אופטימלית Lentivirus ייצור תרבית תאי תנאים הכרחיים בהצלחת transduce האדם הראשי תאי אפיתל סימפונות

Summary

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Abstract

בתרבות במבחנה של אפיתל הסימפונות אדם מן המעלה הראשונה (HBE) תאים באמצעות תנאים ממשק אוויר נוזלי מספקת מודל שימושי כדי לחקור את התהליכים של התמיינות תאים בדרכי הנשימה ותפקוד. בשנים האחרונות, השימוש וקטורים lentiviral למסירה transgene הפך לנוהל קבוע. אמנם ישנם דיווחים על התמרה של תאי אפיתל דרכי נשימת בדיל באופן מלא עם lentiviruses פסאודו הקלדה מסוים ללא HIV, את יעילות התמרה הכללית היא בדרך כלל פחות מ -15%. הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה אמינה ויעילה לייצר lentiviruses וכדי transduce תאי אפיתל סימפונות אדם מן המעלה ראשונה. שימוש בתאי אפיתל סימפונות מובחנים, התמרו בתקשורת צמיחת אפיתל סימפונות, בעוד התאים לצרף, עם ריבוי של גורם זיהום של 4 מספק יעילות קרובה ל -100%. פרוטוקול זה מתאר, צעד-אחר-צעד, ההכנה וריכוז וקטורי lentiviral גבוהה כיילו ו התהליך התמרת דואר. הוא דן ניסויים אשר קבעו את תנאי התרבות האופטימליים להשגת transductions היעילה ביותר של תאי אפיתל סימפונות אדם מן המעלה הראשון.

Introduction

פיתוח שכפול פגום, lentiviruses Pseudotyped (LV) סיפקה לחוקרים שיטה בטוחה ויעילה כדי לספק transgenes במבחנה ^1. בשל הביטוי שלהם לטווח הארוך, LV אלה יכולים לשמש גם עבור המשלוח ממוקד של תרופות in vivo ^2,3. ההפקה של LV דורשת שיתוף transfection של כליה עוברית אנושית (HEK) תאים עם כמה פלסמידים: העברת וקטור, איסור פרסום אריזה / pol, rev אריזה, ומעטפת גליקופרוטאין וירוס stomatitis שלפוחי (VSV-G) פלסמידים. מערכות אריזת דור שלישי נחשבים בטוחים יותר מאשר מערכות דור השני בגלל גן rev מקודד על פלסמיד אריזה נפרד, ובכך להפחית את האפשרות של רקומבינציה לייצר lentivirus שכפול מוסמכות. בעוד שמערכות אריזת דור השני להניב חמש יחידות תמרה הכולל גבוהות פי, הפיצול של הגנום הויראלי המקורי כדי ליצורמערכת הדור השלישי ירד לרמה של תמרה רק ^3,4 מינימאלית.

בעוד שורות תאים ניתן transduced יותר בקלות וביעילות, חוקרים הסיט את המוקד שלהם תאים ראשוניים, כי אלה הם יותר נציג in vivo רקמות ^5,6. עם זאת, תאים ראשוניים הם עקשנים תמרה. בעוד התמרה של תאים בדרכי הנשימה אפיתל הבדיל באופן מלא דווחו, את היעילות הכוללת כאמור לא עלתה על 15% ^7.

המתואר כאן הוא פרוטוקול המאפשר ייצור של LVS גבוהה כייל. גישה צעד-אחר-צעד המתואר להשיג כמעט 100% יעילות התמרה לתאים HBE העיקרי. באופן ספציפי יותר, הפרוטוקול מתאר את תנאי התרבות האופטימליים אינסטרומנטלי להצליח ^3. בקצרה, תאי 293T HEK הם transfected באמצעות pCDH וקטור ביטוי lentiviral עם ביטוי נהיגת האמרגן EF-1 של פלואורסצנטי ירוק משופר חלבון (eGFP) או mCherry, חלבון פלואורסצנטי אדום, ומערכת אריזה מדור שלישי. LVS מתפזרת התקשורת נאספת 24 עד 72 שעות מאוחר יותר. את חלקיקי הנגיף מרוכזים עם פוליאתילן גליקול (PEG), שיטה נוחה וקלה של ריכוז נגיפי, לפני האמידה כייל באמצעות אנטיגן p24 assay immunosorbent אנזים צמוד ערכה (ELISA). כתוצאה מכך, התאים HBE העיקרי מובחן הם transduced במדיה התפשטות (מדיום הגידול אפיתל הסימפונות או BEGM) ^8, תוך הצמדת (לאחר trypsinized), על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) גורם של 4, הוספת ברומיד hexadimethrine דוגרים במשך 16 שעות ( בין לילה). התאים מותר אז להבדיל. מאז transgene ויראלי מתבטא לטווח ארוך (באמצעות האמרגן המתאים, ראה דיון), הביטוי יישמר לאורך בידול לתוך האפיתל בדרכי הנשימה pseudostratified או יכול להיגרם (באמצעות האמרגן מושרה) לאחר התמיינות.

תחת = "jove_content"> פרוטוקול זה הוא עניין רחב לחוקרים שרוצים להשתמש בתאי HBE עיקריים במקום שורות תאים, והוא עשוי להיות להתאמה קשה אחרים כדי transduce סוגי תאים.

Protocol

1. שלב 1: תרבות של HEK 293T

1. כן תקשורת תאי HEK (המכונה בשם מדיה HEK) על ידי הוספת 10% (V / V) בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין כדי גלוקוז גבוהה הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM).
2. שכבה אחת 10 ס"מ צלחת בתרבית רקמה עם קולגן I. Mix 30 μl של קולגן אני ב 2 מ"ל של מים מזוקקים. מורח את התערובת על צלחת דגירה במשך שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
3. הסר את התערובת ולתת יבש צלחת בארון זרימה למינרית במשך 15 דקות.
4. תאי HEK פלייט על הצלחת המצופית בצפיפות של 1 x 10 ⁶ תאים 10 מיליליטר תקשורת HEK לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
5. כאשר תאי HEK הם 50-60% ומחוברות (איור 1 א, 2-3 ימים לאחר הציפוי), המשך לשלב 2. הערכה חזותית של confluency מספיקה. אין כימות הוא זקוק.
   הערה: תאי HEK בתרבית תקשורת HEK (ראה לעיל). כשהם מגיעים confluency, tהיי ניתן לפצל (למשל 1/5) או קפוא למטה לשימוש מאוחר יותר.

2. שלב 2: הפקה וריכוז של Lentiviruses (LVS) בתאים HEK

הערה: הפרוטוקולים צריכים להיות מוצאים להורג בקנה אחד עם תקנות מוסדיות וממשלתיות תחת BSL-2 + (BSL-2 משופר) תנאים בארצות הברית.

1. Transfect באמצעות הליך משקעים סידן (lipofectamine וסוכני transfection אחרים לא היו יעילים כמו הליך משקעים סידן). שימוש ערכת transfection מסחרית מומלץ להבטיח שחזור, אם כי הנוהל ישונה כדלקמן. תביאו את כל ריאגנטים לטמפרטורת החדר. זהו יום 0.
2. עבור כל צלחת 10 ס"מ של תאים HEK293, לערבב 4.5 מיקרוגרם של המעטפה DNA pMD2-VSVG, 7.5 מיקרוגרם אריזת הדנ"א pMDLg / pRRE, 3.75 מיקרוגרם DNA pRSV-rev, 10 מיקרוגרם DNA של וקטור ביטוי lentiviral, 86 μl של פתרון סידן 2 M מים, סטרילי צינור צנטריפוגות 15 מ"ל לנפח סופי של 700 μl(הפתרונים שני האחרונים הם המסופקים בערכת transfection המסחרית).
3. טיפה חכם, להוסיף 700 μl של תמיסת מלח HEPES שנאגרו 2x (HBS, המסופק בערכה transfection) בעוד vortexing (בקבינט זרימה למינרית) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות (לבצע שלב 4 בזמן ההמתנה).
4. בזמן הדגירה מוקדם, הפקדה 5 μl של תמהיל בשקופית. בדוק את אגל תחת מיקרוסקופ עם מטרה 10X, התמקדות לאט למעלה ולמטה. משקע בסדר צריך להיות גלוי, המאשר את התהליך המשקע סידן פוספט (איור 1b).
5. עצור את המשקעים לאחר 30 דקות על ידי הוספת 10 מיליליטר של תקשורת תאי HEK ו פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב.
6. קח את המנה של תאי HEK משלב 2.1-2.5, ולהסיר מדיום (יום 0). מוסיפים את פתרון המשקע משלב 2.5 בזהירות ובאיטיות לאורך דופן הקערה.
7. למחרת (יום 1), ולהסיר ולסלק המדיום המכיל את המשקע ולהחליף אותו wה- i 10 מ"ל של מדיום HEK. בדקו אם המשקע בסדר מתחת למיקרוסקופ: זה צריך להיות גלוי בצלחת בחללים ריקים שבין התאים (1c הדמוי ד).
8. ביום 2, לאסוף התקשורת עם מזרק, מסנן דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר לתוך שפופרת 15 מ"ל צנטריפוגות המכיל 3.8 מ"ל של פוליאתילן גליקול 40% פתרון (PEG). הפוך 5x לערבב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות (עבור PEG לזרז להיוצר, אך לא יותר מ 5 ימים) עד שכל אוספי הווירוס הושלם.
9. חזור על שלב 2.8 בימים 3 ו -4 ביום 4 לא להחליף עם המדיום HEK אבל לטהר עם אקונומיקה 10% וזורקים את המנה.
10. צנטריפוגה כל צינורות האיסוף (בדרך כלל כל האוספים יחד ביום 5) ב 1,650 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C עד גלולת הווירוס. הסר וזורקים supernatant, ספין שוב ב 1,650 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף ולהסיר כל הנותרים של supernatant PEG.
11. Resuspend גלולה של כל צינור 200 μl של מדיום הגידול אפיתל הסימפונות (BEGM) ללא amphotericin B ^8. פינה אותם יחד aliquot ב 200 μl. וירוס חנות ב -80 מעלות צלזיוס. Aliquot עוד 10 μl נוספים לבצע את assay ELISA HIV-1 Gag (p24) אנטיגן.
12. באמצעות ערכת ELISA מסחרית, לבצע assay אנטיגן p24 על פי הפרוטוקול של היצרן. את assay נותן אומדן של p24 ויראלי pg / ml.

3. שלב 3: תאי HBE הראשי התרבות

1. פלייט תאים HBE ב 10 מ"ל התקשורת BEGM (עם 100 amphotericin B μl אם תאים 0 מעבר משמשים כדי למנוע זיהום פטרייתי אפשרי) בצפיפות של 1 x 10 ⁶ תאים קולגן אני מצופה 10 ס"מ בתרבית רקמה צלחת. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
2. ביום הבא, להסיר את המדיום ולהחליף עם 10 מ"ל BEGM (עם 100 B amphotericin μl למעבר 0 תאים) עבור סכום כולל של 4 ימים. חזור אל חממה.
3. אחרי 4 דays, להשתמש רק BEGM ללא amphotericin .ב שינוי התקשורת בכל יום אחר.
4. כאשר תאים הם 80-90% ומחוברות (איור 2 א; ~ 7 ימים לאחר הציפוי), להמשיך עם תמרה (לשים לב 3.5 הכנה ממושכת לפני התמרה). שוב, הערכה חזותית של confluency מספיקה. אין כימות הוא זקוק.
5. לפני התמרה, מעיל מוסיף תמיכה חדיר עם פתרון קולגן IV בדילול 1/10 עם מים מזוקקים סטריליים. הוסף 200 μl לכל כנס ולתת לילה יבש בקבינט הזרימה למינרית.

4. שלב 4: התמרה של תאים HBE

1. הסר מדיה, להוסיף 3 מ"ל של טריפסין 0.1% בחומצה 1 מ"מ ethylenediaminetetraacetic ב בופר פוספט (EDTA / PBS) דגירה 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. בדוק מתחת למיקרוסקופ (אובייקטיבי 10X) כדי לראות אם כל התאים מנותקים. אם לא, לחזור אל האינקובטור עבור 5 דקות נוספות.
2. כאשר כל התאים מנותקים, להוסיף 3מ"ל של מעכבי סויה טריפסין (SBTI 1 מ"ג / מ"ל), לערבב ולהעביר צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. גלולה התאים על ידי ספינינג ב 460 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הסר supernatant ו resuspend גלולה לתוך 3 מ"ל של BEGM והמשך עם היד נטויה.
4. תאי Resuspend HBE (כיום מעבר 1 או P1) ביחס של 2 x 10 ⁵ תאים לכל כנס תמיכה חדיר אחד 12 מ"מ 400 μl של BEGM (ראה טבלה 2). לחיץ מספרים אלה בהתבסס על הכמות מוסיפה תמיכה חדירה כי יהיה transduced.

משטח	שטח פנים	תא ספירה	כְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת	נפח (מדיה)
10 ס"מ צלחת	52.7 ס"מ 2	1 x 10 6	BEGM	10 מ"ל
12 מ"מ מסנן	1.13 ס"מ 2	2 x 10 5	BEGM	400 μl
24 מ"מ מסנן	4.52 ס"מ 2	8 x 10 5	BEGM	800 μl

טבלה 2: אקסטרפולציה מדיה לכל ספירת תאים.

5. באמצעות ריבוי של זיהום (משרד הפנים) גורם של 4, להוסיף נפח מתאים של הנגיף על השעיית התא.
6. להוסיף ברומיד hexadimethrine לריכוז סופי 2 מיקרוגרם / מ"ל.
7. לוותר 400 μl של תמהיל (BEGM, תאים HBE, וירוס ברומיד hexadimethrine) לכל הכנס תמיכה חדיר לתוך תא הפסגה, ולהוסיף 1 מ"ל של BEGM לבד לתא basolateral. דגירה לילה בשעה 37 ° C ותאי HBE צלחת 5% CO _2. תמיד בלי וירוס כפי מלאה מבחר המבחן puromycin אם זה אפשרי.
8. ביום, rem הבאמדיה הפסגה ו basolateral אובה, לשטוף עם PBS, ולהחליף את שני תאים עם התקשורת ממשק אוויר נוזלי (עלי) ^8.
9. כאשר תאים ומחוברים, להסיר נוזל פסגה (המכונה יצירת ממשק אוויר נוזלי). המשך שינוי המדיום (ALI) בתא התחתון פעם ביומיים עד שהם מגיעים לבגרות מלאה; בדרך כלל 3 עד 4 שבועות לאחר מכן.
   הערה: אם וקטור lentiviral מכיל גן הבחירה כגון puromycin, תאים ניתן לבחור על ידי הוספת puromycin פי עקומת ריכוז הבחירה. עבור תאים HBE, מדובר בריכוז מ"ל 1 מיקרוגרם / נקבע להיות אידיאלי עבור בחירה עקבית של תאים transduced. עם זאת, ריכוז זה עשוי להיות שונה עבור תאים אחרים או תנאים צריכים להיקבע על ידי הריגת עקומות. הוספת puromycin יכולה להתחיל מוקדם ככל שיום אחד לאחר שהתקשורת הוחלפה תקשורת ALI או במאוחר (2-3 ימים), כדי לאפשר את הביטוי המלא של גן הבחירה. הקפד להוסיף puromycin כדי להוסיף אחד כי hכפי שלא היה transduced. Puromycin ניתן להוסיף עד שהתאים הם מובחנים באופן מלא.

תוצאות

איור 1 מתאר שלבים עיקריים שונים של הערכת תאים ופתרונות במהלך תהליך transfection. איור 1 א מציג את confluency האופטימלי של תאי HEK293T לפני transfection לייצור וירוס. חשוב כי התאים מופצים באופן שווה על פני הצלחת. איור 1b חושף את המשקע בטיפה את תער...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מבטיח קרוב יעילות התמר 100%. עם זאת, ישנם צעדים בתהליך שחשובים להשיג מטרה זו. למשל, במהלך תהליך transfection, הנוכחות של משקעים בתמהיל התמרה (ירידה) או בצלחת מחרתיים התמרה (1b הדמוי ד) שהן גם רלוונטיות עבור transfection טוב. היעדרה של משקע או בנו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	12306C	use at 10%
DMEM	Thermo Scientific	11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x)	Thermo Scientific	15140-122	use at 1x
Collagen I	BD Biosciences	354231	dilute 1:75 in distilled water
Calphos	Clontech	631312	Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000	VWR scientific	101108-210	stock of 40%
Amphotericin B	Sigma	A9528	use at 1x
Trypsin	Sigma	T4799
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9128
Transwell 12 mm	Corning	3460
Collagen IV	Sigma	C7521	dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide	Sigma	H9268	stock of 2 mg/ml
Puromycin (10.000x)	Thermo Scientific	A11138-03	use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA	PerkinElmer	NEK050001KT
F12	Thermo Scientific	11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro	System Biosciences	CD532A-2	lentiviral expression vector
pMD2-VSVG	Addgene	12259	packaging DNA
pMDLg/pRRE	Addgene	12251	packaging DNA
pRSV-rev	Addgene	12253	packaging DNA