에서 확인하십시오. 그렇지 않은 경우, 추가로 5 분 동안 인큐베이터로 돌아갑니다.
  2. 모든 세포가 분리되는 경우 (3)을 추가대두 트립신 억제제 ㎖ (SBTI 1 ㎎ / ㎖)을 혼합하고 15 mL의 원심 분리 튜브에 이송. 실온에서 5 분 동안 460 XG에서 회전하여 세포 펠렛.
  3. BEGM 3 ㎖에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거하고 계수를 진행합니다.
  4. BEGM 400 μL (표 2 참조)에서 하나 12mm 투과성지지 인서트 당 2 × 105 세포의 비율로 재현 탁 HBE 세포 (이제 통로 1 P1). 형질한다 투과성지지 인서트의 양에 기초하여 이들 숫자를 추정.
표면 표면적 세포 수 미디어 볼륨 (미디어)
10cm 접시 52.7 cm (2) 1 × 10 (6) BEGM 10 ml의
12mm 필터 1.13 cm (2) 2 × 10 5 BEGM 400 μL
24mm 필터 4.52 cm (2) 8 × 105 BEGM 800 μL

표 2 : 세포 수에 따라 미디어 외삽.

  1. (4)의 감염 (MOI) 계수의 다양성을 이용하여 세포 현탁액으로 바이러스가 적절한 볼륨.
  2. 2 μg의 / ml의 최종 농도 hexadimethrine 브로마이드를 추가합니다.
  3. 꼭대기 실에 투과 지원 인서트 당 믹스 (BEGM, HBE 세포, 바이러스 및 hexadimethrine 브로마이드) 400 μl를 분배하고, 기저 구획에 혼자 BEGM 1 ㎖를 추가합니다. 제어 및 테스트 퓨로 마이신 선택 (해당하는 경우)와 같은 바이러스없이 37 ° C, 5 % CO 2. 항상 판 HBE 세포에서 밤새 품어.
  4. 다음 날, REM 수면에비켜 혀끝과 기저 미디어, PBS로 세척하고, 공기 - 액체 인터페이스 (ALI) 미디어 8 두 구획을 교체합니다.
  5. 세포가 컨 플루 언트 될 때, (공기 - 액체 계면을 확립라고도 함) 꼭대기 유체를 제거한다. 그들은 완전한 성숙에 도달 할 때까지 바닥 구획 매일의 매체 (ALI)를 변경 계속; 보통 3 ~ 4 주 후.
    주 : 렌티 바이러스 벡터는 퓨로 마이신과 같은 선별 유전자를 포함하는 경우, 세포를 선택 농도 곡선에있어서, 퓨로 마이신을 첨가하여 선택 될 수있다. HBE 세포, 1 μg의 / ml의 농도가 형질 도입 된 세포의 선택 일치 이상적인 것으로 결정되었다. 그러나,이 농도는 다른 세포 또는 조건과 다를 수 있습니다 곡선을 살해에 의해 결정되어야한다. 미디어가 선택 유전자의 전체 표현을 할 수 있도록 나중에 ALI 미디어 또는 (2-3 일)로 대체 한 후 퓨로 마이신의 추가는 이른로 하루를 시작하세요. 하나의 삽입 그 시간에 퓨로 마이신을 추가해야합니다같은 형질 도입되지 않았다. 세포가 완전히 분화까지 퓨로 마이신이 첨가 될 수있다.

결과

도 1은도 1a. 형질 감염 과정 셀 솔루션을 평가하는 다른 주요 단계를 도시 전에 바이러스 생산을위한 형질 전환에 HEK293T 세포의 최적의 포화 상태를 나타낸다. 이는 세포가 접시에 걸쳐 균등하게 분배하는 것이 중요하다.도 1b는 명 시야 광학계 및 10X 대물 렌즈를 이용하여 형질 전환 혼합물의 드롭 침전물을 보여주?...

토론

여기에 설명 된 프로토콜은 100 % 전달 효율에 가까운 보장합니다. 그러나,이 목표를 달성하기 위해 중요한 과정에서 단계가있다. 예를 들어, 형질 전환 과정은 형질 믹스 석출물의 존재 (드롭) 또는 접시에 형질 도입 (도 1b 및 d) 다음날 좋은 형질 대한 중요한 양이다. 침전 또는 응집의 존재 유무는 형질 전환 시약 중 하나의 누락, pH가 문제 또는 불량 플라스미드 제조에 기...

공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

우리는 폐를 제공하기 위해 마이애미 대학의 생명 얼라이언스 장기 복구 기관 감사합니다. 우리는 또한 우리는 또한 가브리엘 Gaidosh 감사도 2b 및 3-D, C.에도 3a에 실험에 사용되는 mCherry 바이러스 박사 벤 Gerovac 리사 노박에 나타난 실험에 사용되는 DNA의 준비를 위해 박사 리사 Künzi 감사합니다 이미징 시설에서, 마이애미 대학 안과학 교실.

본 연구는 NIH의 CF 재단과 박사 마티아스 Salathe에 승무원 의학 연구소에서 보조금을 후원하고있다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
HEK293T/17 cellsATCCCRL-11268
Fetal bovine serum (FBS) Sigma12306Cuse at 10%
DMEMThermo Scientific11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x)Thermo Scientific15140-122use at 1x
Collagen IBD Biosciences354231dilute 1:75 in distilled water
CalphosClontech631312Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000VWR scientific101108-210stock of 40%
Amphotericin BSigmaA9528use at 1x
TrypsinSigmaT4799
Soybean trypsin inhibitorSigmaT9128
Transwell 12mmCorning3460
Collagen IVSigmaC7521dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromideSigmaH9268stock of 2mg/ml
Puromycin (10.000x)Thermo ScientificA11138-03use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISAPerkinElmerNEK050001KT
F12Thermo Scientific11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-PuroSystem BiosciencesCD532A-2lentiviral expression vector
pMD2-VSVGAddgene12259packaging DNA
pMDLg/pRREAddgene12251packaging DNA
pRSV-revAddgene12253packaging DNA

참고문헌

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