Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

Zusammenfassung

Die Maus isoliert perfundierten Nieren (MIPK) ist eine Technik zum Halten einer Mausniere unter ex vivo - Bedingungen durchbluteten und funktionell für 1 Std. Die Puffer und die chirurgische Technik werden ausführlich beschrieben.

Zusammenfassung

Die Maus isoliert perfundierten Nieren (MIPK) ist eine Technik zum Halten einer Mausniere unter ex vivo - Bedingungen durchbluteten und funktionell für 1 Std. Dies ist eine Voraussetzung für die Physiologie des isolierten Organs zu studieren und für viele innovative Anwendungen, die in der Zukunft möglich sein, einschließlich Perfusion Dezellularisierung für Nieren Biotechnik oder die Verabreichung von anti-Ablehnung oder Genom-Bearbeitung Medikamente in hohen Dosen zu grundieren der Niere für die Transplantation. Während der Zeit der Perfusion kann die Niere manipuliert werden, kann die Nierenfunktion bewertet werden, und verschiedene Arzneimittel verabreicht. Nach dem Verfahren kann die Niere für die Molekularbiologie, biochemische Analyse oder Mikroskopie transplantierten oder verarbeitet werden.

Dieses Papier beschreibt die Perfusat und die chirurgische Technik für die ex vivo Perfusion von Mausnieren benötigt. Einzelheiten der Perfusionsgerät gegeben und Daten vorgestellt, die v zeigtAFTUNG der Zubereitung der Niere: Nierendurchblutung, Gefäßwiderstand und Urin Daten als funktionelle, Transmissionselektronenmikrographien verschiedener nephron Segmente als morphologische Ablesungen und Western-Blots von Transportproteinen verschiedener nephron Segmente als molekulare Anzeige.

Einleitung

Die isolierte Perfusion von Organen hat unter Physiologen seit vielen Jahrzehnten ^ein Gegenstand einer laufenden Bemühungen gewesen. Die Technik ermöglicht es, die Funktion des Organs, ohne systemische Einflüsse wie Blutdruck, Hormone oder Nerven, untersucht werden. Carl Eduard Loebell gilt als der erste sein , um die erfolgreiche Perfusion eines isolierten Niere beschrieben haben, im Jahr 1849 ^2. Seitdem hat sich die Perfusionsgerät erhebliche Verfeinerung erfahren. Frey und Gruber führte eine künstliche Lunge für die Sauerstoffversorgung und pulsatile Pumpen für kontinuierliche Perfusion ^2. Während frühe Forscher vor allem die Nieren von großen Säugetieren nämlich sucht, Schweine und Hunde ^{2 3} -der erste Bericht über die Verwendung von Rattennieren, die von Weiss et al. , War in der Studie der kleinen Säuger-Organperfusion ⁴ ein Meilenstein. Schurek et al. die Notwendigkeit der Zugabe von Säugetieren Erythrozyten zu dem Perfusat, wenn eine ausreichende renale tubuläre berichtetOxygenierung wurde auf ⁵ erreicht werden. Kritisch für Langzeitversuchen war die Einführung der kontinuierlichen Dialyse des Puffers von der gleichen Arbeitsgruppe ^6. Im Jahr 2003 Schweda et al. waren die ersten , eine funktionelle Maus isoliert perfundierten Niere (MIPK) ^7, verfeinert später von Rahgozar et al berichten. ¹⁸ und Lindell et al. ^14.

Während technisch schwieriger als die Ratte perfundierten Nieren isoliert, trägt die Verwendung des MIPK den Vorteil, die Verwendung einer Vielzahl von genetisch veränderten Mäusen ermöglichen. Dieses Papier stellt die Einzelheiten des Verfahrens der Autoren für die Perfusion von isolierten Maus-Nieren für 1 Stunde. Das Verfahren ermöglicht die kontinuierliche Messung der Nierendurchflussrate, Gefäßwiderstand, Hormonfreisetzung, Blutgasanalyse, Urinanalyse und die Anwendung von Medikamenten. Nach dem Verfahren könnte Nieren für molekulare und biochemische Analyse verarbeitet werden, für die Mikroskopie festgelegt werden, odertransplantierten in eine Empfängermaus (Abbildung 1).

Abbildung 1: Übersicht über die möglichen Input / Output an den isolierten perfundierten Nieren. BGA: Blutgasanalyse. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diese Technik wird wahrscheinlich erhalten Aufmerksamkeit in den kommenden Jahren zu erhöhen, da viele innovative Anwendungen sind mit dem Beginn der verlängerten normothermic Nierenperfusion vor der Transplantation diskutiert (mit oder ohne die Anwendung von Anti-Ablehnung oder Genom-Bearbeitung Drogen) ^{8, 9, 10 , 11,} die Bioengineering von ganzen Nieren von dezellularisierten Gerüste ¹² und die Anwendung von hohen Dosen von fluoreszierenden Farbstoffen für Mehrphotonenabbildungs ¹³ . Es ist auch ein ideales Modell , mit dem ¹⁴ die Rolle spezifischer Gene während der akuten Nierenschädigung zu untersuchen.

Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll gegeben anderen Labors zu ermöglichen isolierten Maus Nierenperfusion erfolgreich durchzuführen. Zuerst wird die Zusammensetzung und die Herstellung des Puffers spezifiziert. Dann wird die Operation im Detail beschrieben und die kritischen Schritte gezeigt. Drittens werden Daten vorgestellt, die repräsentativ für eine erfolgreiche Vorbereitung: Nierendurchblutung, Gefäßwiderstand, glomeruläre Filtrationsrate und fraktionierte Elektrolytausscheidung-alle als funktionelle Messungen der Lebensfähigkeit-und transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen der Morphologie verschiedener nephron Segmente perfundiert Nieren nach 1 Stunde der Perfusion fixiert.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren in diesem Manuskript beschrieben, wurden auf Schweizer Recht durchgeführt nach und von der Veterinärverwaltung des Kantons Zürich, Schweiz genehmigt.

1. Puffer Vorbereitung

1. Herstellung von Lösungen von 1 bis 4 und der ADH (ADH) -Lösung (Tabelle 1).
2. Bereiten Sie die Dialysepuffer (Tabelle 1).
   Hinweis: Dies ist der Puffer als Dialysepuffer während der Perfusion verwendet. Später werden die Erythrozyten in diesem Puffer verdünnt, um die endgültige Perfusat zu bilden.
3. Erythrozyt Vorbereitung.
   1. Verdünnte 250 ml menschlicher Erythrozyten-Konzentrat (geprüfte Material aus der lokalen Blutbank erhalten wird) auf 500 ml mit Dialysepuffer. Zentrifuge bei 2000 × g für 8 min. Entfernen Sie den Puffer, wobei keine Erythrozyten zu entfernen. 3x wiederholen.
4. Bereiten Sie das Albumin (Rinderserumalbumin, BSA) Puffer.
   1. In 200 ml dialysis Puffer, lösen sich 44 g BSA einen Rührstab verwenden. Filtern Sie die Lösung mit Filterpapier.
5. Bereiten Sie die Perfusat.
   1. Filtern Sie die Erythrozyten aus Schritt 1.3.1 durch Filterpapier in den BSA-Puffer. Füllen Sie auf ein Gesamtvolumen von 800 ml mit Dialysepuffer auf.
      HINWEIS: Dies ist die letzte Perfusat. Der Hämatokrit sollten nun zwischen 8 und 12% liegen. Das Perfusat kann bei 4 ° C bis zu 12 Stunden gelagert werden.

2. Initiieren Dialyse und Oxygenation

1. Schalten Sie das Wasserbad rund um den größeren Pufferbehälter, kleiner Pufferspeicher, und die feuchte Kammer (eine kleine, doppelwandige Kammer gebracht auf 37 ° C und 100% Luftfeuchtigkeit später die Nieren halten) bis 37 ° C (Abbildung 2) .
2. Füllen Sie den größeren Pufferspeicher mit dem Dialysepuffer und den kleineren Behälter mit dem Perfusat.
3. Schalten Sie die 5% CO _2/95% O ₂ Gaszufluss zu dem Dialysepuffer.
4. Schalten Sie kontinuierliche Dialyse des Perfusat gegen den Dialysepuffer. Achten Sie darauf, Low-Flux-Dialyseschlauch zu verwenden. Gehen Sie zu Schritt 3.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des Perfusionskreislaufes. Schema zeigt die Hauptkomponenten des Perfusionskreislaufs und die Richtung des Pufferflusses. Alle Komponenten von dunkelblau umgeben sind bei 37 ° C mit einem Wasserbad / Thermostat gehalten. 1: Dialysepuffer von mindestens 3 - fache des Volumens des Puffers Perfusion mit 95% O _2/5% CO ₂ kontinuierlich geperlt. 2: Dialysepuffer und Perfusionspuffer werden gegeneinander in einen Dialyseschlauch mit einer Rollenpumpe kontinuierlich dialysiert. 3: Durch diese Dialyse, die Perfusionspuffer mit 9% O _2/5% CO ₂ und der Elektrolytspiegel konstant gehalten werden througho angereichertut Perfusion. 4: Eine Rollenpumpe treibt den Perfusionspuffer in Richtung auf die Niere. 5: Ein Windkessel entfernt peristaltischen Wellen und wirkt als Blasenfalle. 6: Druckwandler (verbunden mit 4. (Rollenpumpe) Dauerdruck zu halten , während frei abwechselnd Strömung erlaubt). 7: Während der Perfusion, bleibt die Niere in einer feuchten Kammer für 100% Luftfeuchtigkeit und 37 ° C Nierentemperatur. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Chirurgische Verfahren Teil 1 (für ein Diagramm aller Ligaturen, siehe Abbildung 3)

Hinweis: Führen Sie alle Ligatur mit 5-0 chirurgischen Faden.

1. Anästhesieren einer Maus durch intraperitoneale Injektion (10 ul / g Körpergewicht, 20 mg / ml Ketamin und 1 mg / ml Xylazin in 0,9% NaCl gelöst). Bestätigen Sie eine ausreichende Tiefe von AnesthESIA durch die Prüfung für das Fehlen von hinteren Fuß Reflexe.
2. Befestigen Sie die Maus in Rückenlage in der feuchten Kammer. Schützen Sie die Augen mit vet Salbe. Legen Sie eine 1-ml-Spritze unterhalb der Wirbelsäule, die Lendengefäße zu erhöhen.
3. Führen Sie eine mittlere Laparotomie vom Schamkamm bis zum Brustbein Öffnung zuerst die Haut, dann die Bauchmuskeln, mit einer Schere.
4. Entfernen Sie den Darm und legen Sie sie auf der linken Seite der Maus seitlich aus dem Bauch.
5. Befreien Sie die Blase aus Bindegewebe und erforschen beide Harnleiter und die Harnröhre.
6. Legen Sie eine Ligatur um die linke Harnleiter (Ligatur I). Schließen Sie es.
7. Legen Sie eine Ligatur um die Harnröhre (Ligatur II). Schließen Sie es.
8. Setzen Sie ein "Lasso" Ligatur um die ganze Blase (Ligatur III).
9. Inzision der Blase 1 mm.
10. Kanülieren die Öffnung mit 2 cm PE 50 Schläuchen.
11. Schließen Ligatur III um das Rohr.
12. Schneiden Sie die linke Harnleiter und Harnröhre entfernt von der Ligatur. Die bladder wird jetzt nur auf der rechten Seite Harnleiter befestigt und frei bewegen.
13. Deaktivieren Sie die Bauchaorta von Bindegewebe und Fett.
14. Legen Sie eine Bauch Mitte Aorta Ligatur (Ligatur IV).
15. Legen Sie eine Ligatur um die Aorta unterhalb der Membran zwischen der A. mesenterica superior und der Zöliakie-Stamm (Ligatur V).
16. Legen Sie eine Ligatur um die A. mesenterica superior (Ligatur VI).
17. Legen Sie eine Aorten-Ligatur direkt unter dem rechten und über dem linken Nierenarterie (Ligatur VII).
18. Legen Sie eine Ligatur um die Schwanzvene Paket (Cava) (Ligatur VIII). Gehen Sie zu Schritt 4.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Ligatures während der Operation gegeben. Mit Blick auf das offene Bauch nach der Laparotomie. Der Darm wird nach links ausgezogen. L und R zeigen die linke und die rechte Niere. Dasschwarze Linien zeigen den Bereich der jeweiligen Ligatur. Ligatures werden immer zuerst gesetzt und dann geschlossen, in der im Text angegebenen Reihenfolge. X markiert die Lage des Einschnitts für Aorta Kanülierung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Priming des Perfusionskreislaufes

1. Starten Sie die Kreiselpumpe und füllen Sie den Schlauch mit Perfusat. Achten Sie darauf, alle Luftblasen aus sie zu leeren.
2. Füllen Sie das Windkessel Gerät etwa der mittleren Ebene mit Perfusat.
3. Kalibrieren Sie den Druckwandler auf 0 mm Hg, wenn alle Rohre gefüllt und Strömung ist 0. während dieser Zeit die Perfusion Nadel bei Nieren Niveau zu halten.
4. Halten Sie Fluss auf einem konstanten minimalen Niveau (0,6 ml / min) und gehen Sie zu Schritt 5.

5. Chirurgisches Verfahren Teil 2

1. Legen Sie eine Klammer zwischen Ligatur IV und der Verzweigung des linken renal Arterie.
2. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Aorta Schwanz- der Ligatur IV, dabei nicht die Rückwand zu schneiden.
3. Dilatieren die Öffnung in der Aorta mit einem Gefäß Dilatator.
4. nur an der Klemme kanülieren die Aorta mit einer Nadel (2 cm lang, zog 50 PE), die Spitze schieben.
5. Öffnen Sie die Klemme.
6. Schieben Sie die Spitze der Nadel kranial, bis sie die Kreuzung der rechten Nierenarterie und der Aorta erreicht.
7. Schließen Ligatur VII.
8. Schließen Ligatur IV.
9. Öffnen Sie die Brust mit einer Schere durch die Membran zu sezieren. Mit einem einzigen Schnitt, trennen Sie die Aorta, Hohlvene, Herz und vegetative Nerven. Mit diesem Schritt wird das Tier über eine schnelle Ausbluten unter kontinuierlicher tiefer Narkose getötet.
10. Starten Drucksteuerung der Perfusionspumpe. Pflegen Sie den mittleren Druck zwischen 80 und 100 mmHg.
11. Schließen Ligatur V.
12. Schließen Ligatur VI.
13. Schließen Ligatur VIII.
14. Freie die rechte Niere von Binde- tissue und seine Einbettung in die adipösen Kapsel mit einer Schere.
15. Schneiden proximal die Aorta V. Ligatur
16. Schneiden Sie die A. mesenterica superior distal VI Ligatur.
17. Schneiden Sie die Niere tragende Gefäßbündel aus, dabei nicht in die Gefäße selbst zu schneiden.
18. Schneiden die Leber an der Verbindung mit der Niere. Achten Sie darauf, die Niere zu befreien, aber ein kleiner Teil der Leber verwachsen sie verlassen, so dass die Hohlvene wird durch sie offen gehalten.
19. Nehmen Sie die Niere Bündel aus der Maus. Entfernen Sie die Maus aus der feuchten Kammer.
20. Setzen Sie ein "Lasso" Ligatur um die Verbindung von Leber und Niere (Ligatur IX).
21. Kanülieren die Hohlvene mit einer venösen Leitung (2 cm PE 50).
22. Schließen Ligatur IX. Venöse Abfluss durch die venöse Leitung sollte sofort beginnen.
23. Schließen Sie die feuchte Kammer.

6. Downstream-Analysen

1. Während der folgenden Stunde, überwachen kontinuierlich den Blutfluss und intravascular Druck ^15. Sammeln Sie venösen Abfluss, die ⁷ für die Analyse von zum Beispiel Nierenreninfreisetzung verwendet werden kann. Sammeln Sie Urin für die Analyse der Elektrolytkonzentration und der glomerulären Filtrationsrate ^14. Nach 1 Stunde Perfusion kann Nieren für Western - Blot werden schockgefroren oder für die Bildgebung Ansätze ¹⁶ festgelegt werden.

Ergebnisse

Mit dem Verfahren isolierten Maus-Nieren beschrieben, kann für mindestens 1 h lebensfähig bleiben. Wir testeten die Gewebelebensfähigkeit nach 1 Stunde der kontinuierlichen Perfusion mit funktionellen (Nierendurchblutung und Gefäßwiderstand, Blutgasanalyse von venösen Abflusses, der glomerulären Filtrationsrate, Harn- fraktionierte Na ⁺ und K ⁺ -Ausscheidung und Urinosmolalität) und morphologischen (Transmissionselektronenmikroskop Mikroskopie TEM) Methods i...

Diskussion

Die Maus perfundierte Niere isoliert ist ein Werkzeug für die Untersuchung der Nierenfunktion in einer kontrollierten Umgebung ex vivo für 1 h, die Lücke zwischen den in vivo Experimenten in intakten Tieren, die durch die Wirkung zahlreicher systemischer Faktoren fehlerhaft sein kann, und in vitro - Experimenten in isoliert nephron Segmente oder kultivierten Zellen, die notwendigerweise die Auswirkungen der intakten Organstruktur auf Funktion vernachlässigen. Es ist, nach Kenntnis der Auto...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2901
Cannular with basket and side port	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2947
Thermostat TC120-ST5	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1L	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5L	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3436
Pressure Transducer APT300	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3862
TAM-D Plugsys Transducer	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-1793
SCP Plugsys servo controller	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2806
Windkessel	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3717
HSE-USB data acquisition	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone	B.Braun	7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19mm I.D. x 1.70mm O.D.	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/8
Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10%	B.Braun	134518064
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	M1125-25G
Sodium-L-Lactate	Sigma-Aldrich	L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt	Sigma-Aldrich	K1875-25G
NaCl	Sigma-Aldrich	31434-1KG-R
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761-5KG
KCl	Sigma-Aldrich	60130-1KG
Urea	Sigma-Aldrich	U5378-500G
Creatinine	Sigma-Aldrich	C4255-10G
Ampicillin	Roche	10835242001
MgCl2 * 6H2O	Sigma-Aldrich	M2393-500G
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
CaCl2 * 6H2O	Riedel-de-Haën	12074
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638-500G
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP	Sigma-Aldrich	V2013-1MG
FITC-Inulin	Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration	Macherey-Nagel	MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex	Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM	FEI