Metodologia para o Estudo da transferência horizontal de genes em<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Resumo

Descrevemos aqui três protocolos diferentes para a investigação in vitro de conjugação, transdução, transformação e natural em Staphylococcus aureus.

Resumo

Uma característica importante do grande agente patogénico humano oportunista Staphylococcus aureus é a sua capacidade extraordinária para adquirir rapidamente resistência a antibióticos. Estudos genómicos revelam que o S. aureus transporta muitos genes de virulência e resistência localizadas em elementos genéticos celulares, sugerindo que a transferência genética horizontal (HGT) desempenha um papel crítico na evolução S. aureus. No entanto, uma descrição completa e detalhada da metodologia utilizada para estudar HGT em S. aureus ainda está em falta, especialmente em relação transformação natural, que foi recentemente relatada nesta bactéria. Este trabalho descreve três protocolos que são úteis para a investigação in vitro de HGT em S. aureus conjugação, a transdução do fago, e transformação natural. Para este objectivo, o gene cfr (cloranfenicol / resistência florfenicol), que confere as fenicóis, Lincosamidas, Oxazolidinonas, pleuromutilinas, e estreptogramina A (PhLOPSA) -resistência fenótipo, foi usado. Compreender os mecanismos através dos quais S. aureus transfere material genético para outras estirpes é essencial para compreender a rápida aquisição de resistência e ajuda a esclarecer os modos de difusão relatados em programas de vigilância ou de prever ainda mais o modo de propagação no futuro.

Introdução

Staphylococcus aureus é uma bactéria Gram-positiva comensais que habita naturalmente na pele e cavidade nasal do ser humano e animais. Esta espécie bacteriana é a principal causa de infecções nosocomiais em hospitais e estabelecimentos de cuidados. Além disso, a sua capacidade de desenvolver resistência a diferentes compostos antimicrobianos fez a gestão das infecções causadas por esta bactéria em uma preocupação mundial.

Duas principais vias envolvidas na divulgação de fenótipos de resistência são conhecidos: a disseminação clonal de genótipos resistentes e de difusão dos determinantes genéticos entre a piscina bacteriana. No caso de S. aureus, diferentes genes de resistência a antibióticos (bem como determinantes de virulência) foram encontrados para ser associado com elementos genéticos móveis (EGM) ^1. A presença destes elementos no genoma de S. aureus indica que a aquisição e a transferência de genmaterial de etic dentro da população bacteriana poderia desempenhar um papel importante para a adaptação de S. aureus e evolução.

O material genético pode ser trocada através de três mecanismos bem conhecidos de HGT em bactérias Gram-positivas: transformação, conjugação e transdução do fago. Transformação envolve a absorção de DNA livre. Para adquirir DNA estranho, as células bacterianas precisam desenvolver uma fase fisiológicas especiais: a fase de competência. Quando este estado for atingido, as células competentes são capazes de transportar o DNA para o citoplasma, a aquisição de novos determinantes genéticos. No caso de S. aureus, a existência de transformação natural foi recentemente demonstrado ^2. Em consonância com isso, o nosso grupo tem lançar luz sobre a relevância da expressão do fator de suspiro (um fator sigma de transcrição secundária enigmática) na fase de competência do desenvolvimento e sobre a forma como a sua expressão constitutiva torna S. aureus capaz de reaching o estágio de competência, o que permite a aquisição de fenótipos resistentes pela transformação natural ^2.

A conjugação é um processo que envolve a transmissão de ADN a partir de uma célula viva (dador) para um outro (receptor). Ambas as células devem estar em contacto directo, permitindo que o ADN a ser trocados enquanto está a ser protegida por estruturas especiais, tais como tubos ou poros. A transferência de ADN por este método requer a maquinaria conjugativo. Em S. aureus, o plasmídeo protótipo conjugada é PGO1, que abriga o operon TRAA conjugada ^3.

O fago de transdução envolve a transferência de DNA a partir de uma célula para outra por meio da infecção de bacteriófago e implica a embalagem de ADN bacteriana, em vez do ADN virai, na cápside do fago. A maioria dos isolados de S. aureus são lysogenized por bacteriófagos ^1. Após a condições de stress, profagos pode ser excisado do genom bacterianae e mudança para o ciclo lítico.

Estes são os três mecanismos bem conhecidos para a transmissão do ADN em S. aureus. Existem alguns mecanismos de transferência adicionais, tais como "pseudo-transformação" e ^dois sistemas de fagos como na transferência de ilhas de patogenicidade ^4. Recentemente, um grupo relatou que "nanotubos" estão envolvidos na transferência de materiais celulares (incluindo ADN de plasmídeo) entre células vizinhas ^{5, 6,} mas um estudo de seguimento não apareceu a partir de outros grupos de medida.

Este trabalho apresenta a metodologia necessária para estudar HGT em S. aureus, abordando as três principais vias de transferência de conjugação, a transdução e transformação natural. Os resultados obtidos com estas metodologias foram usadas para estudar a transmissão do gene CFR (cloranfenicol / resistência florfenicol) entreS. aureus ^7. Estas três técnicas são ferramentas versáteis para a investigação de transmissão MGE em S. aureus.

Protocolo

NOTA: As estirpes e os materiais utilizados neste trabalho estão listados na Tabela 1 e a Tabela de Materiais, respectivamente. Nos experimentos de transmissão, N315 e COL cfr derivados -positivas foram usados como doadores do gene cfr (N315-45 e COL-45). Estas estirpes foram anteriormente obtidos por conjugação, utilizando como doador de um CFR clínica -positivo estirpe de Staphylococcus epidermidis (ST2), seguindo o protocolo padrão de conjugação (ver abaixo). Esta estirpe abrigavam o gene cfr em um plasmídeo pSCFS7-like ^7.

1. Conjugação Usando o método de filtro de acasalamento

NOTA: Uma estirpe de S. aureus que transporta o gene N315 CFR (N315-45) ⁷ (cm ^R) foi utilizado como o doador. COL ⁸ ou ⁹ MU50 estirpes (Tet ^{R, S} Cm) foram utilizados como os destinatários. Duplo-As colónias resistentes a (Tet ^R, CM ^R) capazes de crescer na presença de 32 mg / L de cloranfenicol e de 8 mg / L de tetraciclina foram considerados como transconjugantes putativos e foram analisados para determinar a presença de CFR por PCR de colónia e para determinar o perfil de suscetibilidade destinatário.

1. Realizar conjugação seguindo um protocolo previamente descrito ¹⁰ com algumas modificações:
   1. Prepare 5 ml de cultura de uma noite do doador e do receptor em meio de tripticase de caldo de soja (TSB) (com e sem 32 mg / L de cloranfenicol, respectivamente), com agitação a 37 ° C.
   2. Ajustar a densidade óptica (OD ₆₀₀₎ de as culturas durante a noite a 1 (OD ₆₀₀ = 1,0) usando meio TSB fresco. Misturar 0,5 ml da cultura dadora (N315-45) com 0,5 ml da cultura de receptor (COL ou MU50). Adicionar 1 mL de PBS à mistura.
   3. Transferir a mistura de bactérias para uma USI membrana de filtro de 0,45 umng um sistema de bomba de vácuo.
   4. Coloque as membranas de filtro em uma placa ovelhas agar sangue. Incubar a 37 ° C durante 1 dia.
      NOTA: Nesta etapa, o meio enriquecido é necessário para permitir o crescimento das células duplamente resistentes.
   5. Retire o filtro de membrana da placa e suspender em 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Vortex bem para recolher todas as bactérias aderidas sobre a membrana.
   6. Fazer uma diluição de 10 vezes em série da suspensão bacteriana por meio TSB fresco. Placa de 100 ul das amostras diluídas 0-10 ^-4 TSB em agar (placas TSA) suplementado com 32 mg / L de cloranfenicol e 8 mg / L de tetraciclina para a selecção de transconjugantes. Placa de 100 ul da suspensão diluída (10 ^-5 -10 ^-6) em placas de TSA com 8 mg / l de tetraciclina sozinha para contar o número total de receptores. Incubar as placas a 37 ° C durante 18-24 h.
   7. Analise colónias duplamente resistentes (transconjugantes putativos) para a presença do CFgene r pela colônia PCR ⁷ e seus perfis de susceptibilidade (antibiograma).
   8. Determinar o antibiograma, medindo as concentrações inibidoras mínimas (MICs) de antibióticos apropriados de acordo com o método de microdiluição de difusão em disco ou método padrão ^11. O perfil de sensibilidade dos transconjugantes deve ser idêntico ao receptor, excepto para o cloranfenicol (e outros compostos afectadas pelo gene CFR). Esta determinação é essencial para afastar resistência à tetraciclina desenvolvido pela estirpe doador.

2. Fago Transdução

NOTA: O bacteriófago MR83a pertencente ao (do laboratório) Siphoviridae família foi utilizado nas experiências de transdução. N315-45 foi usado como dador de CFR para a infecção por fagos. N315, COL, ou MU50 estirpes foram utilizados como receptores. A aquisição de CFR foi determinada pela abdegra da estirpe receptora de crescer na presença de 32 mg / L de cloranfenicol. Colónias que crescem sob esta condição foram analisados para determinar a presença de cfr (por colônia PCR) e determinar o perfil de sensibilidade para descartar a contaminação potencial.

1. Amplificação do fago no doador
   1. Prepara-se uma cultura durante a noite de N315-45 em 5 ml de caldo nutriente suplementado com 3,6 mM de Ca ²⁺ (NBCaCl ₂₎ a 37 ° C com agitação (180 rpm).
      NOTA: O cálcio é necessário para a infecção por fagos. Veja a Tabela de Materiais. Nutrient caldo de outras empresas podem ter problemas, tais como a precipitação de cálcio.
   2. Prepare subculturas diluindo cultura durante a noite a 1: 1000 em um volume final de 10 mL de NBCaCl ₂ em 50 ml de frascos de vidro ou frascos de vidro. Deixar crescer as bactérias durante 1 hora a 37 ° C com agitação (180 rpm).
   3. Preparar uma série de MR83a fago diluído em NBCaCl ₂ mediUM (10 ^-2, 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^{-5, -6} e 10). Adicionar 20 ul de fago diluído na cultura bacteriana. Também se preparar uma cultura de controlo sem infecção por fagos, que serve como o controlo positivo para o crescimento da célula bacteriana e pode ser utilizado para determinar o título de fagos no dia seguinte.
   4. Deixar crescer as culturas a 37 ° C com agitação suave (100 rpm) durante a noite.
      NOTA: As células irão crescer até certo ponto quando o fago infectando não está em excesso; em seguida, eles vão entrar em fase de lise devido à amplificação do fago através do ciclo lítico. A cultura sem fago vai mostrar o pleno crescimento, enquanto culturas com fago irá mostrar taxas distintas de transparência.
   5. Seleccionar um ou dois frascos de cultura limpo com a maior diluição de fago adicionado.
   6. Transferir as culturas em 15 ml de tubos de centrífuga. Adicionar 250 mL de clorofórmio e misture bem, invertendo os tubos.
   7. Centrifugar os tubos a 5000 xg durante 20 min a 4 ° C.
   8. Transfira os sobrenadantes para tubos frescos e armazená-las a 4 ° C até à sua utilização.
      NOTA: O fago é estável durante pelo menos alguns meses, mas o armazenamento a preparação de fagos para muito tempo reduz o título de transdução e eficiência.
2. Medição do título de fagos (ensaio de placas de fago)
   1. Prepare ágar caldo nutriente (1,5% de agar) meio; mantê-lo aquecido em banho-maria a 55 ° C. Adicionar autoclavada M solução de CaCl ₂ de 0,5 para o meio a uma concentração final de 3,6 mM. Derramá-la em 90 mm placas de Petri (NBCaCl ₂ placas).
   2. Prepara-se uma cultura durante a noite de N315 em 5 ml de NBCaCl ₂ a 37 ° C com agitação; este pode ser substituído com a cultura de controlo descrito acima (passo 2.1.3).
   3. Adicionar 10 ul da cultura durante a noite em 200 ul de NBCaCl ₂ e espalhar uniformemente na placa NBCaCl _2. Pare a difusão quando a superfície dea placa é coberta com líquido. Deixe a placa seca.
   4. Faça uma diluição de 1:10 de série (de 10 ^-5 -10 ^-10) de fago previamente preparado (passo 2.1.8) usando NBCaCl ₂ médio.
   5. Mancha 3 ul de cada diluição de fago para a placa coberta com bactérias.
   6. Incubar a placa durante a noite a 30 ° C.
   7. Contar o número de placas e calcular o título de fagos utilizando a seguinte equação: unidade formadora de placas (pfu) / ml = número de placas x factor de diluição / volume manchado (3 x 10 ^-3 ml)
3. transdução do fago
   NOTA: O conjunto de fagos foi preparada na etapa anterior (2.1.8) é utilizado para testar a transdução do gene CFR nas estirpes de S. aureus. Nesta experiência, as estirpes N315, COL, ou MU50 são utilizados como os destinatários.
   1. Preparar a cultura durante a noite de N315, COL, ou MU50 em 5 ml de NBCaCl ₂ a 37 ° C com agitação (180 rpm).
   2. diluir tele fago NBCaCl ₂ a ~ 10 ⁹ pfu / ml.
   3. Num frasco de vidro de 50 mL, misturar 500 ul da cultura durante a noite, a 500 ul de fresco NBCaCl _2, e 1 ml de fagos (~ 10 ⁹ pfu / ml); a multiplicidade esperado de infecção (MOI) não deve ser superior a 1. Incubar a mistura a 37 ° C com agitação suave (100 rpm) durante 30 min.
      NOTA: O tratamento térmico das células receptoras apenas antes da adição do fago (52 ° C durante 2 minutos para inactivar as enzimas de restrição endógenos) podem aumentar a eficiência de ^12.
   4. Adicionar 50 ul de 20% de Na ₃ -citrato. Continue a agitação suave durante 30 min a 37 ° C.
      NOTA: Na ₃ -citrato actua como um quelante de cálcio moderada.
   5. Prepare de agar (agar 1,5%) forma derretida de infusão cérebro-coração (BHI) e mantê-lo em um banho de água a 55 ° C.
   6. Transferir a mistura de fago-bactéria para um balão de 100 ml, adicionar 50 ml de ágar de BHI quente suplementado com 32 mg / L chloramphenicol, e misture bem. Despeje a mistura em pratos de Petri de 90 mm.
      NOTA: Este método permite a detecção de um pequeno número de colónias em crescimento (transdutantes putativos).
   7. Incubar a placa a 37 ° C durante 24-48 hr.
   8. Além disso testar as colónias geradas (transdutantes) para resistência através da transferência das colónias para novas placas de agar de BHI suplementado com 32 mg / L de cloranfenicol. Confirmar a presença do gene por PCR de colónias CFR ^7.

3. Transformação Natural

NOTA: O ensaio de transformação natural em S. aureus foi realizada seguindo o método descrito em nosso estudo prévio ^2. O derivado de N315, N2-2.1 ^{2, 7,} foi utilizado como o destinatário. Nesta estirpe, o locus suspiro foi duplicado, de modo a constitutivamente suspiro Express ^2. para detprocedimentos afligia sobre como isolar variantes de competência expressa suspiro, consulte a descrição anterior ^2. Se o marcador de resistência a ser transferida não é cloranfenicol, pRIT-suspiro (cm ^R) podem ser utilizados para expressar suspiro, como descrito anteriormente ^2. O plasmídeo purificado ou extracto de ADN inteiro de CFR adquiridas em S. aureus ^COL-7 45 é utilizado como o doador de ADN para a transformação.

1. Preparação de DNA dadora
   1. Cultivar COL-45 durante a noite com agitação a 37 ° C num balão de 300 ml contendo 50 ml de TSB suplementado com 32 mg / L de cloranfenicol. Cultura E. coli HST04 pHY300 transportando plasmídeo ^(TetR) para extrair o plasmídeo para a experiência de controlo.
      NOTA: HST04 (dam ^- / DCM ^-) não possui o DNA metilase ¹³ genes. Outras estirpes convencionais com metilases de ADN também pode ser usadod para preparar o ADN dador, porque o estado de metilação de ADN não afecta a eficácia de transformação. Alternativamente, pT181 plasmídeo purificado a partir da estirpe de S. aureus COL, também pode ser utilizado como um controlo positivo para o ensaio de transformação ^2.
   2. Recolher as células por centrifugação (8000 xg durante 10 min a 4 ° C).
   3. Extrair os plasmídeos utilizando um kit de extracção de ADN plasmídeo ou um método de purificação convencional para purificar ADN todo o ADN.
   4. Quantificar o ADN purificado por espectrómetro e mantê-lo a 4 ° C até à sua utilização.
      NOTA: Usar uma preparação de ADN fresco para o ensaio de transformação, normalmente menos de uma semana de idade. preparações de ADN de idade reduzir a eficiência da transformação.
2. ensaio de transformação
   1. Cultura da célula receptora (N2-2.1) durante a noite em 5 ml de TSB a 37 ° C com agitação.
   2. Transferir 0,5 mL da cultura durante a noite em um tubo de 1,5 ml. Precipilitar as células por centrifugação (10000 xg durante 1 min a 4 ° C).
   3. Suspender as células com 10 ml de meio de CS2 em um tubo de 50 ml.
      NOTA: medium CS2 é um meio sintético completo que induz a competência para a transformação natural em S. aureus ² (ver a composição do meio na tabela de Material). Outros meios convencionais de laboratório, tais como TSB ou BHI, não são adequados para a transformação de ^{2, 13.}
   4. Deixar crescer as bactérias a 37 ° C com agitação (180 rpm) até à fase exponencial tardia (cerca de 8 h).
   5. Colher as células por centrifugação (5000 xg durante 5 min a 4 ° C).
   6. Ressuspender as células em 10 ml de meio fresco CS2.
   7. Adiciona-se 10 ug de plasmídeo purificado de ADN ou genoma (passo 3.1.4) para a suspensão de células. Agitar a 37 ° C e 180 rpm durante 2,5 h.
      NOTA: Os tempos mais curtos de incubação com DNA (<2,5 hr) resultar em menor transffrequências ormação.
   8. Recolher as células por centrifugação (5000 xg durante 5 min a 4 ° C).
   9. Ressuspender as células em 10 ml de meio BHI. Misture a suspensão de células com 90 ml de ágar de BHI fundido (55 ° C) com suplemento de 32 mg / L de cloranfenicol (ou 5 mg / L de tetraciclina na experiência de controlo). Despeje a mistura em pratos de Petri de 90 mm. Rapidamente legal e deixar o agar solidificar.
   10. Incubar as placas a 37 ° C durante 2 dias.
   11. Replicar colônias gerados (transformantes), transferindo as colónias (usando palitos) para novas placas de agar BHI contendo os antibióticos apropriados para confirmar as suas características de resistência. Confirmar o gene de resistência adquirida (cfr ou tetM) pela colônia PCR ^7.

Resultados

Os resultados aqui representadas foram previamente publicados (adaptado da referência ⁷ com a permissão do editor). Foram estudados os potenciais vias de transmissão do gene CFR, o que faz com baixo nível de resistência de linezolida e a expressão do fenótipo de resistência ^{PhLOPSA-14, 15} em estirpes de S. aureus, investigando três mecanismos de HGT.

Discussão

Este trabalho descreve os três métodos principais para estudar a HGT de determinantes genéticos em S. aureus. Apesar de transdução e conjugação têm sido estudados há décadas, a existência de transformação natural só recentemente foi reconhecida ^2. Assim, S. aureus é equipado com todos os três principais modos de HGT, e testar todos eles é necessária para esclarecer as possíveis vias de disseminação de determinantes genéticos. O objetivo deste trabalho...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)	Becton Dickinson	211825
Brain Heart Infusion (BHI)	Becton Dickinson	211059
Nutrient Broth No. 2	Oxoid	CM0067
Sheep blood agar	Eiken Chemical Co.,Ltd.	E-MR96	Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.
Agar powder	Wako Pure Chemical Industries	010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)	Wako Pure Chemical Industries	191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter	Merck Milipore	HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit	QIAGEN	12243