Metodología para el Estudio de la transferencia horizontal de genes en<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Resumen

Se describe aquí tres protocolos diferentes para la investigación in vitro de la conjugación, transducción, transformación y natural en el Staphylococcus aureus.

Resumen

Una característica importante de la importante patógeno humano oportunista Staphylococcus aureus es su extraordinaria capacidad para adquirir rápidamente la resistencia a los antibióticos. Los estudios genómicos revelan que S. aureus lleva muchos genes de virulencia y resistencia situados en elementos genéticos móviles, lo que sugiere que la transferencia horizontal de genes (HGT) desempeña un papel crítico en la evolución S. aureus. Sin embargo, una descripción completa y detallada de la metodología utilizada para estudiar HGT en S. aureus que aún falta, especialmente en cuanto a transformación natural, que se ha informado recientemente en esta bacteria. Este trabajo describe tres protocolos que son útiles para la investigación in vitro de HGT en S. aureus: conjugación, transducción de fago, y la transformación natural. Para este objetivo, el gen CFR (cloranfenicol / resistencia florfenicol), que confiere los fenicoles, lincosamidas, oxazolidinonas, pleuromutilinas, ya la estreptogramina A (PhLOPSA) -Resistencia fenotipo, se utilizó. La comprensión de los mecanismos mediante los cuales S. aureus transfiere material genético a otras cepas es esencial para la comprensión de la rápida adquisición de resistencia y ayuda a clarificar los modos de difusión reportados en los programas de vigilancia o para predecir aún más el modo de difusión en el futuro.

Introducción

Staphylococcus aureus es una bacteria Gram-positiva comensal que habita de forma natural de la cavidad nasal y la piel de los seres humanos y animales. Esta especie bacteriana es la causa principal de las infecciones nosocomiales en los hospitales y establecimientos de salud. Además, su capacidad para desarrollar resistencia a los diferentes compuestos antimicrobianos ha hecho que el manejo de las infecciones causadas por esta bacteria en una preocupación mundial.

Se conocen dos vías principales que participan en la difusión de los fenotipos de resistencia: la diseminación clonal de genotipos resistentes y la difusión de los determinantes genéticos entre la piscina bacteriana. En el caso de S. aureus, diferentes genes de resistencia a antibióticos (así como determinantes de virulencia) se han encontrado para ser asociado con los elementos genéticos móviles (MGEs) ^1. La presencia de estos elementos en el genoma de S. aureus indica que la adquisición y transferencia de genetic materiales dentro de la población bacteriana podría desempeñar un papel importante para S. aureus adaptación y evolución.

El material genético se puede intercambiar a través de tres mecanismos bien conocidos de HGT en bacterias Gram-positivas: transformación, conjugación, y la transducción de fago. La transformación implica la captación de ADN libre. Para adquirir el ADN extraño, las células bacterianas necesitan desarrollar una fase fisiológica especial: la etapa de la competencia. Cuando se alcanza esta etapa, las células competentes son capaces de transportar ADN en el citoplasma, la adquisición de nuevos determinantes genéticos. En el caso de S. aureus, la existencia de transformación natural se ha demostrado recientemente ^2. En línea con esto, nuestro grupo ha arrojado luz sobre la relevancia de la expresión del factor de SigH (una transcripción secundaria críptica factor sigma) en la etapa de competencia de desarrollo y de cómo su expresión constitutiva hace S. aureus capaz de reaching la etapa de competencia, lo que permite la adquisición de fenotipos resistentes por transformación natural ^2.

La conjugación es un proceso que implica la transmisión de ADN de una célula viva (donante) a otra (receptor). Tanto las células deben estar en contacto directo, permitiendo que el ADN que debe intercambiarse mientras protegida por estructuras especiales, tales como tubos o poros. La transferencia de ADN por este método requiere la maquinaria conjugativo. En S. aureus, el plásmido conjugativo prototipo es PGO1, que alberga el conjugativo TraA operón ^3.

transducción de fago implica la transferencia de ADN de una célula a través de la infección del bacteriófago e implica el embalaje de ADN bacteriano, en lugar de ADN viral, en la cápside del fago. La mayoría de los aislados de S. aureus se lisogenizó por bacteriófagos ^1. Tras condiciones de estrés, prophages pueden ser extirpados del genoma bacterianoey turno al ciclo lítico.

Estos son los tres mecanismos bien conocidos para la transmisión de ADN en S. aureus. Hay algunos mecanismos de transferencia adicionales, tales como "pseudo-transformación" ² y sistemas de fagos como en la transferencia de islas de patogenicidad ^4. Recientemente, un grupo informó de que "nanotubos" están involucrados en la transferencia de materiales celulares (incluyendo el ADN plásmido) entre las células vecinas ^{5, 6,} pero un estudio de seguimiento no se ha manifestado de otros grupos hasta ahora.

Este trabajo proporciona la metodología necesaria para estudiar HGT en S. aureus, abordando las tres principales vías de transferencia de conjugación, la transducción y transformación natural. Los resultados obtenidos con estas metodologías se utilizaron para estudiar la transmisión del gen cfr (cloranfenicol / resistencia florfenicol) entre⁷ cepas de S. aureus. Estas tres técnicas son herramientas versátiles para la investigación de la transmisión MGE en S. aureus.

Protocolo

NOTA: Las cepas y los materiales utilizados en este trabajo se enumeran en la Tabla 1 y la Tabla de Materiales, respectivamente. En los experimentos de transmisión, N315 y COL cfr derivados -positivos fueron utilizados como donantes del gen cfr (N315-45 y COL-45). Estas cepas se obtuvieron previamente por conjugación, utilizando como donante de un cfr clínica -positivo cepa Staphylococcus epidermidis (ST2), siguiendo el protocolo de conjugación estándar (ver a continuación). Esta cepa albergaba el gen cfr en un plásmido pSCFS7 similar ^7.

1. Conjugación Usando el método de filtro de apareamiento

NOTA: Una cepa de S. aureus N315 que lleva el gen cfr (N315-45) ⁷ (Cm ^R) se utilizó como donante. COL ⁸ o ⁹ Mu50 cepas (Tet ^{R, S} Cm) fueron utilizados como receptores. Doble-las colonias resistentes (Tet ^R, Cm ^R) capaces de crecer en presencia de 32 mg / L de cloranfenicol y de 8 mg / L de tetraciclina fueron considerados como transconjugantes putativos y se analizaron para determinar la presencia de cfr mediante PCR de colonias y determinar la perfil de susceptibilidad destinatario.

1. Realizar conjugación siguiendo un protocolo previamente descrito ¹⁰ con algunas modificaciones:
   1. Preparar 5 ml de cultivo durante la noche de la donante y el receptor en medio tripticasa de caldo de soja (TSB) (con y sin 32 mg / l de cloranfenicol, respectivamente), con agitación a 37 ° C.
   2. Ajuste la densidad óptica (DO ₆₀₀₎ de los cultivos de una noche a 1 (OD ₆₀₀ = 1,0) mediante el uso de medio TSB fresco. Mezclar 0,5 ml del cultivo de donantes (N315-45) con 0,5 ml de la cultura receptora (COL o Mu50). Añadir 1 ml de PBS a la mezcla.
   3. Transferir la mezcla de bacterias en una membrana de filtro USI 0,45 micrasng de un sistema de bomba de vacío.
   4. Poner las membranas de filtro en una placa de agar sangre de oveja. Se incuba a 37 ° C durante 1 día.
      NOTA: En este paso, medio enriquecido es necesario para permitir el crecimiento de células de doble resistente.
   5. Sacar el filtro de membrana de la placa y suspender en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Vortex bien para recoger todas las bacterias adheridas en la membrana.
   6. Hacer una dilución de 10 veces en serie de la suspensión bacteriana mediante el uso de TSB fresco. Placa 100 l de las muestras diluidas 0-10 ^-4 en agar TSB (TSA) placas suplementadas con 32 mg / l de cloranfenicol y 8 mg / L de tetraciclina para la selección de los transconjugantes. Placa 100 l de la suspensión diluida (10 ^-5 -10 ^-6) en placas de TSA con 8 mg / L de tetraciclina solo para contar el número total de receptores. Incubar las placas a 37 ° C durante 18-24 horas.
   7. Analizar las colonias resistentes a doble (transconjugantes putativos) para detectar la presencia del cfr gen mediante PCR de colonias ⁷ y sus perfiles de sensibilidad (antibiograma).
   8. Determinar el antibiograma mediante la medición de las concentraciones inhibitorias mínimas (MICs) de los antibióticos apropiados de acuerdo con el método de método de microdilución o la difusión de disco estándar ^11. El perfil de sensibilidad de los transconjugantes debe ser idéntico al receptor, a excepción de cloranfenicol (y otros compuestos afectadas por el gen cfr). Esta determinación es esencial para descartar resistencia a la tetraciclina desarrollado por la cepa donante.

2. El fago de transducción

NOTA: El MR83a bacteriófago perteneciente a la familia Siphoviridae (laboratorio stock) se utilizó en los experimentos de transducción. N315-45 se utilizó como donante cfr para la infección del fago. N315, COL, o Mu50 cepas se utilizaron como los destinatarios. La adquisición de cfr fue determinado por el ability de la cepa receptora de crecer en presencia de 32 mg / L de cloranfenicol. Se analizaron las colonias que crecen en estas condiciones para determinar la presencia de cfr (mediante PCR de colonias) y para determinar el perfil de susceptibilidad a descartar la contaminación potencial.

1. La amplificación de fagos en el donante
   1. Preparar un cultivo de una noche de N315-45 en 5 ml de caldo nutriente suplementado con 3,6 mM ^de Ca2 ⁺ (NBCaCl ₂₎ a 37 ° C con agitación (180 rpm).
      El calcio es necesario para la infección de fagos: NOTA. Véase la Tabla de Materiales. caldo nutritivo de otras compañías podría tener problemas, tales como la precipitación de calcio.
   2. Preparar subcultivos diluyendo el cultivo durante la noche 1: 1000 en un volumen final de 10 ml de NBCaCl ₂ en frascos de vidrio de 50 ml o viales de vidrio. Cultivar las bacterias durante 1 hora a 37 ° C con agitación (180 rpm).
   3. Preparar una serie de MR83a fago diluido en NBCaCl ₂ medium (10 ^-2, 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^{-5, -6} y 10). Añadir 20 l de fago diluido en el cultivo bacteriano. También hay que preparar un cultivo de control sin infección por fagos, que sirve como control positivo para el crecimiento celular bacteriano y se puede utilizar para determinar el título del fago al día siguiente.
   4. Crecer los cultivos a 37 ° C con agitación suave (100 rpm) durante la noche.
      NOTA: Las células se crecen en cierta medida cuando el fago que infecta no está en exceso; a continuación, van a entrar en fase de lisis debido a la amplificación del fago a través del ciclo lítico. La cultura sin fago mostrará pleno crecimiento, mientras que los cultivos con fago mostrarán tasas distintas de la transparencia.
   5. Seleccionar una o dos viales de cultivo despejado con la dilución más alta del fago agregado.
   6. La transferencia de los cultivos en tubos de 15 ml de centrífuga. Añadir 250 ml de cloroformo y mezclar bien invirtiendo los tubos.
   7. Centrifugar los tubos a 5.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
   8. Transferir el sobrenadante a tubos nuevos y almacenar a 4 ° C hasta su uso.
      NOTA: El fago es estable durante al menos unos pocos meses, pero el almacenamiento de la preparación de fagos por demasiado tiempo reduce la eficiencia título y la transducción.
2. Midiendo el título del fago (ensayo de placas de fagos)
   1. Preparar agar caldo nutritivo (agar 1,5%) medio; mantenerlo caliente en un baño de agua a 55 ° C. Añadir autoclave M CaCl solución 0,5 ₂ al medio a una concentración final de 3,6 mM. Se vierte en placas de Petri de 90 mm ₍₂ NBCaCl placas).
   2. Preparar un cultivo de una noche de N315 en 5 ml de NBCaCl ₂ a 37 ° C con agitación; esto puede ser sustituido con el cultivo de control descrito anteriormente (etapa 2.1.3).
   3. Añadir 10 l de cultivo de una noche en 200 l de NBCaCl ₂ y distribuida uniformemente sobre la placa que NBCaCl _2. Detener la difusión cuando la superficie dela placa se cubre con líquido. Deje que la placa seca.
   4. Hacer una dilución en serie 1:10 (de 10 ^-5 -10 ^-10) de fago preparado anteriormente (etapa 2.1.8) usando NBCaCl medio _2.
   5. Spot 3 l de cada dilución de fago en la placa de cubierta de bacterias.
   6. Se incuba la placa durante la noche a 30 ° C.
   7. Contar el número de placa y calcular el título de fagos utilizando la siguiente ecuación: unidad formadora de placa (pfu) / ml = número de placas x factor de dilución / volumen manchado (3 x 10 ^-3 ml)
3. transducción de fago
   NOTA: La piscina fago preparado en la etapa anterior (2.1.8) se utiliza para probar la transducción del gen cfr en las cepas de S. aureus. En este experimento, las cepas N315, COL, o Mu50 se utilizan como los destinatarios.
   1. Preparar el cultivo de una noche de N315, COL, o Mu50 en 5 ml de NBCaCl ₂ a 37 ° C con agitación (180 rpm).
   2. diluir tél fago en NBCaCl ₂ a ~ 10 ⁹ pfu / mL.
   3. En un vial de vidrio de 50 ml, mezclar 500 l de cultivo durante la noche, 500 l de NBCaCl fresco _2, y 1 ml de fago (~ 10 ⁹ pfu / ml); la multiplicidad esperado de infección (MOI) no debe exceder de 1. Incubar la mezcla a 37 ° C con agitación suave (100 rpm) durante 30 min.
      NOTA: El tratamiento térmico de las células receptoras justo antes de la adición del fago (52 ° C durante 2 min para inactivar las enzimas de restricción endógenos) puede aumentar la eficiencia ^12.
   4. Añadir 50 l de 20% de Na citrato de _3. Continuar agitación suave durante 30 minutos a 37 ° C.
      NOTA: Na ₃ citrato de actúa como un quelante moderada de calcio.
   5. Preparar la infusión de cerebro y corazón derretido (BHI) agar (agar al 1,5%) a medio y guardarlo en un baño de agua a 55 ° C.
   6. Transfiera la mezcla bacteria-fago a un matraz de 100 ml, añadir 50 ml de agar BHI cálida suplementado con 32 mg / L chloramphenicol, y mezclar bien. Verter la mezcla en los platos de Petri de 90 mm.
      NOTA: Este método permite la detección de un pequeño número de colonias en crecimiento (transductantes putativo).
   7. Incubar la placa a 37 ° C durante 24-48 horas.
   8. probar aún más las colonias generadas (transductores) para la resistencia mediante la transferencia de las colonias en nuevas placas de agar BHI suplementado con 32 mg / L de cloranfenicol. Confirmar la presencia del gen cfr mediante PCR de colonias ^7.

3. Transformación Natural

NOTA: El ensayo de transformación natural en S. aureus se llevó a cabo siguiendo el método descrito en nuestro estudio anterior ^2. El derivado N315, N2-2.1 ^{2, 7,} se utilizó como receptor. En esta cepa, el locus suspiro fue duplicada de manera que se expresa constitutivamente SigH ^2. para detailed procedimientos sobre cómo aislar variantes de competencia suspiro que expresan, por favor ver la descripción anterior ^2. Si el marcador de resistencia a transferir no es cloranfenicol, pRIT-suspiro (Cm ^R) se puede utilizar para expresar suspiro, como se ha descrito anteriormente ^2. Plásmido purificada o extracto de ADN de toda cfr -acquired S. aureus COL-45 ⁷ se utiliza como el ADN donante para la transformación.

1. Preparación de ADN del donante
   1. Cultivar COL-45 durante la noche con agitación a 37 ° C en un matraz de 300 ml que contiene 50 ml de TSB suplementado con 32 mg / L de cloranfenicol. Cultivo de E. coli que lleva HST04 pHY300 plásmido ^{(Tet R)} para extraer el plásmido para el experimento de control.
      NOTA: HST04 (DAM ^- / DCM ^-) carece de la ADN metilasa genes ^13. Otras cepas convencionales con metilasas de ADN también pueden ser de usod para preparar el donante de ADN, debido a que el estado de metilación de ADN no afecta a la eficiencia de transformación. Alternativamente, pT181 plásmido purificado a partir de la cepa de S. aureus COL también se puede utilizar como un control positivo para el ensayo de transformación ^2.
   2. Recoger las células por centrifugación (8.000 xg durante 10 min a 4 ° C).
   3. Extraer los plásmidos usando un kit de extracción de ADN de plásmido o un método de purificación de ADN convencionales para purificar todo el ADN.
   4. Cuantificar el ADN purificado por el espectrómetro y conservarse a 4 ° C hasta su uso.
      NOTA: Utilice una preparación de ADN fresco para el ensayo de transformación, por lo general menos de una semana de edad. preparaciones de ADN viejo reducen la eficiencia de la transformación.
2. ensayo de transformación
   1. Cultura de la célula receptora (N2-2.1) durante la noche en 5 ml de TSB a 37 ° C con agitación.
   2. Transferir 0,5 ml de cultivo de una noche en un tubo de 1,5 ml. precipilitar las células por centrifugación (10.000 xg durante 1 min a 4 ° C).
   3. Suspender las células con 10 ml de medio CS2 en un tubo de 50 ml.
      NOTA: medio CS2 es un medio sintético completo que induce la competencia para la transformación natural en S. aureus ² (véase la composición del medio de la Tabla de materiales). Otros medios de laboratorio estándar, tales como TSB o BHI, no son adecuados para la transformación de ^{2, 13.}
   4. Cultivar las bacterias a 37 ° C con agitación (180 rpm) hasta que la fase exponencial tardía (aproximadamente 8 horas).
   5. Recoger las células por centrifugación (5.000 xg durante 5 min a 4 ° C).
   6. Resuspender las células en 10 ml de medio fresco CS2.
   7. Añadir 10 g de plásmido purificado o ADN del genoma (etapa 3.1.4) a la suspensión celular. Se agita a 37 ° C y 180 rpm durante 2,5 hr.
      NOTA: Los tiempos más cortos de incubación con ADN (<2,5 horas) como resultado transf menorormación frecuencias.
   8. Recoger las células por centrifugación (5.000 xg durante 5 min a 4 ° C).
   9. Resuspender las células en 10 ml de medio BHI. Mezclar la suspensión de células con 90 ml de agar BHI fundido (55 ° C) con suplemento de 32 mg / L de cloranfenicol (o 5 mg / L de tetraciclina en el experimento de control). Verter la mezcla en los platos de Petri de 90 mm. Rápidamente fría y dejar que el agar se solidifique.
   10. Las placas se incuban a 37 ° C durante 2 días.
   11. Replicar colonias generados (transformantes) mediante la transferencia de las colonias (utilizando palillos de dientes) a placas de agar BHI nuevas que contienen los antibióticos apropiados para confirmar sus características de resistencia. Confirmar el gen de resistencia adquirida (cfr o tetM) mediante PCR de colonias ^7.

Resultados

Los resultados representados aquí han sido publicados anteriormente (adaptado de ^la referencia ⁷ con el permiso del editor). Se estudiaron las posibles vías de transmisión del gen cfr, lo que provoca de bajo nivel de resistencia linezolid y la expresión del fenotipo PhLOPSA-resistencia ^{14, 15} en las cepas de S. aureus, mediante la investigación de tres mecanis...

Discusión

Este trabajo describe los tres métodos principales para estudiar la HGT de los determinantes genéticos en S. aureus. Aunque la transducción y conjugación se han estudiado durante décadas, la existencia de transformación natural fue reconocida sólo recientemente ^2. De este modo, S. aureus está equipado con todos los tres principales modos de HGT, y prueba de todos ellos es necesaria para aclarar las posibles vías de difusión de los determinantes genéticos. El obj...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)	Becton Dickinson	211825
Brain Heart Infusion (BHI)	Becton Dickinson	211059
Nutrient Broth No. 2	Oxoid	CM0067
Sheep blood agar	Eiken Chemical Co.,Ltd.	E-MR96	Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.
Agar powder	Wako Pure Chemical Industries	010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)	Wako Pure Chemical Industries	191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter	Merck Milipore	HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit	QIAGEN	12243