Мышь Изолированные перфузировались почки Техника

Резюме

Мышь , изолированных перфузию почек (МИПК) представляет собой метод для поддержания почки мыши в условиях бывших естественных условиях перфузии и функциональных в течение 1 часа. Буферы и хирургическая техника подробно описаны.

Аннотация

Мышь , изолированных перфузию почек (МИПК) представляет собой метод для поддержания почки мыши в условиях бывших естественных условиях перфузии и функциональных в течение 1 часа. Это является предпосылкой для изучения физиологии изолированного органа, а также для многих инновационных приложений, которые могут быть возможно в будущем, в том числе перфузионной decellularization для почек биоинженерии или введения анти-отторжения или генома редактирования препаратов в высоких дозах премьер почки для трансплантации. Во время перфузии почек можно манипулировать, функция почек может быть оценена, и различные фармацевтические препараты вводят. После процедуры, почки могут быть пересажены или обработаны для молекулярной биологии, биохимического анализа, или микроскопии.

В данной статье описывается перфузат и хирургической техники , необходимой для экс естественных условиях перфузии почек мыши. Подробная информация о перфузионного устройства приведены данные, показывающие клиновойiability подготовки Почки в: почечный кровоток, сосудистое сопротивление, и мочи данных как функциональных, просвечивающей электронной микрофотографии различных сегментов нефрона как морфологическими считываниями и вестерн-блоттинга транспортных белков различных сегментов нефрона как молекулярного считывания.

Введение

Изолированная перфузия органов была предметом постоянных усилий между физиологи в течение многих десятилетий ^1. Методика позволяет функцию органа, без системных воздействий, таких как кровяное давление, гормоны, или нервов, чтобы быть изучены. Карл Эдуард Loebell считается первым описал успешное перфузия изолированной почки, в 1849 году ^2. С тех пор перфузия аппарат претерпел значительные доработки. Фрей и Грубер представил искусственное легкое для оксигенации и пульсирующих насосов для непрерывной перфузии ^2. В то время как ранние исследователи изучали в основном почки крупных млекопитающих, а именно, свиней и собак ^{2 3} -Первый отчет об использовании почек крыс, Вейсса и др. , Стала важной вехой в изучении перфузии небольшого млекопитающего-органа ^4. Schurek и др. сообщили о необходимости добавления к эритроцитам млекопитающих перфузату при наличии достаточных почечных канальцевоксигенации было быть достигнуто ^5. Критические для долгосрочных экспериментов было введение непрерывного диализа буфера с помощью той же исследовательской группой ^6. В 2003 году Schweda и др. были первыми , чтобы сообщить о функциональной мыши изолированных перфузии почек (МИПК) ^7, позже уточнена Rahgozar и др. ¹⁸ и Lindell и др. ^14.

В то время как технически более сложной, чем крысы, изолированных перфузии почек, использование МИПК имеет то преимущество, что позволяет использовать широкий спектр генетически измененных мышей. В данной статье представлены подробности метода авторов для перфузии изолированных почек мыши в течение 1 часа. Метод позволяет для непрерывной оценки скорости почечного кровотока, сосудистого сопротивления, высвобождение гормонов, анализ газового состава крови, анализ мочи, а также применение лекарственных средств. После процедуры, почки могут быть обработаны для молекулярного и биохимического анализа, должны быть установлены для микроскопии, илипересаживают в мышь - реципиента (рис 1).

Рисунок 1: Обзор возможных ввода / вывода к изолированному перфузировались почки. BGA: анализ газов крови. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Этот метод , вероятно , будет получать все большее внимание в предстоящие годы, так как многие инновационные приложения обсуждаются с рассветом длительной нормотермической перфузии почек до трансплантации (с или без применения анти-отторжения или генома редактирования наркотиков) ^{8, 9, 10 , 11,} биоинженерии целых почек от decellularized каркасах ^12, и применение высоких доз флуоресцентных красителей для многофотонной томографии ¹³ . Он также является идеальной моделью , с которой для изучения роли специфических генов во время острого повреждения почек ^14.

Протокол шаг за шагом дается, чтобы другие лаборатории проводить изолированную мыши почки перфузию успешно. Во-первых, состав и приготовление буфера задается. Затем, операция подробно описана и показаны критические шаги. В-третьих, данные представлены, которые являются репрезентативными для успешной подготовки: почечного кровотока, сосудистого сопротивления, скорости клубочковой фильтрации, а дробная электролит экскреции-все, как функциональные измерения жизнеспособности-и просвечивающей электронной микроскопии морфологии различных сегментов нефрона перфузией почек фиксированной после 1 часа перфузии.

протокол

Все процедуры, связанные с животными, описанные в этой рукописи были проведены в соответствии со швейцарским законодательством и утверждается ветеринарии кантона Цюрих, Швейцария.

1. Буфер Получение

1. Готовят растворы 1 - 4 , и раствор антидиуретического гормона (АДГ) (таблица 1).
2. Подготовка буфера для диализа (таблица 1).
   Примечание: Это буфер, используемый в качестве буфера для диализа во время перфузии. Позже Эритроциты будет разбавлен в этом буфере с образованием конечного перфузата.
3. подготовка Erythrocyte.
   1. Разбавляют 250 мл концентрата эритроцита человека (тестировалась материала, полученного из местного банка крови) до 500 мл буфера для диализа. Центрифуга при 2000 мкг в течение 8 мин. Удалите буфер, соблюдая осторожность, чтобы не удалить эритроциты. Повторите 3 раза.
4. Приготовьте альбумин (альбумин бычьей сыворотки БСА) буфера.
   1. В 200 мл dialysis буфера, растворите 44 г БСА с использованием мешалку. Фильтр решение с фильтровальной бумагой.
5. Подготовить перфузата.
   1. Фильтр эритроцитов, начиная с шага 1.3.1 через фильтровальную бумагу в буфер БСА. Наполните до общего объема 800 мл с помощью буфера для диализа.
      Примечание: Это последний Перфузат. Теперь гематокрита должно быть от 8 до 12%. Перфузат можно хранить в течение до 12 ч при температуре 4 ° С.

2. Инициирование Диализ и оксигенации

1. Включите водяной бане , окружающей буфер большего размера резервуара, меньший буферный резервуар и влажную камеру (небольшая, с двойными стенками камера доводят до 37 ° С и относительной влажности 100% , чтобы позже провести почка) до 37 ° С (рисунок 2) ,
2. Заполните буфер большего размера резервуар с буфером диализ и меньший резервуар с перфузату.
3. Включите 5% CO _2/95% O ₂ подачу газа в буфер диализом.
4. Включение непрерывного диализа перфузату против буфера для диализа. Будьте осторожны, чтобы использовать низкого потока диализной трубки. Перейдите к шагу 3.

Рисунок 2: Схематическое изображение Perfusion Circuit. Схема показывает основные компоненты схемы перфузионной и направление потока буфера. Все компоненты, окруженные темно-синего цвета выдерживают при 37 ° С с водяной бани / термостатом. 1: диализ буфером по крайней мере в 3 раза объем буфера перфузионного непрерывно продувают 95% O _2/5% CO _2. 2: Диализ буфер и буфер перфузию непрерывно диализу против друг друга в диализной трубке с помощью роликового насоса. 3: Из - за этого диализом, буфер перфузия обогащен 9% O _2/5% CO ₂ и электролитные уровни поддерживаются постоянными throughoут перфузия. 4: Роликовый насос разгоняет перфузионного буфер к почке. 5: Уиндкессел удаляет перистальтических волн и действует как пузырь ловушку. 6: Датчик давления (подключен к 4 (роликового насоса) , чтобы сохранить постоянное давление, позволяя свободно переменный поток). 7: На протяжении перфузии почек остается во влажной камере в течение 100% влажности воздуха и температуре 37 ° C Температура почек. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Хирургические процедуры Часть 1 (на диаграмме всех лигатур, смотри рисунок 3)

Примечание: Выполните все лигатуры с помощью 5-0 хирургической нити.

1. Обезболить мышь интраперитонеально (10 мкл / г массы тела, 20 мг / мл кетамина и 1 мг / мл ксилазина, растворенного в 0,9% NaCl). Подтвердить достаточную глубину AnesthОВОСС путем проверки на отсутствие задних ног рефлексов.
2. Закрепите мышь в положении лежа на спине во влажной камере. Защитите глаза с ветеринаром мазь. Поместите 1 мл шприц ниже позвоночника, чтобы поднять поясничных сосудов.
3. Выполнить средний лапаротомии от лобковой гребень к грудине открытия первой кожи, то мышцы живота, с помощью ножниц.
4. Удалить кишечник и поместите его на левой стороне боковой мыши из брюшной полости.
5. Освободите мочевой пузырь из соединительной ткани и исследовать оба мочеточника и мочеиспускательного канала.
6. Поместите лигатуры вокруг левого мочеточника (лигатуры I). Закрой его.
7. Поместите лигатуры вокруг мочеиспускательного канала (лигатуры II). Закрой его.
8. Поместите "Лассо" лигатуры вокруг всего мочевого пузыря (лигатуры III).
9. Надрезать мочевого пузыря 1 мм.
10. Иглу отверстие с 2 см РЕ 50 труб.
11. Закрыть лигатура III вокруг трубки.
12. Обрежьте левого мочеточника и мочеиспускательного канала удалена от лигатуры. Bladдер теперь прикреплен к правой мочеточника только и свободно двигаться.
13. Очистите брюшной аорты соединительной ткани и жира.
14. Поместите брюшной аорты в середине лигатуры (лигатуры IV).
15. Поместите лигатуры вокруг аорты ниже диафрагмы между верхней брыжеечной артерии и чревного ствола (лигатура V).
16. Поместите лигатуры вокруг верхней брыжеечной артерии (лигатуры VI).
17. Поместите аортального лигатуры непосредственно ниже справа и над левой почечной артерии (лигатура VII).
18. Поместите лигатуры вокруг хвостового пакета вены (кава) (лигатуры VIII). Перейдите к шагу 4.

Рисунок 3: Схематическое изображение лигатур , помещенных во время хирургического вмешательства. Вид на открытой брюшной полости после лапаротомии. Кишечник съехал влево. L и R указывают на левую и правую почку.черные линии показывают площадь соответствующего лигатуры. Лигатуры сначала помещаются, а затем закрыты, в последовательности, указанной в тексте. X обозначает расположение разреза для пункции аорты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

4. Грунтовка перфузионной Circuit

1. Запустите роторный насос и заполнить трубку с перфузату. Позаботьтесь, чтобы очистить все пузырьки воздуха из него.
2. Заполните устройство Уиндкессел примерно среднего уровня с перфузату.
3. Выполните калибровку датчика давления до 0 мм ртутного столба, когда все трубки заполняют и поток 0. Держите перфузионного иглу на уровне почек в течение этого времени.
4. Держите поток на постоянном минимальном уровне (0,6 мл / мин) и перейти к шагу 5.

5. Хирургическая процедура Часть 2

1. Поместите зажим между лигатуры IV и разветвлению левого Ренал артерии.
2. Сделайте небольшой надрез в аорте хвостового лигатуры IV, следя за тем, чтобы не перерезать спинной стенки.
3. Разбавить отверстие в аорту с расширитель сосуда.
4. Аорту иглу с иглой (2 см длиной, вытащил PE 50), толкая наконечник только к зажиму.
5. Откройте зажим.
6. Вставьте кончик иглы краниально, пока не достигнет стык правой артерии почек и аорты.
7. Закрыть лигатуры VII.
8. Закрыть лигатуры IV.
9. Откройте сундук с ножницами рассечением диафрагмы. С помощью одного разреза, отделяют аорту, полую вену, сердце и вегетативных нервов. С помощью этого шага, животное умерщвляют посредством быстрого обескровливания при непрерывном глубокой анестезии.
10. Начало регулирования давления перфузионной насоса. Поддерживать среднее давление от 80 до 100 мм ртутного столба.
11. Закрыть лигатуры В.
12. Закрыть лигатуры VI.
13. Закрыть лигатуры VIII.
14. Свободная правая почка от соединительной Tissuе и его вложение в жировую капсулу с ножницами.
15. Обрежьте аорту проксимальнее лигатуры В.
16. Обрежьте брыжеечной артерии дистальнее лигатуры VI.
17. Разрежьте узелок почки поддерживающие судно из, следя за тем, чтобы не врезаться в самих судах.
18. Порежьте печень в связи с почками. Позаботьтесь, чтобы освободить почки, но оставить небольшую часть приверженца печени к нему, так что полая остается открытым ею.
19. Возьмите пучок из почки мыши. Отключив мышь от влажной камере.
20. Поместите "Лассо" лигатуры вокруг соединения печени и почек (лигатуры IX).
21. Вводить иглу в полую вену с венозной линии (2 см PE 50).
22. Закрыть лигатуры IX. Венозный отток через венозную линию следует немедленно начать.
23. Закройте влажную камеру.

6. Downstream Анализы

1. В течение следующего часа, непрерывно контролировать поток крови и intravasculдавление ¹⁵ соток. Собирают венозного оттока, который может быть использован для анализа, например, почечную высвобождение ренина ^7. Сбор мочи для анализа концентрации электролита и клубочковой фильтрации ^14. Через 1 час перфузии, почки могут быть быстро замораживают для вестерн - блоттинга или быть установлены для работы с изображениями приближается к ^16.

Результаты

С помощью описанной метод, изолированные почки мыши могут оставаться жизнеспособными в течение, по крайней мере 1 часа. Мы протестировали жизнеспособности тканей после 1 ч непрерывной перфузии с функциональной (почечного кровотока и сосудистого сопротивления, анализ...

Обсуждение

Мышь , изолированных перфузию почек является инструментом для изучения функции почек в контролируемой среде экс естественных условиях в течение 1 ч, преодоление разрыва между экспериментами в естественных условиях у интактных животных, которые могут быть испорчено под возд?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2901
Cannular with basket and side port	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2947
Thermostat TC120-ST5	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1 L	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3436
Pressure Transducer APT300	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3862
TAM-D Plugsys Transducer	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-1793
SCP Plugsys servo controller	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2806
Windkessel	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3717
HSE-USB data acquisition	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone	B.Braun	7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D.	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/8
Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10%	B.Braun	134518064
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	M1125-25G
Sodium-L-Lactate	Sigma-Aldrich	L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt	Sigma-Aldrich	K1875-25G
NaCl	Sigma-Aldrich	31434-1KG-R
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761-5KG
KCl	Sigma-Aldrich	60130-1KG
Urea	Sigma-Aldrich	U5378-500G
Creatinine	Sigma-Aldrich	C4255-10G
Ampicillin	Roche	10835242001
MgCl2 * 6H2O	Sigma-Aldrich	M2393-500G
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
CaCl2 * 6H2O	Riedel-de-Haën	12074
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638-500G
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP	Sigma-Aldrich	V2013-1MG
FITC-Inulin	Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration	Macherey-Nagel	MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex	Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM	FEI