La Técnica del riñón perfundido aislado del ratón

Resumen

El aislado de riñón perfundido ratón (MIPK) es una técnica para mantener un riñón de ratón bajo condiciones ex vivo perfundidos y funcionales para 1 hr. Los tampones y técnica quirúrgica se describen en detalle.

Resumen

El aislado de riñón perfundido ratón (MIPK) es una técnica para mantener un riñón de ratón bajo condiciones ex vivo perfundidos y funcionales para 1 hr. Este es un requisito previo para el estudio de la fisiología del órgano aislado y para muchas aplicaciones innovadoras que pueden ser posibles en el futuro, incluyendo descelularización la perfusión de bioingeniería renal o la administración de anti-rechazo o drogas genoma de edición en altas dosis para cebar el riñón para el trasplante. Durante el tiempo de la perfusión, el riñón puede ser manipulado, la función renal puede ser evaluada, y diversos productos farmacéuticos administrado. Después del procedimiento, el riñón puede ser trasplantado o tratados con la biología molecular, análisis bioquímicos, o microscopía.

Este artículo describe el líquido de perfusión y la técnica quirúrgica necesaria para la perfusión ex vivo de los riñones de ratones. Los detalles del aparato de perfusión y se dan los datos se presentan mostrando la vESPONSABILIDAD de la preparación del riñón: el flujo sanguíneo renal, la resistencia vascular, y de orina de datos como, micrografías electrónicas de transmisión funcionales de los diferentes segmentos de la nefrona como lecturas morfológicas, y transferencias Western de las proteínas de transporte de los diferentes segmentos de la nefrona como lectura molecular.

Introducción

La perfusión aislada de órganos ha sido objeto de un esfuerzo continuo entre los fisiólogos durante muchas décadas ^1. La técnica permite la función del órgano, sin influencias sistémicas como la hipertensión arterial, las hormonas, o los nervios, para ser estudiado. Carl Eduard Loebell se considera que es el primero que ha descrito la perfusión con éxito de un riñón aislado, en 1849 ^2. Desde entonces, el aparato de perfusión ha sufrido refinamiento significativo. Frey y Gruber introdujeron un pulmón artificial para las bombas de oxigenación y perfusión continua para pulsátiles ^2. Mientras que los primeros investigadores estudiaron principalmente los riñones de los mamíferos grandes, a saber, cerdos y perros ^{2 3} -el primer informe del uso de riñones de rata, por Weiss et al. , Fue un hito en el estudio de la perfusión de los órganos mamífero pequeño ^4. Schurek et al. informaron la necesidad de la adición de eritrocitos de mamíferos al perfundido si tubular renal suficienteoxigenación debía lograrse ^5. Crítico para experimentos a largo plazo fue la introducción de la diálisis continua de la memoria intermedia por el mismo grupo de investigación ^6. En 2003, Schweda et al. fueron los primeros en informar de un riñón aislado perfundido funcional del ratón (MIPK) ^7, posteriormente refinado por Rahgozar et al. ¹⁸ y Lindell et al. ^14.

Aunque técnicamente más difícil que la rata aislado y perfundido de riñón, el uso de la MIPK lleva la ventaja de permitir el uso de una amplia gama de ratones genéticamente alterados. Este artículo presenta los detalles del método de los autores de la perfusión de los riñones de ratones aislados durante 1 hora. El método permite la evaluación continua de la tasa de flujo renal, la resistencia vascular, la liberación de hormonas, el análisis de gases en sangre, análisis de orina, y la aplicación de fármacos. Después del procedimiento, los riñones podrían ser procesados ​​para el análisis molecular y bioquímica, se fijarán para microscopía, otrasplantado en un ratón receptor (Figura 1).

Figura 1: Visión general de la posible entrada / salida para el riñón aislado y perfundido. BGA: análisis de gases en sangre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Esta técnica es probable que reciba una atención creciente en los próximos años, ya que muchas aplicaciones innovadoras se están discutiendo con el amanecer de la perfusión renal normothermic prolongado antes del trasplante (con o sin la aplicación de anti-rechazo o drogas genoma de edición) ^{8, 9, 10 , 11,} la bioingeniería de los riñones enteros de andamios descelularizados ^12, y la aplicación de altas dosis de tintes fluorescentes para la imagen multifotónica ¹³ . También es un modelo ideal con el que estudiar el papel de los genes específicos durante la lesión renal aguda ^14.

Un protocolo paso a paso se da para permitir que otros laboratorios para realizar la perfusión aislada de riñón de ratón con éxito. En primer lugar, se especifica la composición y preparación de la memoria intermedia. A continuación, la cirugía se describe en detalle y se muestran los pasos críticos. En tercer lugar, se presentan los datos que son representativos de una preparación exitosa: el flujo sanguíneo renal, la resistencia vascular, la tasa de filtración glomerular, y el electrolito fraccionada mediciones funcionales de micrografías de viabilidad y electrónicas de transmisión de la morfología de los diferentes segmentos de la nefrona de los riñones perfundidos todos excreción- fijo después de 1 hora de perfusión.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con la legislación suiza y aprobados por la administración veterinaria del Cantón de Zurich, Suiza.

1. tampón de preparación de

1. Preparar soluciones de 1 - 4 y la solución de la hormona antidiurética (ADH) (Tabla 1).
2. Preparar el tampón de diálisis (Tabla 1).
   NOTA: Este es el tampón utilizado como el tampón de diálisis durante la perfusión. Más tarde, los eritrocitos se diluyeron en este tampón para formar el líquido de perfusión final.
3. preparado de eritrocitos.
   1. Diluir 250 ml de concentrado de eritrocitos humanos (material ensayado obtenida del banco de sangre local) a 500 ml con tampón de diálisis. Se centrifuga a 2.000 g durante 8 min. Eliminar el tampón, teniendo cuidado de no eliminar los eritrocitos. Se repite 3 veces.
4. Preparar el (albúmina de suero bovino; BSA) de albúmina de buffer.
   1. En 200 ml de dialysitampón s, se disuelven 44 g de BSA utilizando una barra de agitación. Se filtra la solución con papel de filtro.
5. Preparar el líquido de perfusión.
   1. Filtrar los eritrocitos de la etapa 1.3.1 a través de papel de filtro en el tampón de BSA. Llenar hasta un volumen total de 800 ml con tampón de diálisis.
      NOTA: Este es el líquido de perfusión final. El hematocrito ahora debe estar entre 8 y 12%. El líquido de perfusión se puede almacenar durante un máximo de 12 horas a 4 ° C.

2. Inicio de la diálisis y Oxigenación

1. Encienda el baño de agua que rodea el depósito más grande de amortiguación, depósito de regulación más pequeña, y la cámara húmeda (una pequeña cámara, de doble pared llevó a 37 ° C y 100% de humedad para sostener más tarde el riñón) a 37 ° C (Figura 2) .
2. Llenar el depósito de regulación más grande con el tampón de diálisis y el depósito más pequeña con el perfundido.
3. Encienda el 5% de CO ₂ O de entrada de gas _2/95% a tampón de diálisis.
4. Cambie en diálisis continua del líquido de perfusión frente al tampón de diálisis. Tenga cuidado de usar un tubo de diálisis de bajo flujo. Continúe con el Paso 3.

Figura 2: Dibujo esquemático del circuito de perfusión. Esquema muestra los componentes principales del circuito de perfusión y la dirección del flujo de tampón. Todos los componentes rodeadas de azul oscuro se mantienen a 37 ° C con un baño de agua / termostato. 1: Diálisis tampón de por lo menos 3 veces el volumen del tampón de perfusión se burbujea continuamente con 95% _O2 / 5% de CO _2. 2: Diálisis tampón y tampón de perfusión se dializan de forma continua entre sí en un tubo de diálisis por una bomba de rodillos. 3: througho constante Debido a esta diálisis, el tampón de perfusión se enriquece con 9% _{de O2} / 5% de CO ₂ y electrolitos niveles se mantienenperfusión ut. 4: una bomba de rodillos propulsa el tampón de perfusión hacia el riñón. 5: Un receptor de aire elimina ondas peristálticas y actúa como una trampa de burbujas. 6: El transductor de presión (conectado a 4. (bomba de rodillos) para mantener una presión continua al tiempo que permite el flujo libre alterna). 7: A lo largo de la perfusión, el riñón se mantiene en una cámara húmeda para la humedad del aire 100% y 37 ° C de temperatura de riñón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Procedimiento quirúrgico Parte 1 (para un diagrama de todas las ligaduras, véase la Figura 3)

Nota: Realizar todas las ligaduras utilizando 5-0 hilo quirúrgico.

1. Anestesiar un ratón mediante inyección intraperitoneal (10 l / g de peso corporal, 20 mg / ml de ketamina y 1 mg / ml de xilazina disuelto en 0,9% NaCl). Confirmar suficiente profundidad de anesthEIAS ensayando la ausencia de reflejos del pie trasero.
2. Fijar el ratón en una posición supina en la cámara húmeda. Proteger los ojos con ungüento veterinario. Colocar una jeringa de 1 ml por debajo de la columna vertebral para elevar los vasos lumbares.
3. Realizar una laparotomía media de la cresta del pubis a la apertura del esternón primero la piel, los músculos abdominales, con unas tijeras.
4. Retire el intestino y lo coloca en el lado izquierdo del ratón lateral del abdomen.
5. Liberar la vejiga a partir de tejido conjuntivo y explorar ambos uréteres y la uretra.
6. Colocar una ligadura alrededor del uréter izquierdo (I ligadura). Cierralo.
7. Colocar una ligadura alrededor de la uretra (ligadura II). Cierralo.
8. Colocar una ligadura "lazo" alrededor de toda la vejiga (ligadura III).
9. Incisión en la vejiga 1 mm.
10. Canular la abertura con 2 cm PE 50 tubos.
11. Cerrar ligadura III alrededor de la tubería.
12. Cortar el uréter izquierdo y la uretra distal de las ligaduras. el bladder está ahora unido al uréter derecho solamente y se mueve libremente.
13. Desactive la aorta abdominal de tejido conectivo y grasa.
14. Colocar una ligadura mediados de aorta abdominal (IV ligadura).
15. Colocar una ligadura alrededor de la aorta por debajo del diafragma entre la arteria mesentérica superior y el tronco celíaco (V ligadura).
16. Colocar una ligadura alrededor de la arteria mesentérica superior (VI ligadura).
17. Colocar una ligadura aórtica directamente debajo de la derecha y por encima de la arteria renal izquierda (VII ligadura).
18. Colocar una ligadura alrededor de la vena caudal del paquete (cava) (VIII ligadura). Vaya al paso 4.

Figura 3: Representación esquemática de las ligaduras colocadas durante la cirugía. Vista del abdomen abierto después de la laparotomía. El intestino se mueve hacia la izquierda. L y R indican el riñón izquierdo y derecho. lalíneas negras muestran el área de la respectiva ligadura. Las ligaduras se colocan primero y luego cerrados, según el orden indicado en el texto. X marca la ubicación de la incisión para la canulación de la aorta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. El cebado del circuito de perfusión

1. Arrancar la bomba rotativa y llenar el tubo con líquido de perfusión. Tenga cuidado de vaciar todas las burbujas de aire.
2. Complete el dispositivo receptor de aire a aproximadamente a mitad de la altura de líquido de perfusión.
3. Calibrar el transductor de presión a 0 mm Hg cuando todos los tubos se llena y el flujo es 0. Mantenga la aguja de perfusión a nivel del riñón durante este tiempo.
4. Mantener el caudal a un nivel mínimo constante (0,6 ml / min) y vaya al paso 5.

5. Procedimiento quirúrgico Parte 2

1. Colocar una pinza de ligadura entre el IV y la ramificación de la izquierda renal arteria.
2. Hacer una pequeña incisión en la aorta caudal de ligadura IV, teniendo cuidado de no cortar la pared dorsal.
3. Dilatar la abertura en la aorta con un dilatador de vasos.
4. Canular la aorta con una aguja (2 cm de largo, tirado PE 50), empujando la punta justo a la abrazadera.
5. Abra la pinza.
6. Empuje la punta de la aguja cranealmente hasta que llega a la unión de la arteria renal derecha y la aorta.
7. Cerrar ligadura VII.
8. Cerrar ligadura IV.
9. Abre el cofre con las tijeras de disección por el diafragma. Con un solo corte, separar la aorta, vena cava, el corazón y los nervios vegetativos. Con este paso, el animal se sacrificó mediante exanguinación rápida bajo anestesia profunda continua.
10. Comience control de la presión de la bomba de perfusión. Mantener la presión media de entre 80 y 100 mmHg.
11. Cerrar V. ligadura
12. Cerrar ligadura VI.
13. Cerrar ligadura VIII.
14. Libre el riñón derecho de tissu conjuntivoE y su incorporación en la cápsula adiposa con unas tijeras.
15. Cortar la aorta proximal a la ligadura V.
16. Cortar la arteria mesentérica superior distal a la ligadura VI.
17. Cortar el paquete recipiente de riñón de apoyo a cabo, teniendo cuidado de no cortar en los propios vasos.
18. Cortar el hígado en la conexión con el riñón. Tener cuidado para liberar el riñón, pero dejar una pequeña parte de la adherente hígado a ella, de modo que la vena cava se mantiene abierta por el mismo.
19. Tome el paquete de riñón de ratón. Retire el ratón desde la cámara húmeda.
20. Colocar una ligadura "lazo" alrededor de la conexión del hígado y el riñón (IX ligadura).
21. Canular la vena cava con una línea venosa (2 cm PE 50).
22. Cerrar ligadura IX. La salida venosa a través de la línea venosa debe comenzar inmediatamente.
23. Cierre la cámara húmeda.

6. Los análisis intermedios

1. Durante la siguiente hora, supervisar continuamente el flujo sanguíneo y intravasculla presión ar ^15. Recoger el flujo venoso, que se puede utilizar para el análisis de, por ejemplo, la liberación de renina renal ^7. Recoger la orina para el análisis de la concentración de electrolitos y el filtrado glomerular ^14. Después de 1 hora de perfusión, los riñones pueden ser congeladas instantáneamente por el Western Blot o fijarse para obtener imágenes de los enfoques ^16.

Resultados

Con el método descrito, aislados riñones de ratón pueden permanecer viables durante al menos 1 hr. Hemos probado la viabilidad del tejido después de 1 hora de perfusión continua con el funcional (flujo sanguíneo renal y la resistencia vascular, el análisis de gases en sangre del flujo venoso, la tasa de filtración glomerular, urinaria fraccional ^de Na ⁺ y K ⁺ excreción, y la osmolaridad urinaria) y morfológica (electrónica de transmisión micro...

Discusión

El ratón aislados del riñón perfundido es una herramienta para el estudio de la función renal en un ambiente controlado ex vivo durante 1 hora, reduciendo la brecha entre los experimentos in vivo en animales intactos, lo que puede ser defectuoso por el impacto de numerosos factores sistémicos, y los experimentos in vitro en segmentos de la nefrona aisladas o células cultivadas, lo que necesariamente descuidar el impacto de la estructura de los órganos intactos en la función. H...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2901
Cannular with basket and side port	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2947
Thermostat TC120-ST5	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1 L	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3436
Pressure Transducer APT300	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3862
TAM-D Plugsys Transducer	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-1793
SCP Plugsys servo controller	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2806
Windkessel	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3717
HSE-USB data acquisition	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone	B.Braun	7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D.	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/8
Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10%	B.Braun	134518064
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	M1125-25G
Sodium-L-Lactate	Sigma-Aldrich	L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt	Sigma-Aldrich	K1875-25G
NaCl	Sigma-Aldrich	31434-1KG-R
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761-5KG
KCl	Sigma-Aldrich	60130-1KG
Urea	Sigma-Aldrich	U5378-500G
Creatinine	Sigma-Aldrich	C4255-10G
Ampicillin	Roche	10835242001
MgCl2 * 6H2O	Sigma-Aldrich	M2393-500G
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
CaCl2 * 6H2O	Riedel-de-Haën	12074
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638-500G
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP	Sigma-Aldrich	V2013-1MG
FITC-Inulin	Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration	Macherey-Nagel	MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex	Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM	FEI