A técnica de rim perfundidos rato isolado

Resumo

O mouse rim isolado perfundido (MIPK) é uma técnica para manter um rim do rato em condições ex vivo perfundidos e funcionais durante 1 h. Os tampões e técnica cirúrgica encontram-se descritos em pormenor.

Resumo

O mouse rim isolado perfundido (MIPK) é uma técnica para manter um rim do rato em condições ex vivo perfundidos e funcionais durante 1 h. Este é um pré-requisito para o estudo da fisiologia do órgão isolado e para muitas aplicações inovadoras que possam ser possíveis no futuro, incluindo decellularization perfusão de bioengenharia nos rins ou a administração de anti-rejeição ou drogas edição do genoma em altas doses para preparar o rim para transplante. Durante o tempo da perfusão, o rim pode ser manipulada, a função renal pode ser avaliada, e vários produtos farmacêuticos administrados. Após o procedimento, o rim transplantado ou pode ser processado para a biologia molecular, bioquímica, ou microscopia.

Este artigo descreve o perfusado e da técnica cirúrgica necessária para a perfusão ex-vivo de rins de rato. Os detalhes do aparelho de perfusão são dados e os dados são apresentados mostrando o vESPONSABILIDADE da preparação do rim: fluxo sangüíneo renal, resistência vascular, e urina dados como funcionais, micrografias eletrônicas de transmissão de diferentes segmentos dos néfrons como leituras morfológicas e Western blot de proteínas de transporte de diferentes segmentos dos néfrons como leitura molecular.

Introdução

A perfusão isolada de órgãos tem sido objecto de um esforço contínuo entre os fisiologistas por muitas décadas ^1. A técnica permite que a função do órgão, sem influências sistêmicas, tais como pressão arterial, hormônios ou nervos, a ser estudado. Carl Eduard Loebell é considerado para ser o primeiro a ter descrito a perfusão bem sucedida de um rim isolado, em 1849 ^2. Desde então, o aparelho de perfusão foi submetido refinamento significativa. Frey e Gruber introduzido um pulmão artificial para bombas de oxigenação e pulsátil para perfusão contínua ^2. Enquanto os primeiros pesquisadores estudaram principalmente os rins de mamíferos de grande porte, ou seja, porcos e cães ^{2 3} -o primeiro relatório do uso de rins de ratos, por Weiss et al. , Foi um marco no estudo da perfusão-mamífero-órgão pequeno ^4. Schurek et ai. relataram a necessidade de adição de eritrócitos de mamífero para o perfusato se tubular renal suficienteoxigenação deveria ser alcançado ^5. Crítico para experiências a longo prazo foi a introdução de diálise contínua do tampão pelo mesmo grupo de pesquisa ^6. Em 2003, Schweda et al. foram os primeiros a relatar um rim do rato funcional isolado perfundido (MIPK) ^7, posteriormente refinado por Rahgozar et al. ¹⁸ e Lindell et ai. ^14.

Embora tecnicamente mais exigente do que o de rato perfundido isolado de rim, o uso do MIPK carrega a vantagem de permitir o uso de uma grande variedade de ratinhos geneticamente alterados. Este artigo apresenta os dados sobre o método dos autores para perfusão isolados de rato rins durante 1 h. O método permite a avaliação contínua da taxa renal fluxo, resistência vascular, liberação de hormônio, gasometria, análise de urina, bem como a aplicação de medicamentos. Seguindo o procedimento, rins podem ser processadas para análise molecular e bioquímica, ser fixo por microscopia, outransplantado para um rato receptor (Figura 1).

Figura 1: Visão geral do Possível entrada / saída para o rim isolado perfundido. BGA: Hemogasometria. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Esta técnica provavelmente vai receber uma atenção crescente nos próximos anos, como muitas aplicações inovadoras estão sendo discutidas com o alvorecer da perfusão renal normotérmica prolongado antes do transplante (com ou sem a aplicação de anti-rejeição ou drogas edição do genoma) ^{8, 9, 10 , 11,} a bioengenharia dos rins inteiros de andaimes descelularizados ^12, bem como a aplicação de doses elevadas de corantes fluorescentes para a imagem latente multiphoton ¹³ . Também é um modelo ideal com o qual se estudar o papel de genes específicos durante a lesão renal aguda ^14.

Um protocolo de passo-a-passo é dado para permitir que outros laboratórios para realizar isolado rato perfusão renal com sucesso. Em primeiro lugar, a composição e preparação do buffer é especificado. Em seguida, a cirurgia é descrito em pormenor e os passos críticos são mostrados. Em terceiro lugar, os dados são apresentados que são representativos de uma preparação bem sucedida: o fluxo sanguíneo renal, resistência vascular, taxa de filtração glomerular, e eletrólitos fraccionada medições funcionais de viabilidade e eletrônica de transmissão micrografias da morfologia dos diferentes segmentos dos néfrons de Rins todos excreção- fixado após 1 hora de perfusão.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem animais descritos neste manuscrito foram conduzidos de acordo com a lei suíça e aprovado pela administração veterinária do Cantão de Zurique, Suíça.

1. Preparação Tampão

1. Preparar soluções 1 - 4 e a solução de hormônio antidiurético (ADH) (Tabela 1).
2. Prepara-se o tampão de diálise (Tabela 1).
   NOTA: Este é o tampão utilizado como o tampão de diálise durante a perfusão. Mais tarde, os eritrócitos serão diluídas neste tampão para formar o perfusato final.
3. preparação de eritrócitos.
   1. Dilui-se 250 ml de concentrado de eritrócitos humana (material testado obtido a partir do banco de sangue local) para 500 ml com tampão de diálise. Centrifugar a 2000 xg durante 8 minutos. Remover o tampão, tomando cuidado para não remover quaisquer eritrócitos. 3x.
4. Prepara-se o (albumina de soro de bovino; BSA) de albumina de tampão.
   1. Em 200 ml de dialysitampão s, dissolver 44 g de BSA usando uma barra de agitação. Filtra-se a solução com papel de filtro.
5. Prepara-se o perfusado.
   1. Filtrar os eritrócitos a partir do passo 1.3.1 através de papel de filtro para o tampão de BSA. Encha até um volume total de 800 ml com tampão de diálise.
      NOTA: Este é o perfusato final. O hematócrito agora deve situar-se entre 8 e 12%. O perfusato pode ser armazenado durante até 12 h a 4 ° C.

2. Início de Diálise e Oxigenação

1. Ligar o banho de água em torno do reservatório maior tampão, menor do reservatório tampão, e a câmara de humidade (uma pequena câmara, de parede dupla trazida a 37 ° C e 100% de humidade para realizar mais tarde, o rim) a 37 ° C (Figura 2) .
2. Encher o reservatório de tampão de maior com o tampão de diálise e o reservatório menor com o perfusato.
3. Ligue a 5% de CO _2/95% O ₂ afluxo de gás para o tampão de diálise.
4. Ligar diálise contínua do perfusado contra o tampão de diálise. Tome o cuidado de usar tubos de diálise baixo fluxo. Vá para a Etapa 3.

Figura 2: Desenho esquemático do circuito de perfusão. Esquema mostra os principais componentes do circuito de perfusão e a direcção do fluxo tampão. Todos os componentes rodeados por azul escuro são mantidos a 37 ° C com um banho de água / termostato. 1: tampão de diálise de pelo menos 3 vezes o volume de tampão de perfusão é continuamente borbulhada com 95% _{de O2} / 5% de CO _2. 2: tampão de diálise e tampão de perfusão são continuamente dialisada contra o outro num tubo de diálise por uma bomba de rolos. 3: througho constante Devido a esta diálise, o tampão de perfusão é enriquecida com 9% _{de O2} / 5% de CO ₂ e de electrólitos são mantidos níveisperfusão ut. 4: Uma bomba de cilindro impele o tampão de perfusão para o rim. 5: Uma Windkessel remove as ondas peristálticas e funciona como uma armadilha de bolhas. 6: transdutor de pressão (ligados a 4. (bomba de roletes) para manter a pressão contínua, permitindo o fluxo alternando livremente). 7: Durante a perfusão, o rim permanece numa câmara húmida para 100% de humidade atmosférica e 37 ° C Temperatura de rim. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Cirúrgica Procedimento Parte 1 (para um diagrama de todas as ligaduras, consulte a Figura 3)

Nota: Executar todas as ligaduras usando 5-0 fio cirúrgico.

1. Anestesiar um rato por injecção intraperitoneal (10 mL / g de peso corporal, de 20 mg / ml de cetamina e 1 mg / ml de xilazina dissolvido em 0,9% de NaCl). Confirmar profundidade suficiente de AnesthAIAS por testar a ausência de reflexos traseira pés.
2. Corrigir o rato em decúbito dorsal na câmara húmida. Proteger os olhos com pomada veterinário. Coloque uma seringa de 1 ml abaixo da coluna vertebral para elevar os vasos lombares.
3. Realizar uma laparotomia mediana da crista púbica para a abertura do esterno primeira a pele, em seguida, os músculos abdominais, com uma tesoura.
4. Remover o intestino e colocá-lo no lado esquerdo da lateral do mouse a partir do abdômen.
5. Libertar a bexiga de tecido conjuntivo e explorar ambos os ureteres e uretra.
6. Coloque uma ligadura em torno do ureter esquerdo (ligadura I). Fecha-o.
7. Colocar uma ligadura em torno da uretra (ligadura II). Fecha-o.
8. Coloque um "laço" ligadura em torno de toda a bexiga (ligadura III).
9. Faça uma incisão na bexiga 1 mm.
10. Canular a abertura com dois centímetros PE 50 tubos.
11. Fechar ligadura III em torno do tubo.
12. Cortar o uréter esquerdo e uretra distai das ligaduras. o bladder agora está ligado ao ureter direito apenas e movimentando-se livremente.
13. Desmarque a aorta abdominal de tecido conjuntivo e gordura.
14. Coloque uma ligadura meados de aorta abdominal (ligadura IV).
15. Colocar uma ligadura em torno da aorta abaixo do diafragma entre a artéria mesentérica superior e o tronco celíaca (V ligadura).
16. Colocar uma ligadura à volta da artéria mesentérica superior (VI ligadura).
17. Coloque uma ligadura da aorta imediatamente abaixo do direito e acima da artéria renal esquerda (VII ligadura).
18. Coloque uma ligadura em torno do pacote de caudal veia (veia) (VIII ligadura). Vá para a Etapa 4.

Figura 3: Desenho esquemático das ligaduras colocadas durante a cirurgia. Vista do abdómen aberto após a laparotomia. O intestino é movido para fora para a esquerda. L e R indicam o rim esquerdo eo direito. olinhas pretas mostram a área da respectiva laqueação. Ligaduras primeira colocação e depois fechada, na sequência indicada no texto. X marca a localização da incisão para canulação da aorta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Priming do circuito de perfusão

1. Inicie a bomba rotativa e encher o tubo com perfusato. Tome cuidado para esvaziar todas as bolhas de ar.
2. Encha o dispositivo Windkessel a cerca de nível médio com perfusato.
3. Calibra-se o transdutor de pressão até 0 mm de Hg quando toda a tubagem é cheio e o fluxo é 0. Manter a agulha de perfusão, a nível renal durante este tempo.
4. Manter o fluxo em um nível mínimo constante (0,6 ml / min) e vá para a Etapa 5.

5. Surgical Procedimento Parte 2

1. Coloque um grampo entre ligadura IV ea ramificação da rena esquerdal artéria.
2. Faça uma pequena incisão no caudal aorta de ligadura IV, tomando cuidado para não cortar a parede dorsal.
3. Dilatar a abertura da aorta com um vaso dilatador.
4. Canular a aorta, com uma agulha (2 cm de comprimento, puxado PE 50), empurrando a ponta apenas para o grampo.
5. Abra o grampo.
6. Empurrar a ponta da agulha cranialmente até atingir a junção da artéria renal direita e da aorta.
7. Fechar ligadura VII.
8. Fechar ligadura IV.
9. Abra o peito com uma tesoura dissecando o diafragma. Com um único corte, separe a aorta, a veia cava, coração e nervos vegetativos. Com este passo, o animal foi sacrificado através de exsanguinação sob anestesia profunda rápida contínua.
10. Iniciar o controle da pressão da bomba de perfusão. Manter a pressão média entre 80 e 100 mmHg.
11. Fechar V. ligadura
12. Fechar ligadura VI.
13. Fechar ligadura VIII.
14. Livre do rim direito de tissu conjuntivoe e sua incorporação na cápsula adiposo com uma tesoura.
15. Corte a aorta proximal à ligadura V.
16. Corte da artéria mesentérica superior distalmente à ligadura VI.
17. Cortar o feixe vascular-sustentável rim para fora, tomando cuidado para não cortar os próprios vasos.
18. Cortar o fígado na ligação para o rim. Cuidar para libertar o rim, mas deixa uma pequena parte do aderente fígado a ele, de modo que a veia cava é mantida aberta por ela.
19. Pegue o pacote de rim para fora do mouse. Remover o rato da câmara úmida.
20. Coloque um "laço" ligadura à volta da ligação de fígado e rim (IX ligadura).
21. Canular a veia cava com uma linha venosa (dois centímetros PE 50).
22. Fechar ligadura IX. fluxo venoso através do cateter venoso deve começar imediatamente.
23. Feche a câmara úmida.

6. As análises a jusante

1. Durante a hora seguinte, monitorar continuamente o fluxo sanguíneo e intravasculpressão de ar ^15. Recolhe fluxo venoso, que pode ser utilizado para análise de, por exemplo, a libertação de renina renal ^7. Coleta de urina para análise da concentração de eletrólitos e taxa de filtração glomerular ^14. Após 1 hora de perfusão, os rins podem ser snap-congelados por western blot ou ser fixado para a imagem latente aproxima ^16.

Resultados

Com o método descrito, rins isolados do rato podem permanecer viáveis ​​durante pelo menos 1 h. Foi testada a viabilidade dos tecidos depois de 1 hora de perfusão contínua com funcional (fluxo sanguíneo renal e resistência vascular, gasometria do fluxo venoso, taxa de filtração glomerular, urinário fraccionada Na ⁺ e K ⁺ excreção, e osmolaridade urinária) e morfológico (eletrônica de transmissão microscopia, TEM) em quatro métodos rins de tipo se...

Discussão

O mouse rim isolado perfundido é uma ferramenta para o estudo da função renal em um ambiente controlado ex vivo, durante 1 hora, fazendo a ponte entre experiências in vivo em animais intactos, o que pode ser falho pelo impacto de vários fatores sistêmicos e experimentos in vitro em segmentos dos néfrons isolados ou células cultivadas, o que necessariamente negligenciam o impacto da estrutura de órgãos intactos na função. Há, ao conhecimento dos autores, nenhuma técnica alternativ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2901
Cannular with basket and side port	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2947
Thermostat TC120-ST5	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1 L	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3436
Pressure Transducer APT300	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3862
TAM-D Plugsys Transducer	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-1793
SCP Plugsys servo controller	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2806
Windkessel	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3717
HSE-USB data acquisition	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone	B.Braun	7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D.	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/8
Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10%	B.Braun	134518064
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	M1125-25G
Sodium-L-Lactate	Sigma-Aldrich	L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt	Sigma-Aldrich	K1875-25G
NaCl	Sigma-Aldrich	31434-1KG-R
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761-5KG
KCl	Sigma-Aldrich	60130-1KG
Urea	Sigma-Aldrich	U5378-500G
Creatinine	Sigma-Aldrich	C4255-10G
Ampicillin	Roche	10835242001
MgCl2 * 6H2O	Sigma-Aldrich	M2393-500G
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
CaCl2 * 6H2O	Riedel-de-Haën	12074
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638-500G
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP	Sigma-Aldrich	V2013-1MG
FITC-Inulin	Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration	Macherey-Nagel	MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex	Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM	FEI