Методика изучения горизонтальных генного переноса в<em&gt; Стафилококк</em

Резюме

Мы опишем здесь три различные протоколы для исследования в пробирке конъюгации, трансдукции и естественной трансформации в золотистый стафилококк.

Аннотация

Одной важной особенностью основных оппортунистических патогеном человека золотистый стафилококк является его исключительная способность быстро приобретают устойчивость к антибиотикам. Геномные исследования показывают , что S. стафилококк несет множество генов вирулентности и сопротивления , расположенные в мобильных генетических элементов, предполагая , что горизонтальный перенос генов (HGT) играет важную роль в эволюции золотистого стафилококка. Тем не менее, полное и подробное описание методологии , используемой для изучения HGT в золотистого стафилококка до сих пор отсутствует, особенно в отношении естественное преобразование, которое было недавно сообщалось в этой бактерии. Эта работа описывает три протокола, которые полезны для экстракорпоральное исследования ХГТ в золотистого стафилококка: конъюгации, трансдукции фагом и естественной трансформации. С этой целью, ген ЧФР (хлорамфеникол / сопротивления флорфеникол), которое дает Phenicols, Lincosamides, Оксазолидиноны, плевромутилины и стрептограминов А (PhLOPSА) -resistance фенотипом, был использован. Понимание механизмов , посредством которых золотистого стафилококка трансферты генетические материалы других штаммов имеет важное значение для осмысления быстрое приобретение сопротивления и помогает уточнить режимы распространения , представленные в программах наблюдения или для дальнейшего прогнозирования режима расширения в будущем.

Введение

Золотистый стафилококк является синантропных грамположительные бактерии , которые , естественно , населяет кожу и носовую полость человека и животных. Этот бактериальный вид является основной причиной внутрибольничных инфекций в больницах и медицинских учреждениях. Кроме того, его способность к развитию устойчивости к различным антимикробным соединений сделало управление инфекций, вызванных этой бактерией в глобальную озабоченность.

Два основных пути, участвующие в распространении фенотипов сопротивления известны: клонального распространение устойчивых генотипов и распространения генетических детерминант среди бактерий бассейна. В случае золотистого стафилококка, различных генов устойчивости к антибиотикам (а также вирулентности детерминанты) , как было установлено, связаны с мобильными генетическими элементами (МГЭС) ^1. Наличие этих элементов в геноме золотистого стафилококка указывает на то, что приобретение и передача генэтический материал в популяции бактерий может играть важную роль для адаптации стафилококка S. и эволюции.

Генетический материал может быть обменен через три хорошо известных механизмов ХГТ в грам-положительных бактерий: трансформации, конъюгации и трансдукции фага. Трансформация предполагает поглощение свободной ДНК. Для того, чтобы приобрести чужеродную ДНК, бактериальные клетки необходимо разработать специальную физиологическую фазу: стадия компетенции. При достижении этой стадии компетентные клетки способны транспортировать ДНК в цитоплазму, приобретая новые генетические детерминанты. В случае золотистого стафилококка, существование естественной трансформации было недавно продемонстрировано ^2. В соответствии с этим, наша группа пролить свет на актуальность экспрессии фактора Вздох (зашифрованное вторичный фактор транскрипции Sigma) в стадии развития компетентности и о том , как его экспрессия гена оказывает золотистого стафилококка , способный Reachinг стадия компетентности, которая позволяет на приобретение устойчивых фенотипов путем естественной трансформации ^2.

Сопряжение представляет собой процесс, включающий передачу ДНК из одной живой клетки (донора) к другому (получателю). Обе клетки должны находиться в непосредственном контакте, позволяя ДНК, подлежащей обмену в то время как защищен специальными составами, такими как трубы или поры. Перенос ДНК с помощью этого метода требует конъюгативная машины. В золотистого стафилококка, плазмиды прототип конъюгативная является PGO1, который таит в себе конъюгативных оперона Traa ^3.

Фаг трансдукция включает в себя перенос ДНК от клетки к клетке через бактериофага инфекции и подразумевает упаковку бактериальной ДНК, вместо вирусной ДНК, в фага капсида. Большинство из золотистого стафилококка изолятов lysogenized бактериофагами ^1. При стрессовых условиях, профаги может быть вырезан из бактериального геномае и сдвиг в сторону литического цикла.

Это три хорошо известные механизмы передачи ДНК в золотистого стафилококка. Есть некоторые дополнительные механизмы передачи, такие как "псевдо-трансформация» ² и фаг-подобных систем в передаче патогенности островов ^4. Недавно одна группа сообщила , что "Нанотрубки" участвуют в передаче клеточных материалов ( в том числе плазмидной ДНК) между соседними клетками ^{5, 6,} но последующие исследования не появился из других групп до сих пор.

Эта работа обеспечивает необходимую методологию для изучения HGT в золотистого стафилококка путем решения трех основных путей передачи: конъюгация, трансдукция, и естественное преобразование. Результаты , полученные с помощью этих методик были использованы для изучения передачи СМО гена (хлорамфеникол / сопротивления флорфеникол) средиЗолотистого стафилококка штаммы ^7. Эти три метода являются универсальными инструментами исследования передачи MGE в золотистого стафилококка.

протокол

Примечание: штаммы и материалы , используемые в этой работе, приведены в таблице 1 и таблице материалов, соответственно. В экспериментах по передаче, N315 и COL ЧФР -позитивных производные были использованы в качестве доноров СМО гена (N315-45 и Col-45). Эти штаммы были ранее получены путем конъюгации, с использованием в качестве донора клинической -положительным Staphyloccocus CFR эпидермидис штамм (ST2), в соответствии со стандартным протоколом сопряжению (см ниже). Этот штамм таил СМО ген на pSCFS7-подобной плазмиды ^7.

1. Сопряжение Использование метода Filter-ответная

Примечание: штамм золотистого стафилококка N315 , несущий ген (КФП) N315-45 ⁷ (Cm ^R) использовали в качестве донора. COL ⁸ или Mu50 ⁹ штаммов (TET ^{R, S)} Cm использовались в качестве реципиентов. ДвойнымКолонии , устойчивые к (Tet ^R, Cm ^R) , способны расти в присутствии 32 мг / л хлорамфеникола плюс 8 мг / л тетрациклина рассматривались в качестве предполагаемых трансконъюгантов и анализировали для определения наличия СМО с помощью ПЦР колоний и для определения получатель восприимчивость профиль.

1. Выполните сопряжение после описанного выше протокола ¹⁰ с некоторыми изменениями:
   1. Подготовка 5 мл ночной культуры донора и реципиента в трипсиновый соевый бульон (ТСБ) в среде (с и без 32 мг / л хлорамфеникола, соответственно), при встряхивании при 37 ° C.
   2. Регулировка оптической плотности (OD ₆₀₀₎ из ночных культур до 1 (OD ₆₀₀ = 1,0) с использованием свежей TSB среды. Смешать 0,5 мл культуры-донора (N315-45) с 0,5 мл культуры-реципиента (COL или Mu50). Добавьте 1 мл PBS к смеси.
   3. Перенести смесь бактерий на 0,45 мкм мембранный фильтр USI внг систему вакуумного насоса.
   4. Положите фильтр мембраны на овца кровяным агаром. Инкубируют при 37 ° С в течение 1 дня.
      Примечание: На этом этапе, обогащенная среда необходима для обеспечения роста двойных резистентных клеток.
   5. Вынуть мембрану фильтра из пластины и приостановить в 10 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Vortex хорошо, чтобы собрать все бактерии, прикрепленные на мембране.
   6. Сделать серийные 10-кратное разведение бактериальной суспензии с использованием свежей TSB. Пластина 100 мкл воды 0-10 ^-4 разведенных образцов на TSB агар (TSA) пластины , дополненной 32 мг / л хлорамфеникола и 8 мг / л тетрациклина для выбора трансконъюгатов. Пластина 100 мкл разведенной суспензии (10 ^-5 -10 ^-6) на TSA пластинах с использованием только 8 мг / л тетрациклина , чтобы подсчитать общее число получателей. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 18-24 ч.
   7. Анализ двойных устойчивые колонии (мнимые трансконъюгантов) на наличие КФген г путем ПЦР колоний ⁷ и их профили восприимчивости (антибиограммой).
   8. Определить Antibiogram путем измерения минимальной подавляющей концентрации (МИКО) соответствующих антибиотиков в соответствии со стандартным методом микроразведений или диффузионного диска методом ^11. Профиль восприимчивость трансконъюгантов должна быть идентична получателю, за хлорамфеникол (и других соединений , пострадавших от гена КФП) за исключением того . Это определение имеет важное значение, чтобы исключить устойчивость к тетрациклину, разработанной штамма-донора.

2. Фаг Трансдукция

ПРИМЕЧАНИЕ: бактериофаг MR83a , принадлежащий к семейству Siphoviridae (лабораторный запас) был использован в экспериментах трансдукции. N315-45 был использован в качестве донора для КФП фаговой инфекции. N315, COL, или Mu50 штаммы были использованы в качестве реципиентов. Приобретение СМО была определена абility штамма-реципиента расти в присутствии 32 мг / л хлорамфеникола. Колонии , растущие в этих условиях были проанализированы , чтобы определить наличие СМО (по ПЦР колоний) и для определения профиля чувствительности , чтобы исключить возможность загрязнения.

1. Фаг усиление на донора
   1. Подготовка ночной культуры N315-45 в 5 мл питательного бульона с добавлением 3,6 мМ Ca ²⁺ (NBCaCl ₂₎ при 37 ° C при встряхивании (180 оборотов в минуту).
      Примечание: Кальций необходим для фаговой инфекции. См Материалы табл. Питательный бульон из других компаний могут возникнуть проблемы, такие как осаждение кальция.
   2. Готовят субкультуры путем разбавления в течение ночи культуры в соотношении 1: 1000 в конечном объеме 10 мл NBCaCl ₂ в 50 мл стеклянных флаконах или стеклянных флаконах. Grow бактерии в течение 1 часа при 37 ° C при встряхивании (180 оборотов в минуту).
   3. Приготовьте серию разбавленных фага MR83a в NBCaCl ₂ лечебгм (10 ^-2, 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^-5 и 10 ^-6). Добавьте 20 мкл разведенных фага в бактериальную культуру. Также приготовьте культуру управления без фаговой инфекции, которая служит в качестве положительного контроля роста бактериальных клеток и может быть использован для определения титра фага на следующий день.
   4. Grow культур при температуре 37 ° С при осторожном встряхивании (100 оборотов в минуту) в течение ночи.
      Примечание: Клетки будут расти в некоторой степени, когда вдувания фага не превышает; то, что они войдут в фазу лизиса за счет усиления фага через цикл литической. Культура без фага покажет полный рост, в то время как культуры с фага покажет различные показатели прозрачности.
   5. Выберите один или два освобоженные ампул культуры с наибольшим разведением добавленного фага.
   6. Передача культуры в 15 мл центрифужные пробирки. Добавить 250 мкл хлороформа и тщательно перемешать переворачиванием пробирки.
   7. Центрифуга труб в 5000 XG в течение 20 мин при температуре 4 ° С.
   8. Передача супернатанты в свежие пробирки и хранить их при температуре 4 ° С до использования.
      Примечание: Фаг стабилен в течение по крайней мере несколько месяцев, но хранить препарат фага слишком долго снижает эффективность титра и трансдукции.
2. Измерение титра фага (анализ бляшек фага)
   1. Приготовьте питательный бульон, агар (1,5% агар) среды; держать его в тепле в водяной бане при температуре 55 ° C. Добавить автоклавированы 0,5 ₂ М раствора CaCl к среде до конечной концентрации 3,6 мМ. Налейте его в 90 мм чашки Петри (NBCaCl ₂ пластин).
   2. Подготовка ночной культуры N315 в 5 мл NBCaCl ₂ при 37 ° C при встряхивании; это может быть замещена культурой управления, описанной выше (этап 2.1.3).
   3. Добавьте 10 мкл в течение ночи культуры в 200 мкл NBCaCl ₂ и равномерно распределены на тарелку NBCaCl _2. Остановить распространение, когда поверхностьпластина покрыта жидкостью. Пусть пластины в сухом состоянии.
   4. Сделать серийный разведение 1:10 (от 10 ^-5 -10 ^-10) из предварительно полученного фага (этап 2.1.8) с использованием NBCaCl ₂ среды.
   5. Точечный 3 мкл каждого фагового разбавления на пластину, покрытую бактериями.
   6. Инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 30 ° C.
   7. Подсчитайте число бляшек и расчета титра фага , используя следующее уравнение: бляшкообразующих единицы (КОЕ) / мл = число бляшек х фактор Разбавление / пятнистый объем (3 × 10 ^-3 мл)
3. Фаг трансдукции
   ПРИМЕЧАНИЕ: фаг пула , полученного на предыдущей стадии (2.1.8) используется для проверки трансдукцию СМО гена в штаммы золотистого стафилококка. В этом эксперименте штаммы N315, COL, или Mu50 используются в качестве получателей.
   1. Подготовка ночной культуры N315, COL или Mu50 в 5 мл NBCaCl ₂ при 37 ° С при встряхивании (180 оборотов в минуту).
   2. Развести тон фаговых в NBCaCl ₂ до ~ 10 ⁹ БОЕ / мл.
   3. В стеклянную пробирку емкостью 50 мл, смешивают 500 мкл ночной культуры, 500 мкл свежей NBCaCl _2, и 1 мл фага (~ 10 ⁹ БОЕ / мл); ожидаемая множественность инфекции (MOI) не должна превышать 1. Выдержите смесь при температуре 37 ° С при осторожном встряхивании (100 оборотов в минуту) в течение 30 мин.
      Примечание: Термическая обработка клеток - реципиентов непосредственно перед добавлением фага (52 & deg ; С в течение 2 мин , чтобы инактивировать эндогенной рестриктаз) может увеличить эффективность ^12.
   4. Добавляют 50 мкл 20% Na ₃ -Citrate. Продолжайте осторожном встряхивании в течение 30 мин при 37 ° С.
      Примечание: На ₃ -Citrate действует как умеренное хелатор кальция.
   5. Приготовьте расплавленное сердечно-мозговой инфузии (BHI) агар (1,5% агар) среду и держать его на водяной бане при температуре 55 ° C.
   6. Перенести бактерия-фага смесь в колбу емкостью 100 мл, добавляют 50 мл теплой BHI агаром, дополненной 32 мг / л chloramphenicol, и хорошо перемешать. Вылейте смесь в чашки Петри 90 мм.
      Примечание: Этот метод позволяет обнаруживать небольшое число растущих колоний (мнимые трансдуктанты).
   7. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 24-48 ч.
   8. Дальнейшее тестирование сгенерированные колонии (трансдуктанты) для сопротивления путем переноса колоний на новые BHI чашки с агаром, дополненной 32 мг / л хлорамфеникола. Подтвердить наличие СМО гена с помощью ПЦР колонии ^7.

3. Природные трансформации

Примечание: Естественный анализ трансформации в S.aureus , проводилась в соответствии с методом , описанным в предыдущем исследовании ^2. Производная N315, N2-2.1 ^{2, 7,} был использован в качестве получателя. В этом штамме Вздох локус продублированы таким образом , чтобы конститутивно экспрессируют вздыхать ^2. Для йеболело процедуры о том , как изолировать вздыхать экспрессирующие варианты компетентности, пожалуйста , см предыдущее описание ^2. Если сопротивление маркер для передачи не хлорамфеникол, Прит-SIGH (Cm ^R) , могут быть использованы для экспрессии вздыхать, как описано выше ^2. Плазмидной или весь экстракт ДНК из СМО -acquired золотистого стафилококка COL-45 ⁷ используется в качестве донорной ДНК для трансформации.

1. Получение ДНК - донора
   1. Выращивают COL-45 в течение ночи при встряхивании при 37 ° С в 300 мл колбу, содержащую 50 мл TSB, дополненной 32 мг / л хлорамфеникола. Культура кишечной палочки HST04 проведения pHY300 плазмида ^{(Tet R)} , для извлечения плазмиды для контрольного эксперимента.
      Примечание: HST04 (дамба ^- / ДХМ ^-) не хватает ДНК метилазы генов ^13. Другие традиционные штаммы с метилаз ДНК также могут быть использованыd подготовить Донор ДНК, так как состояние метилирование ДНК не влияет на эффективность трансформации. В качестве альтернативы, pT181 плазмида очищенный из штамма золотистого стафилококка COL также может быть использован в качестве положительного контроля для анализа трансформации ^2.
   2. Собирают клетки центрифугированием (8000 х г в течение 10 мин при 4 ° С).
   3. Извлечение плазмид с использованием набора для экстракции плазмидной ДНК или обычный способ очистки ДНК, чтобы очистить всю ДНК.
   4. Количественная очищенной ДНК с помощью спектрометра и держать его при температуре 4 ° С до использования.
      Примечание: Используйте свежий препарат ДНК для анализа трансформации, обычно менее одной недели старой. Препараты ДНК Старый снижают эффективность трансформации.
2. Трансформация анализа
   1. Культура клетке реципиента (N2-2.1) в течение ночи в 5 мл TSB при 37 ° C при встряхивании.
   2. Перенести 0,5 мл ночной культуры в 1,5 мл пробирку. PrecipiTate клетки центрифугированием (10000 х г в течение 1 мин при 4 ° С).
   3. Суспендирования клеток с 10 мл CS2 среды в 50 мл пробирку.
      Примечание: CS2 среда представляет собой полное синтетическая среда , которая вызывает компетентность для естественной трансформации золотистого стафилококка ² (см состав среды в материале таблице). Другие стандартные лабораторные носители, такие как TSB или BHI, не подходят для трансформации ^{2, 13.}
   4. Grow бактерий при температуре 37 ° C при встряхивании (180 оборотов в минуту) до поздней экспоненциальной фазы (около 8 часов).
   5. Сбора клеток центрифугированием (5000 х г в течение 5 мин при 4 ° С).
   6. Ресуспендируют клеток в 10 мл свежей среды CS2.
   7. Добавляют 10 мкг очищенной плазмиды или геномной ДНК (этап 3.1.4) к клеточной суспензии. Взболтать при температуре 37 ° C и 180 оборотов в минуту в течение 2,5 ч.
      Примечание: Более короткое время инкубации с ДНК (<2,5 ч) приводит к снижению элеменЧастоты ormation.
   8. Собирают клетки центрифугированием (5000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С).
   9. Ресуспендируют клеток в 10 мл BHI среды. Смешайте клеточной суспензии с 90 мл расплавленного BHI агаром (55 ° C), добавка с 32 мг / л хлорамфеникола (или 5 мг / л тетрациклина в контрольном опыте). Вылейте смесь в чашки Петри 90 мм. Стремительно круто и агар затвердеть.
   10. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 2-х дней.
   11. Репликация сгенерированные колонии (трансформантов) путем переноса колоний (с помощью зубочистки) новым BHI агаром, содержащих соответствующие антибиотики, чтобы подтвердить свои характеристики сопротивления. Подтвердите приобретенный ген устойчивости (летальность или tetM) по колонии PCR ^7.

Результаты

Результаты , представленные здесь , были опубликованы ранее (адаптировано из ссылки ⁷ с разрешения издателя). Мы изучили возможные пути передачи гена ЧФР, что приводит к низкоуровневой линезолид сопротивление и экспрессию PhLOPSA сопротивления фенотипа ...

Обсуждение

Эта работа описывает три основных метода для изучения HGT генетических детерминант в золотистого стафилококка. Хотя трансдукции и конъюгации были изучены в течение многих десятилетий, существование естественной трансформации лишь недавно был признан ^2. Таким обра...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)	Becton Dickinson	211825
Brain Heart Infusion (BHI)	Becton Dickinson	211059
Nutrient Broth No. 2	Oxoid	CM0067
Sheep blood agar	Eiken Chemical Co.,Ltd.	E-MR96	Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.
Agar powder	Wako Pure Chemical Industries	010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)	Wako Pure Chemical Industries	191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter	Merck Milipore	HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit	QIAGEN	12243