Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği

Özet

Fare izole edilmiş perfüze böbrek (MIPK) perfüze edildi ve 1 saat için fonksiyonel ex vivo koşullar altında bir fare böbrek tutmak için kullanılan bir tekniktir. tamponlar ve cerrahi teknik ayrıntılı olarak tarif edilmiştir.

Özet

Fare izole edilmiş perfüze böbrek (MIPK) perfüze edildi ve 1 saat için fonksiyonel ex vivo koşullar altında bir fare böbrek tutmak için kullanılan bir tekniktir. Bu izole organ ve perfüzyon böbrek biyomühendislik için Decellularization veya anti-reddi veya asal böbrek yüksek dozlarda genom düzenleme ilaç uygulaması da dahil olmak üzere gelecekte mümkün olabilir pek çok yenilikçi uygulamalar için fizyolojisi eğitimi için bir ön koşuldur nakli için. perfüzyon süre boyunca, böbrek, böbrek fonksiyonu değerlendirilebilir, manipüle ve çeşitli ilaç tatbik edilebilir. İşlemden sonra, böbrek nakledilen veya moleküler biyoloji, biyokimya analizi, ya da mikroskopi için işlenir.

Bu yazıda perfüzat ve fare böbrekler ex vivo perfüzyon için gerekli cerrahi teknik anlatılmaktadır. perfüzyon aparatı detayları verilen ve veri v gösteren sunulmuşturböbreğin hazırlama iability: morfolojik okumalar ve moleküler okuma farklı nefron bölümlerinin taşıyıcı proteinlerin Western blotlar farklı nefron bölümlerinin işlevsel transmisyon elektron mikroskobuyla böbrek kan akışı, vasküler direnç ve idrar verileri.

Giriş

Organların izole perfüzyon onlarca yıl ¹ fizyolog arasında sürekli bir çaba konusu olmuştur. tekniği, kan basıncı, hormonlar, ya da sinirler gibi sistemik etkileri olmadan, organın işlevini sağlayan, çalışılacak. Carl Eduard Loebell 1849 ^2, izole edilmiş böbrek başarıyla perfüzyon tarif eden ilk olarak kabul edilir. O zamandan beri, perfüzyon aparatı önemli arıtma uğramıştır. Frey ve Gruber sürekli perfüzyon ² oksijenasyon ve pulsatil pompalar için yapay akciğer tanıttı. Erken araştırmacılar özellikle büyük memeliler-yani, domuzlar ² ve köpekler ³ sıçan böbreklerinde kullanımı -the ilk rapor, Weiss ve ark ait böbrekler okudu iken. Küçük memeli organ perfüzyon ⁴ çalışmada bir dönüm noktası oldu. Schurek ve ark. Yeterli böbrek tübüler eğer perfüzat memeli eritrosit ekleme gerekliliğini bildirdioksijen ⁵ elde edilebilir amaçlanmıştır. Uzun vadeli deneyler için kritik Aynı araştırma grubu ⁶ ile tampon sürekli diyaliz tanıtım oldu. 2003 yılında, Schweda ve ark. Daha sonra Rahgozar ve arkadaşları tarafından rafine fonksiyonel fare izole perfüze böbrek (MIPK) ^7, rapor için ilk idi. ¹⁸ ve Lindell ve diğ. ^14.

perfüze böbrek izole sıçan daha teknik olarak daha zor olsa da, MIPK kullanımı genetik olarak değiştirilmiş farelerin geniş bir yelpazede kullanımını sağlayan avantajını taşımaktadır. Bu kağıt 1 saat boyunca izole fare böbrekleri perfüze için yazarların yöntemin ayrıntılarını sunar. yöntem böbrek akış hızı, damar direnci, hormon salınımı, kan gazı analizi, idrar analizi ve ilaçların uygulama sürekli değerlendirme sağlar. prosedür takip edilerek, böbrekler, moleküler ve biyokimyasal analiz için işlenebilir mikroskopi için sabit ya daBir alıcı fare içine nakledilen (Şekil 1).

Şekil 1: İzole perfüze Böbrek Olası Giriş / Çıkış bakış. BGA: Kan gazı analizi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Birçok yenilikçi uygulamalar ile (veya anti-ret veya genom düzenleme ilaçların uygulama olmadan) ^{8, 9} nakilden önce uzun süreli normotermik böbrek perfüzyon şafak ile tartışılmaktadır olarak bu tekniğin büyük ^{olasılıkla, 10,} önümüzdeki yıllarda artan ilgi alacaksınız ^{, 11,} hücresizleştirilmiş iskeleler ¹² gelen bütün böbreklerin Bioengineering ve multiphoton görüntüleme ¹³ floresan boyalar yüksek dozlarda uygulanması . Ayrıca akut böbrek hasarı ¹⁴ sırasında belirli genlerin rolünü araştırmak için ideal bir modeldir.

Bir adım-adım protokolü diğer laboratuarlar başarıyla izole fare böbrek perfüzyon gerçekleştirmek için izin verilir. İlk olarak, bileşim, ve tampon hazırlanması belirtilir. Daha sonra, cerrahi ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ve kritik adımlar gösterilmektedir. Üçüncü olarak, veri başarılı bir hazırlık temsil ettiğini sunulmuştur: renal kan akımı, damar direnci, glomerüler filtrasyon hızı ve fraksiyonel elektrolit atılımı hepsi perfüze böbreklerin farklı nefron segmentlerinden morfolojisi canlılık-ve transmisyon elektron mikroskobuyla olarak fonksiyonel ölçümler perfüzyon 1 saat sonra sabit.

Protokol

Bu yazıda anlatılan hayvanları da içeren tüm işlemler İsviçre hukukuna göre ve Zürih, İsviçre Kantonu veteriner idaresi tarafından onaylanmış gerçekleştirilmiştir bulundu.

1. Tampon Hazırlama

1. 4 ve antidiüretik hormon (ADH) çözeltisi (Tablo 1) - çözümleri 1 hazırlayın.
2. Diyaliz tamponu (Tablo 1) hazırlayın.
   NOT: Bu perfüzyon sırasında diyaliz tamponu olarak kullanılmıştır tampondur. Daha sonra, eritrositler son perfüzat oluşturmak için bu tampon içinde seyreltilir.
3. Eritrosit hazırlanması.
   1. insan eritrosit konsantresi diyaliz tamponu ile 500 ml (yerel kan bankasından elde edilen test materyal) 250 ml sulandırmak. 8 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüjleyin. herhangi eritrositler kaldırmak için dikkatli olmak, tamponu çıkarın. 3x tekrarlayın.
4. tampon; albümini (BSA sığır serum albümini) hazırlayın.
   1. dialysi, 200 mls tamponu, bir karıştırma çubuğu kullanılarak BSA 44 g çözülür. filtre kağıdı ile çözüm Filtre.
5. perfüzat hazırlayın.
   1. BSA tampon içine filtre kağıdı ile adım 1.3.1 den eritrositler Filtre. Diyaliz tamponu ile 800 ml arasında bir toplam hacme kadar doldurun.
      NOT: Bu son perfüzyon olduğunu. hematokrit Şimdi 8 ile% 12 arasında olmalıdır. Perfüzat 12 saat kadar 4 ° C'de saklanabilir.

2. başlatılması Diyaliz ve Oksijenizasyon

1. Daha büyük bir tampon rezervuar, daha küçük bir tampon rezervuar ve nemli bir odada 37 ° C (küçük, çift cidarlı sonra böbrek tutmak için 37 ° C ve% 100 bağıl neme getirdi) çevreleyen su banyosu üzerinde çevirin (Şekil 2) .
2. Diyaliz tamponu ile daha büyük bir tampon rezervuar ve perfüzat ile birlikte küçük bir doldurun.
3. Diyaliz tamponu% 5 CO ₂ /% 95 O ₂ gaz girişi çevirin.
4. diyaliz tamponuna karşı perfüzat sürekli diyaliz açın. Düşük akı diyaliz tüp kullanmak için özen gösterin. Adım 3'e geçin.

Şekil 2: Perfüzyon Devre şematik çizimi. Şema perfüzyon devresinin ana bileşenleri ve tampon akış yönünü gösterir. lacivert çevrili tüm bileşenler bir su banyosu / termostat ile 37 ° C'de tutulur. 1: perfüzyon tamponu en az 3 kez hacmi Diyaliz tamponu sürekli olarak% 95 O _{2/5% CO2} ile köpürtülür. 2: Diyaliz tamponu ve perfüzyon tampon maddesi sürekli bir silindir pompa ile bir diyaliz tüpü içinde birbirlerine karşı diyaliz edilir. 3: Bu diyalize perfüzyon tampon maddesi% 9 O ile zenginleştirilmiştir nedeniyle _{2/5% CO2} ve elektrolit seviyeleri tutulur, sabit throughout perfüzyon. 4: Bir silindir pompa böbrek doğru perfüzyon tampon sevkeder. 5: Bir windkessel peristaltik dalgalar kaldırır ve bir baloncuk kapanı gibi davranır. 6: Basınç detektörler (serbest dalgalı akış izin verirken 4. (silindir pompasına bağlı) sürekli baskı tutmak için). 7: perfüzyon boyunca, böbrek% 100 hava nemi ve 37 ° C, böbrek sıcaklığında bir nem odasında tutulur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3. Cerrahi Prosedür Bölüm 1 (tüm bitişik harfler bir diyagram için, bakınız Şekil 3)

Not: 5-0 cerrahi iplik kullanarak tüm bitişik harfler gerçekleştirin.

1. periton içi enjeksiyon ile bir fare (% 0.9 NaCI içinde çözülmüştür vücut ağırlığı, 20 mg / ml ketamin ve 1 mg / ml ksilazin 10 ul / g) anestezisi. Analg yeterli derinliği onaylayınArka ayak reflekslerin yokluğu test ederek esia.
2. nemli odasında yatar pozisyonda fare sabitleyin. Veteriner merhem ile gözleri koruyun. lomber damarları yükseltmek için omurga altına 1 ml şırınga yerleştirin.
3. makasla ilk sternum açılış cilt, daha sonra karın kasları, kasık tepesinin bir medyan laparotomi gerçekleştirin.
4. bağırsak çıkarın ve karın fare yanal sol tarafına yerleştirin.
5. bağ dokusu mesaneyi boşaltmak ve üreterler ve üretrayı hem de keşfetmek.
6. Sol üreter (bağ I) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. Kapat onu.
7. üretra (bağ II) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. Kapat onu.
8. Bütün mesane (bağ III) etrafında bir "kement" bitişik harfleri yerleştirin.
9. Mesaneyi 1 mm İnsizyon.
10. 2 cm PE 50 tüpü ile açıklığa kanüle.
11. boru etrafında yakın bağ III.
12. bitişik harfler sol üreter ve üretra distalinde kesti. bladder şimdi sadece ve serbestçe hareket sağ üreter takılır.
13. Bağ dokusu ve yağ abdominal aorta temizleyin.
14. abdominal orta aort bitişik harfleri (bağ IV) yerleştirin.
15. superior mezenterik arter ve çölyak gövde (bağ V) arasındaki diyafram altında aort etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin.
16. superior mezenterik arter (bağ VI) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin.
17. doğrudan aşağıda sağda ve sol renal arter (bağ VII) Yukarıdaki aort bitişik harfleri yerleştirin.
18. kaudal ven paketi (cava) (bağ VIII) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. Adım 4 ile devam edin.

Şekil 3: Cerrahi sırasında yerleştirilen Bitişik Harfler şematik çizimi. Laparotomi sonrası açık karın görünümü. bağırsak sola dışarı taşınır. L ve R, sol ve sağ böbrek göstermektedir.siyah çizgiler ilgili ligature alanını gösterir. Harfler önce yerleştirilmiş ve daha sonra metin içinde verilen sırada, kapatılır. X aort kanülasyon için kesi yerini işaretler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Perfüzyon Devre 4. Hazırlama

1. Döner Pompayı başlatın ve perfüzat ile tüp doldurun. ondan tüm hava kabarcıklarını boşaltmak için özen gösterin.
2. perfüzat ile birlikte yaklaşık olarak orta-seviyeye windkessel cihazı doldurun.
3. Tüm boru dolu ve akış bu süre içinde böbrek düzeyinde perfüzyon iğne tutun 0'dır olduğunda 0 mm Hg basınç dönüştürücü ayarlayın.
4. sabit asgari düzeyde (0.6 ml / dk) akışını tutmak ve Adım 5 geçin.

5. Cerrahi Prosedür Bölüm 2

1. ligature IV ve sol Rena dallanma arasında bir kelepçe yerleştirinl arter.
2. dorsal duvarı kesme özen, bağ IV aort kaudal küçük bir kesi yapmak.
3. Bir gemi dilatör ile aort açıklığı dilate.
4. Bir iğne ile aort cannulate sadece kelepçe ucu iterek, (2 cm uzunluğunda, PE 50 çekti).
5. kelepçesini açın.
6. Doğru böbrek arter ve aort kavşak ulaşıncaya kadar iğne cranially ucu itin.
7. Kapat bağ VII.
8. Kapat bağ IV.
9. diyafram diseksiyon ile makas ile göğüs açın. Tek bir kesim ile, aort, vena kava, kalp ve vejetatif sinir ayırın. Bu adımla birlikte, hayvan sürekli derin anestezi altında hızlı kan kaybından yoluyla kurban.
10. perfüzyon pompa basınç kontrolü başlatın. 80 ve 100 mmHg arasında ortalama basıncı koruyun.
11. Yakın bağ V.
12. Kapat bağ VI.
13. Kapat bağ VIII.
14. Bağ Tissu'dan ücretsiz sağ böbrekE ve makasla adipoz kapsül içine gömme.
15. V. ligature için proksimal aort Cut
16. VI ligature için distal superior mezenterik arter kesin.
17. gemiler kendileri oyulmuş değil özen, böbrek destekleyici damar demeti kesin.
18. böbrek bağlantısında karaciğer kesin. böbrek serbest özen gösterin, fakat vena kava onun tarafından açık tutulur, böylece ona karaciğer yapışık küçük bir kısmını bırakın.
19. fare dışarı böbrek desteyi alıp. Nemli odasından fareyi çıkarın.
20. karaciğer ve böbrek (bağ IX) bağlantısı etrafında bir "kement" bitişik harfleri yerleştirin.
21. venöz hat (2 cm PE 50) ile vena kava cannulate.
22. Kapat bağ IX. venöz hattı üzerinden venöz çıkış derhal başlamalıdır.
23. nemli bir odada kapatın.

6. Alt Analizler

1. Aşağıdaki saat boyunca, sürekli kan akışını ve intravascul izlemekar basıncı ^15. Örneğin analizi için kullanılabilir kan çıkışı, renal renin salınımını ⁷ toplayın. Elektrolit konsantrasyonu ve glomerüler filtrasyon hızı ¹⁴ analiz için idrar toplayın. Perfüzyon 1 saat sonra, böbrekler Western blot ek dondurulabilir veya görüntüleme için sabit ¹⁶ yaklaşır.

Sonuçlar

yöntem tarif ile, izole edilmiş fare böbrekleri, en az 1 saat boyunca canlı kalabilir. Fonksiyonel (böbrek kan akımı ve damar direnci, venöz çıkış, glomerüler filtrasyon hızı, idrar fraksiyonel Na ⁺ ve K ⁺ atılımını kan gazı analizi ve idrar osmolalitesi) ve morfolojik (iletim elektron sürekli perfüzyon 1 saat sonra doku canlılığını test vahşi tip C57BL / 6 fareden oluşan dört böbreklerde mikroskobu, TEM) yöntemleri. Ayrıca, farklı ...

Tartışmalar

Perfüze böbrek izole fare çok sayıda sistemik faktörlerin etkisi ile kusurlu olabilir sağlam hayvanlarda in vivo deneyler arasındaki köprü, 1 saat boyunca kontrollü bir ortamda ex vivo böbrek fonksiyonunu incelemek için bir araçtır ve in vitro deneylerde izole nefron segmentleri veya mutlaka fonksiyonu bozulmamış organ yapısı etkisini ihmal kültürlü hücreler. , Yazarların bilgisine, hiçbir alternatif bir teknik bu özel görevi vardır gerçekleştirmek için bir. Böbr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2901
Cannular with basket and side port	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2947
Thermostat TC120-ST5	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1 L	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3436
Pressure Transducer APT300	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3862
TAM-D Plugsys Transducer	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-1793
SCP Plugsys servo controller	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2806
Windkessel	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3717
HSE-USB data acquisition	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone	B.Braun	7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D.	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/8
Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10%	B.Braun	134518064
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	M1125-25G
Sodium-L-Lactate	Sigma-Aldrich	L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt	Sigma-Aldrich	K1875-25G
NaCl	Sigma-Aldrich	31434-1KG-R
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761-5KG
KCl	Sigma-Aldrich	60130-1KG
Urea	Sigma-Aldrich	U5378-500G
Creatinine	Sigma-Aldrich	C4255-10G
Ampicillin	Roche	10835242001
MgCl2 * 6H2O	Sigma-Aldrich	M2393-500G
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
CaCl2 * 6H2O	Riedel-de-Haën	12074
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638-500G
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP	Sigma-Aldrich	V2013-1MG
FITC-Inulin	Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration	Macherey-Nagel	MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex	Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM	FEI