Methodik für die Studie des horizontalen Gentransfers in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier drei verschiedene Protokolle für die in vitro Untersuchung der Konjugation, Transduktion, Transformation und natürliche in Staphylococcus aureus.

Zusammenfassung

Ein wichtiges Merkmal der wichtigsten opportunistischen Humanpathogen Staphylococcus aureus ist seine außerordentliche Fähigkeit, schnell eine Resistenz gegen Antibiotika zu erwerben. Genomic Studien zeigen , daß S. aureus trägt viele Virulenz und Resistenzgene in mobilen genetischen Elementen befindet, was darauf hindeutet , dass der horizontale Gentransfer (HGT) spielt eine kritische Rolle in S. aureus Evolution. Jedoch eine vollständige und detaillierte Beschreibung der Methode zu untersuchen HGT in S. aureus verwendet noch fehlt, insbesondere in Bezug auf natürliche Transformation, die in diesem Bakterium kürzlich berichtet wurde. Diese Arbeit beschreibt drei Protokolle , die für die in vitro Untersuchung der HGT in S. aureus geeignet sind , Konjugation, Phagentransduktion und natürliche Transformation. Zu diesem Zweck das cfr - Gen (Chloramphenicol / Florfenicol Widerstand), die die Phenicolen verleiht, Lincosamides, Oxazolidinone, Pleuromutilinen und Streptogramin A (PhLOPSA) -Widerstand Phänotyp, verwendet wurde. Die Mechanismen , durch die S. aureus genetischen Materialien auf andere Stämme über zu verstehen ist wesentlich , um die schnelle Erfassung des Widerstands Begreifen und hilft , die Arten der Verbreitung berichtet in Überwachungsprogrammen oder zur weiteren Vorhersage der Ausbreitung Modus in der Zukunft zu klären.

Einleitung

Staphylococcus aureus ist ein symbiotischer Gram-positive Bakterien, die die Haut und Nasenhöhle von Menschen und Tieren natürlich bewohnt. Diese Bakterienarten ist die häufigste Ursache von nosokomialen Infektionen in Krankenhäusern und medizinischen Einrichtungen. Darüber hinaus seine Fähigkeit, Widerstand gegen verschiedene antimikrobielle Verbindungen zu entwickeln, hat die Verwaltung der Infektionen durch dieses Bakterium in eine globale Besorgnis hervorgerufen hat.

Zwei Hauptwege, die an der Verbreitung der Resistenz-Phänotypen sind bekannt: die klonale Verbreitung von resistenten Genotypen und die Verbreitung von genetischen Determinanten unter den bakteriellen Pool. Im Fall von S. aureus, verschiedene antibiotische Resistenzgene (sowie Virulenzdeterminanten) wurden gefunden mit mobilen genetischen Elementen (MGEs) ¹ zugeordnet werden. Das Vorhandensein dieser Elemente in das Genom von S. aureus zeigt , dass die Übernahme und Übergabe von Genetic Material innerhalb der Bakterienpopulation könnte eine wichtige Rolle für S. aureus Anpassung und Entwicklung spielen.

Transformation, Konjugation und Transduktion Phage: genetisches Material kann durch drei bekannte Mechanismen der HGT in Gram-positive Bakterien ausgetauscht werden. Transformation beinhaltet die Aufnahme von freier DNA. Zum Erwerb von Fremd-DNA, müssen Bakterienzellen eine besondere physiologische Phase zu entwickeln: die Kompetenz der Bühne. Wenn dieses Stadium erreicht ist, werden kompetente Zellen, die DNA in das Cytoplasma transportieren, neue genetische Determinanten erwerben. Im Fall von S. aureus, die Existenz von natürlichen Transformation kürzlich ² nachgewiesen wurde. Im Einklang damit hat unsere Gruppe Licht auf die Relevanz der Expression des Seufzen Faktor Schuppen (ein kryptischer Faktor sekundäre Transkription Sigma) in der Kompetenz Stufe der Entwicklung und darüber , wie seine konstitutive Expression S. aureus von reachin fähig machtg die Kompetenz Stufe, die ² für den Erwerb von resistenten Phänotypen durch natürliche Transformation ermöglicht.

Konjugation ist ein Prozess, der die Übertragung von DNA aus einer lebenden Zelle (Spender) zu einem anderen (Empfänger). Beide Zellen müssen in direktem Kontakt sein, so dass die DNA ausgetauscht werden, während sie durch spezielle Strukturen geschützt werden, wie beispielsweise Rohre oder Poren. Der Transfer von DNA durch dieses Verfahren erfordert die konjugativen Maschinen. In S. aureus, ist der Prototyp konjugativen Plasmids PGO1, die den konjugativen Operon TraA ³ beherbergt.

Phagentransduktion beinhaltet den Transfer von DNA von Zelle zu Zelle durch Bakteriophageninfektion und impliziert die Verpackung von bakterieller DNA, viraler DNA statt, in die Phagen-Capsid. Die meisten von S. aureus - Isolate werden von Bakteriophagen ¹ lysogeniert. Bei Stressbedingungen kann Prophagen aus dem bakteriellen Genom herausgeschnitten werdene und Schalten in den lytischen Zyklus.

Dies sind die drei bekannten Mechanismen für die DNA Übertragung in S. aureus. Es gibt einige zusätzliche Transfermechanismen, beispielsweise "pseudo-Transformation" ² und Phagen-ähnlichen Systemen in der Übertragung von Pathogenitätsinseln ^4. Vor kurzem berichteten eine Gruppe , dass "Nanoröhren" bei der Übertragung von zellulären Materialien beteiligt sind (einschließlich Plasmid - DNA) zwischen benachbarten Zellen ^{5, 6,} aber ein Follow-up - Studie wurde von anderen Gruppen bisher nicht erschienen.

Diese Arbeit stellt die notwendige Methodik HGT in S. aureus zu studieren , indem sie die drei wichtigsten Übertragungswege Adressierung Konjugation, Transduktion und natürliche Transformation. Die Ergebnisse mit diesen Methoden gewonnen wurden verwendet , um die Übertragung des cfr - Gen (Chloramphenicol / Florfenicol Widerstand) zu studieren , unterS. aureus - Stämme ^7. Diese drei Techniken sind vielseitige Werkzeuge für die Untersuchung von MGE Übertragung in S. aureus.

Protokoll

HINWEIS: Die Stämme und Materialien , die in dieser Arbeit sind in Tabelle 1 und die Tabelle der Materialien aufgeführt sind. In den Übertragungsversuchen, N315 und COL cfr -positiver Derivate wurden als Spender des GRR - Gens (N315-45 und COL-45) verwendet. Diese Stämme wurden zuvor durch Konjugation erhalten, wobei als Spender einer klinischen cfr -positiver Staphylococcus epidermidis - Stamm (ST2), im Anschluss an die Standard - Konjugation Protokoll (siehe unten). Dieser Stamm beherbergte das cfr - Gen auf einem pSCFS7 artigen Plasmid ^7.

1. Konjugation Verwendung der Filter-Mating-Methode

HINWEIS: Ein S. aureus - Stamm N315 Durchführung des cfr - Gen (N315-45) ⁷ (Cm ^R) wurde als Spender verwendet. COL ⁸ oder ⁹ MU50 - Stämme (Tet ^R, Cm ^S) wurden als Empfänger verwendet. Doppelt-Lage - resistente Kolonien (Tet ^R, Cm ^R) in Gegenwart von 32 mg / l Chloramphenicol plus 8 mg / l Tetracyclin wachsen wurden als putative Transkonjuganten angesehen und die Anwesenheit von cfr durch Kolonie - PCR zu bestimmen , analysiert , und das zu bestimmen Empfänger Anfälligkeit Profil.

1. Führen Konjugation nach einem zuvor beschriebenen Protokoll ¹⁰ mit einigen Änderungen:
   1. Bereiten Sie 5 ml über Nacht Kultur des Spenders und des Empfängers in CASO-Bouillon (TSB) Medium (mit und ohne 32 mg / l Chloramphenicol, jeweils) mit bei 37 ° C schüttelnd.
   2. Stellen Sie die optische Dichte (OD ₆₀₀₎ der Übernachtkulturen bis 1 (OD ₆₀₀ = 1,0) durch frische TSB Medium. Mischungs 0,5 ml der Spenderkultur (N315-45) mit 0,5 ml des Empfängerkultur (COL oder MU50). 1 ml PBS zu dem Gemisch.
   3. Übertragen Sie die Mischung von Bakterien auf einen 0,45 & mgr; m Filtermembran using ein Vakuumpumpsystem.
   4. Setzen Sie die Filtermembranen auf einem Schafsblutagarplatte. 1 Tag bei 37 ° C inkubieren.
      HINWEIS: In diesem Schritt angereicherten Medium notwendig ist, das Wachstum von doppelt-resistenten Zellen zu ermöglichen.
   5. Mit der Filtermembran von der Platte und in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) suspendieren. Vortex gut alle angeschlossenen Bakterien auf der Membran zu sammeln.
   6. Machen Sie eine serielle 10-fache Verdünnung der Bakteriensuspension durch frische TSB verwendet wird. Platte 100 ul der verdünnten Proben 0-10 ^-4 auf TSB - Agar (TSA) Platten mit 32 mg / l Chloramphenicol und 8 mg / L Tetracyclin zur Selektion von Transkonjuganten ergänzt. Platte 100 ul der verdünnten Suspension (10 ^-5 -10 ^-6) auf TSA - Platten mit 8 mg / l Tetracyclin allein die Gesamtzahl der Empfänger zu zählen. Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 18-24 Std.
   7. Analysieren doppelt resistenten Kolonien (putative Transkonjuganten) für die Anwesenheit des cfr - Gens durch Kolonie - PCR ⁷ und ihre Anfälligkeit Profile (Antibiogramm).
   8. Bestimmen Sie die Antibiogramm durch die minimalen Hemm - Konzentrationen (MHK) von geeigneten Antibiotika nach dem Standard Mikrodilutionsverfahren oder Plattendiffusionsverfahren ^11. Die Anfälligkeit Profil der Transkonjuganten muss dem Empfänger identisch sein, mit Ausnahme von Chloramphenicol (und andere Verbindungen , die durch die cfr Gen betroffen). Diese Bestimmung ist wichtig, Tetrazyklin-Resistenz durch die Spenderstamm entwickelt, um auszuschließen.

2. Phagentransduktion

HINWEIS: Der Bakteriophage MR83a Zugehörigkeit zur Siphoviridae Familie (Labor stock) wurde in den Transduktionsexperimente verwendet. N315-45 wurde als cfr Spender für Phagen - Infektion eingesetzt. N315, COL oder MU50-Stämme wurden als Empfänger verwendet. Der Erwerb von cfr wurde durch die ab bestimmtility des Empfängerstamm in Gegenwart von 32 mg / l Chloramphenicol zu wachsen. Kolonien unter diesen Bedingungen wuchsen , wurden analysiert , um die Anwesenheit von cfr (durch Kolonie - PCR) zu bestimmen und die Suszeptibilität Profil zu bestimmen potentielle Kontamination auszuschließen.

1. Phagenamplifikation auf dem Donator
   1. Bereiten Sie eine Nacht - Kultur von N315-45 in 5 ml Nährlösung , ergänzt mit 3,6 mM Ca ²⁺ (NBCaCl ₂₎ bei 37 ° C unter Schütteln (180 rpm).
      HINWEIS: Kalzium wird für Phageninfektion erforderlich. Sehen Sie sich die Werkstoff - Tabelle. Nährlösung von anderen Unternehmen könnten Probleme haben, wie Calciumniederschlag.
   2. Bereiten Subkulturen durch die Übernachtkultur verdünnt 1: 1.000 in einem Endvolumen von 10 ml NBCaCl ₂ in 50 ml Glasflaschen oder Glasampullen. Wachsen die Bakterien für 1 Stunde bei 37 ° C unter Schütteln (180 rpm).
   3. Bereiten Sie eine Reihe von verdünnten Phagen MR83a in NBCaCl ₂ medium (10 ^-2, 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^-5 und 10 ^-6). Geben Sie 20 & mgr; l des verdünnten Phagen in die Bakterienkultur. ferner einen Kontrollkultur ohne Phageninfektion, die für das Bakterienzellwachstum als positive Kontrolle dient und verwendet werden kann, die Phagentiter am nächsten Tag zu bestimmen.
   4. Wachsen die Kulturen bei 37 ° C unter leichtem Schütteln (100 rpm) über Nacht.
      HINWEIS: Die Zellen in einem gewissen Ausmaß wachsen, wenn das infizierende Phage nicht im Überschuss vorhanden ist; Dann werden sie in Lyse Phase eintreten aufgrund der Phagenamplifikation durch den lytischen Zyklus. Die Kultur ohne Phagen wird die volle Wachstum zeigen, während Kulturen mit Phagen unterschiedliche Raten der Transparenz zeigen.
   5. Wählen Sie eine oder zwei gelöscht Kulturfläschchen mit der höchsten Verdünnung des zugegebenen Phagen.
   6. Übertragen Sie die Kulturen in 15 ml Zentrifugenröhrchen. In 250 ul Chloroform und gründlich mischen durch die Rohre zu invertieren.
   7. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 5000 xg für 20 min bei 4 ° C.
   8. Die Überstände in frische Röhrchen und lagern Sie sie bei 4 ° C bis zur Verwendung.
      HINWEIS: Die Phagen für mindestens ein paar Monate stabil ist, aber zu lange die Phagenpräparation Speicherung reduziert die Titer und Transduktionseffizienz.
2. Die Messung des Phagen - Titer (Phagen - Plaque - Test)
   1. Bereiten Sie Nährlösung Agar (1,5% Agar) Medium; halten Sie es bei 55 ° C in einem Wasserbad warm. Hinzufügen autoklavierten 0,5 M CaCl & _sub2 ; -Lösung zu dem Medium bis zu einer Endkonzentration von 3,6 mM. Gießen Sie es in 90 mm Petrischalen (NBCaCl ₂ Platten).
   2. Bereiten Sie eine Nacht - Kultur von N315 in 5 ml NBCaCl ₂ bei 37 ° C unter Schütteln; dies kann mit der Kontrollkultur ersetzt werden oben beschrieben (Schritt 2.1.3).
   3. In 10 ul der Übernachtkultur in 200 ul NBCaCl ₂ und gleichmäßig verteilt auf die NBCaCl ₂ - Platte. Stoppen Sie die Verbreitung, wenn die Oberflächedie Platte wird mit Flüssigkeit bedeckt. Lassen Sie die Platte trocken.
   4. Machen Sie eine serielle Verdünnung von 1:10 (von 10 ^-5 -10 ^-10) von zuvor hergestellten Phagen (Schritt 2.1.8) unter Verwendung von NBCaCl ₂ Medium.
   5. Spot 3 ul jeder Phagen-Verdünnung auf die Platte mit Bakterien bedeckt.
   6. Die Platte über Nacht bei 30 ° C.
   7. Zählen Sie die Plaque - Zahlen und berechnen die Phagen - Titer unter Verwendung der folgenden Gleichung: Plaque bildende Einheit (PFU) / ml = Anzahl der Plaques x Verdünnungsfaktor / getupft Volumen (3 x 10 ^-3 ml)
3. Phagentransduktion
   HINWEIS: Der Pool Phagen im vorherigen Schritt (2.1.8) wird verwendet , um die Weiterleitung des cfr - Gens in die S. aureus - Stämme zu testen. In diesem Experiment wurden die Stämme N315, COL oder MU50 als Empfänger verwendet werden.
   1. Bereiten Sie die Nacht - Kultur von N315, COL oder MU50 in 5 ml NBCaCl ₂ bei 37 ° C unter Schütteln (180 rpm).
   2. verdünnen ter Phagen in NBCaCl ₂ bis ~ 10 ⁹ PBE / ml.
   3. In einem 50 ml - Glasfläschchen, mischen 500 ul Nacht - Kultur, 500 ml frisches NBCaCl ₂ und 1 ml Phagen (~ 10 ⁹ pfu / ml); die erwartete Multiplizität der Infektion (MOI) muss 1. Inkubieren der Mischung bei 37 ° C nicht überschreiten, wobei sanft (100 UpM) für 30 min schütteln.
      HINWEIS: Die Wärmebehandlung von Empfängerzellen unmittelbar vor der Zugabe von Phagen (52 ° C für 2 min , um die endogene Restriktionsenzyme zu inaktivieren) können die Effizienz ¹² erhöhen.
   4. In 50 ul 20% Na ₃ -citrat. Weiter sanft bei 37 ° C für 30 min schütteln.
      HINWEIS: Na ₃ -Citrat wirkt als moderate Chelator von Calcium.
   5. Bereiten Sie geschmolzen Hirn-Herz-Infusion (BHI) Agar (1,5% Agar), Medium und halten sie bei 55 ° C in einem Wasserbad.
   6. Übertragen des Bakteriums-Phage Mischung in einen 100 ml Kolben, der 50 ml warmem BHI-Agar, supplementiert mit 32 mg / L chloramphenicol und gut mischen. Gießen Sie die Mischung in die 90 mm Petrischalen.
      HINWEIS: Dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis einer geringen Anzahl von wachsenden Kolonien (vermeintlichen Transduktanten).
   7. Die Platte bei 37 ° C für 24 bis 48 Stunden.
   8. Test Weitere die erzeugten Kolonien (Transduktanten) zum Widerstand durch die Kolonien auf neue BHI-Agarplatten mit 32 mg / l Chloramphenicol ergänzt übertragen. Bestätigen Sie die Anwesenheit des cfr - Gens durch Kolonie - PCR ^7.

3. Natürliche Transformation

HINWEIS: Die natürliche Transformation Test in S. aureus wurde nach dem Verfahren in unserer früheren Studie ² beschrieben durchgeführt. Das Derivat N315, N2-2.1 ^{2, 7,} wurde als Empfänger verwendet. In diesem Stamm wurde die sigH Locus dupliziert, um konstitutiv exprimieren Seufzen ^2. Für detailed Verfahren, wie Seufzen-exprimierenden Kompetenz Varianten zu isolieren, finden Sie eine frühere Beschreibung ^2. Wenn der Resistenzmarker übertragen werden Chloramphenicol nicht, pRIT-sigH (Cm ^R) verwendet werden SIGH auszudrücken, wie zuvor ² beschrieben. Gereinigte Plasmid - DNA oder ganzen Extrakt aus cfr Erworben S. aureus COL-45 ⁷ wird als Donor - DNA für die Transformation verwendet.

1. Herstellung von Donor - DNA
   1. Kultivieren COL-45 über Nacht mit in einem 300 ml-Kolben bei 37 ° C schüttelnd enthaltend 50 ml TSB, ergänzt mit 32 mg / l Chloramphenicol. Kultur E. coli HST04 trägt pHY300 Plasmid ^{(Tet R)} , der das Plasmid für das Kontrollexperiment zu extrahieren.
      HINWEIS: HST04 (dam ^- / dcm ^-) fehlt die DNA Gene Methylase ^13. Andere herkömmliche Stämme mit DNA Methylasen können auch nützlich seind, um die DNA-Donor herzustellen, weil die DNA-Methylierungsstatus nicht die Transformationseffizienz beeinflussen. Alternativ pT181 Plasmid aus dem S. aureus - Stamm gereinigt COL können auch ² als positive Kontrolle für den Transformationsassay verwendet werden.
   2. Sammle die Zellen durch Zentrifugation (8000 xg für 10 min bei 4 ° C).
   3. Extrahieren Sie die Plasmide, die ein Plasmid-DNA-Extraktions-Kits oder einer herkömmlichen DNA-Reinigungsverfahren unter Verwendung der gesamten DNA zu reinigen.
   4. Quantifizieren die gereinigte DNA von Spektrometer und halten sie bei 4 ° C bis zur Verwendung.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine neue DNA-Präparation für die Transformation Assay, in der Regel weniger als eine Woche alt. Alte DNA-Präparate zu reduzieren, die Effizienz der Transformation.
2. Transformation Test
   1. Kultur der Empfängerzelle (N2-2.1) über Nacht in 5 ml TSB bei 37 ° C unter Schütteln.
   2. Übertragen 0,5 ml Übernachtkultur in ein 1,5-ml-Röhrchen. Precipitate , die Zellen durch Zentrifugation (10.000 × g für 1 min bei 4 ° C).
   3. Suspend die Zellen mit 10 ml CS2 Medium in einem 50-ml-Tube.
      HINWEIS: CS2 Medium ist ein komplettes synthetisches Medium , das ² in S. aureus Kompetenz für natürliche Transformation induziert (siehe die Zusammensetzung des Mediums in der Materialtabelle). Andere Standard - Labormedien, wie TSB oder BHI, sind nicht geeignet für die Transformation ^{2, 13.}
   4. Wachsen die Bakterien bei 37 ° C mit (180 Umdrehungen pro Minute), bis zur späten exponentiellen Phase Schütteln (ca. 8 h).
   5. Ernte der Zellen durch Zentrifugation (5000 × g für 5 min bei 4 ° C).
   6. Resuspendieren der Zellen in 10 ml frischem Medium CS2.
   7. Zugabe von 10 & mgr; g gereinigter Plasmid oder Genom-DNA (Schritt 3.1.4) zu der Zellsuspension. Schütteln bei 37 ° C und 180 Upm für 2,5 Stunden.
      HINWEIS: Kürzere Inkubationszeiten mit DNA (<2,5 h) führen zu geringeren transformationen Frequenzen.
   8. Sammle die Zellen durch Zentrifugation (5000 × g für 5 min bei 4 ° C).
   9. Resuspendieren der Zellen in 10 ml BHI-Medium. Mischen der Zellsuspension mit 90 ml geschmolzenem BHI-Agar (55 ° C) Nahrungsergänzungsmittel mit 32 mg / l Chloramphenicol (oder 5 mg / L Tetracyclin in dem Kontrollexperiment). Gießen Sie die Mischung in die 90 mm Petrischalen. Geschwind kühl und lassen Sie die Agar verfestigt.
   10. Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 2 Tage.
   11. Replizieren erzeugten Kolonien (Trans) durch die Kolonien übertragen (unter Verwendung von Zahnstochern) auf neue BHI-Agar-Platten, die entsprechenden Antibiotika enthalten, ihre Widerstandseigenschaften zu bestätigen. Bestätigen Sie die erworbene Resistenz - Gen (cfr oder tetM) durch Kolonie - PCR - ^7.

Ergebnisse

Die hier dargestellten Ergebnisse wurden bereits veröffentlicht (aus Referenz ⁷ mit Zustimmung des Herausgebers angepasst). Wir untersuchten die möglichen Übertragungswege des GRR - Gen, das Linezolid Widerstand mit niedrigem Pegel bewirkt , und die Expression des PhLOPSA-Resistenz - Phänotyp ^{14, 15} in S. aureus - Stämme, durch drei Mechanismen der HGT zu untersuchen.

Diskussion

Diese Arbeit beschreibt die drei wichtigsten Methoden , um die HGT genetischen Determinanten im S. aureus zu studieren. Obwohl Transduktion und Konjugation seit Jahrzehnten untersucht wurde, wurde die Existenz der natürlichen Transformation erst vor kurzem ² anerkannt. Somit ist S. aureus mit allen drei großen ausgestattet Modi von HGT und Testen alle von ihnen benötigt wird , um die mögliche Verbreitung Wege von genetischen Determinanten zu klären. Das Ziel dieser Ar...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)	Becton Dickinson	211825
Brain Heart Infusion (BHI)	Becton Dickinson	211059
Nutrient Broth No. 2	Oxoid	CM0067
Sheep blood agar	Eiken Chemical Co.,Ltd.	E-MR96	Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.
Agar powder	Wako Pure Chemical Industries	010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)	Wako Pure Chemical Industries	191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter	Merck Milipore	HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit	QIAGEN	12243