で水平遺伝子伝達の研究のための方法論<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

要約

ここでは接合、形質導入、および黄色ブドウ球菌における自然形質転換のin vitroでの調査のための3つの異なるプロトコルを記述します。

要約

主要な日和見ヒト病原体黄色ブドウ球菌の1つの重要な特徴は、急速に抗生物質に対する耐性を獲得するその並外れた能力です。ゲノム研究は、 黄色ブドウ球菌は、水平遺伝子伝達（HGT）は、黄色ブドウ球菌の進化に重要な役割を果たしていることを示唆し、モバイル遺伝的要素に位置し、多くの病原性と抵抗性遺伝子を有することを明らかにしました。しかし、 黄色ブドウ球菌にHGTを研究するために使用される方法の完全かつ詳細な説明はまだ、不足している、特に自然変換について、最近、この細菌で報告されています。抱合、ファージ形質導入、および自然変換：この作品は、 黄色ブドウ球菌におけるHGTのin vitroでの研究のために有用である3つのプロトコルについて説明します。この目的にフェニコールを与える、CFR遺伝子（クロラムフェニコール/フロルフェニコール耐性）、リンコサミド、オキサゾリジノン、プレウロムチリン、およびストレプトA（PhLOPSA）表現型ース間オン抵抗使用しました。 黄色ブドウ球菌は、他の株に遺伝物質を転送するを通じてメカニズムを理解することは、耐性の急速な買収を理解するために不可欠であるとサーベイランスプログラムで報告普及のモードを明確にすることや、今後さらに拡散モードを予測するのに役立ちます。

概要

黄色ブドウ球菌は自然に人間や動物の皮膚や鼻腔に生息する共生グラム陽性細菌です。この細菌種は、病院や医療現場における院内感染の主な原因です。また、別の抗菌化合物に対する耐性を開発する能力は、世界的な懸念にこの細菌によって引き起こされる感染症の管理を行っています。

耐性表現型の拡散に関与する2つの主要な経路が知られている：耐性遺伝子型のクローン普及および細菌プール間の遺伝的決定の普及を。 黄色ブドウ球菌 、異なる抗生物質耐性遺伝子（ならびに病原性決定因子）の場合には、モバイル遺伝要素（MGES ^1）に関連することが見出されています。 黄色ブドウ球菌のゲノムにおけるこれらの要素の存在は、世代の取得及び譲渡ことを示しています細菌集団内エティックな材料は、 黄色ブドウ球菌の適応と進化のための重要な役割を果たし得ます。

形質転換、抱合、およびファージ形質導入：遺伝物質は、グラム陽性細菌にHGTの三周知の機構を介して交換することができます。形質転換は、遊離DNAの取り込みを伴います。能力段階：外来DNAを取得するには、細菌細胞は、特別な生理的相を開発する必要があります。この段階に到達すると、コンピテント細胞は、細胞質中にDNAを輸送する新しい遺伝的決定を取得することが可能です。 黄色ブドウ球菌の場合には、天然の形質転換の存在は、最近^2を実証されています。これに伴い、当社グループは、その構成的発現がreachin可能な黄色ブドウ球菌をレンダリングする方法を開発の能力段階で、オンため息因子の発現の関連性（不可解な二次転写シグマ因子）に光を当てるしています自然変換²により耐性表現型の獲得を可能にするグラム能力段階、。

結合は、別の（受信者）に1生細胞（ドナー）からのDNAの送信を伴うプロセスです。どちらの細胞は、DNAが、そのようなチューブや毛穴などの特殊な構造によって保護された状態で交換することができるように、直接接触していなければなりません。この方法によるDNAの導入は、接合機械を必要とします。 黄色ブドウ球菌では、プロトタイプ接合プラスミドは、接合オペロンTRAA ^3を保有PGO1、です。

ファージ形質導入は、バクテリオファージ感染を介して細胞への細胞からのDNAの移動を伴う、代わりにウイルスDNAのファージキャプシドに、細菌DNAのパッキングを意味します。 黄色ブドウ球菌分離株のほとんどは、バクテリオファージ¹によって溶原化されています。ストレス条件に、プロファージは、細菌GENOMから切り出すことができますeおよび溶菌サイクルへの移行。

これらは、 黄色ブドウ球菌におけるDNAの伝送のための3つのよく知られた機構です。病原性島⁴の転送中にいくつかのような「擬似変換」などの追加の転送メカニズム^、2およびファージのようなシステムがあります。最近、一つのグループは、「ナノチューブ」は、隣接するセル^5,6の間（プラスミドDNAなど）は、細胞材料の転写に関与しているが、フォローアップ研究は、これまで、他のグループから出現していないことを報告しました。

接合、形質導入、および自然変換：この作品は、3つの主要な移動経路をアドレス指定することにより、黄色ブドウ球菌にHGTを勉強するために必要な方法論を提供します。これらの方法論を用いて得られた結果は、間のCFR遺伝子（クロラムフェニコール/フロルフェニコール耐性）の送信を研究するために使用されました黄色ブドウ球菌は^7菌株 。これらの3つの技術は、黄色ブドウ球菌におけるMGE伝送の調査のための多目的なツールです。

プロトコル

注：この作業で使用した株および材料は、それぞれ、 表1および材料の表に記載されています。伝送実験では、N315および陽性デリバティブCFR COLはCFR遺伝子（N315-45とCOL-45）のドナーとして使用しました。これらの株は、以前に（下記参照）を、標準的なコンジュゲーションプロトコルに従って、ドナーとして臨床CFR陽性ブドウ表皮株 （ST2）を用いて、結合することによって得ました。この株はpSCFS7のようなプラスミド⁷にCFR遺伝子を抱いて。

1.共役フィルター交配法を用いました

注：CFR遺伝子^{（N315-45）7（CM R）を}有する黄色ブドウ球菌 N315株をドナーとして使用しました。 COL ⁸またはMU50 ⁹株（テト^R、Cmを^S）をレシピエントとして使用しました。ダブル-クロラムフェニコールの32 mg / Lで加えたテトラサイクリン8ミリグラム/ Lの存在下で増殖することができる耐性コロニー（テト^R、のCm ^R）の推定上のトランス接合体とみなされ、コロニーPCRによってCFRの存在を決定し、決定するために分析しました。受信者の感受性プロファイル。

1. いくつかの変更を使用して、以前に記載されたプロトコル¹⁰以下の結合を実行します。
   1. 37℃で振盪しながら、トリプシン大豆培養液（それぞれ32 mg / Lのクロラムフェニコールと無い場合、）（TSB）培地中のドナーとレシピエントの一晩培養物を5mLを準備します。
   2. 新鮮なTSB培地を用いて、1（OD ₆₀₀ = 1.0）に一晩培養の光学密度（OD _600）を調整_します。受信者の文化（COLまたはMU50）の0.5 mLでドナー文化（N315-45）の0.5ミリリットルを混ぜます。混合物に1mlのPBSを追加します。
   3. 0.45μmのフィルター膜USIに細菌の混合物を転送します真空ポンプシステムをngの。
   4. ヒツジ血液寒天プレート上でフィルター膜を置きます。 1日間37℃でインキュベートします。
      注：このステップでは、濃縮された培地は、二重耐性細胞の増殖を可能にするために必要です。
   5. プレートからフィルター膜を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlに懸濁します。渦はよくメンブレン上に接続されているすべての細菌を収集します。
   6. 新鮮なTSBを使用して、細菌懸濁液の連続10倍希釈液を作ります。プレート32 mg / Lのクロラムフェニコールおよびトランス接合の選択のための8 mg / Lのテトラサイクリンを補充したTSB寒天（TSA）プレート上で0-10 ^-4希釈した試料100μlの。受信者の合計数をカウントするだけでは8 mg / LのテトラサイクリンとTSAプレート上にプレート希釈懸濁液（10 ^{-5〜10 -6）}の100μLを。 18-24時間、37℃で培養します。
   7. CFの存在のための二重耐性コロニー（推定上のトランス）を分析コロニーPCR ⁷およびそれらの感受性プロファイル（アンチバイオグラム）によるr遺伝子。
   8. 標準微量希釈法またはディスク拡散法¹¹に従って、適切な抗生物質の最小発育阻止濃度（MIC）を測定することにより、アンチバイオグラムを決定します。トランス接合体の感受性プロファイルは、クロラムフェニコール（およびCFR遺伝子によって影響を受ける他の化合物）を除いて、受信者に同一である必要があります。この決意は、ドナー株によって開発されたテトラサイクリン耐性を排除することが不可欠です。

2.ファージ形質導入

注： サイフォウィルス科に属するバクテリオMR83a（実験室株）を形質導入実験に用いました。 N315-45は、ファージ感染CFRドナーとして使用しました。 N315、COL、またはMU50株レシピエントとして使用しました。 CFRの買収は、ABにより決定しました32 mg / Lのクロラムフェニコールの存在下で増殖するレシピエント株のility。この条件の下で成長するコロニーは（コロニーPCRによって）CFRの存在を決定し、潜在的な汚染を排除するために感受性プロフィールを決定するために分析しました。

1. ドナー上のファージ増幅
   1. （180 rpm）し振とうしながら37℃で3.6 mMののCa ^2+（NBCaCl _2）を補充した栄養ブロス5mlにN315-45の一晩培養物を準備します。
      注：カルシウムはファージ感染のために必要とされます。 材料表を参照してください。他社からの栄養ブロスは、カルシウム沈殿などの問題を、持っているかもしれません。
   2. 50ミリリットルのガラスフラスコまたはガラスバイアル中NBCaCl ₂の10 mLの最終体積で千：一晩培養物1を希釈することにより継代培養を準備します。 （180 rpm）し振とうしながら37℃で1時間、細菌を成長させます。
   3. NBCaCl ₂メディで希釈したファージMR83aのシリーズを用意ええと（10 ^{-2、10 -3、10 -4、10 -5、10 -6）。}細菌培養物に希釈したファージの20μlのを追加します。また、細菌細胞の成長のための陽性対照として、翌日のファージ力価を決定するために使用できるファージ感染、ない対照培養物を調製します。
   4. 一晩穏やかに振盪（100 rpm）しながら37℃で培養を成長させます。
      注：感染ファージが過剰でない場合に、細胞がある程度成長します。その後、彼らは溶菌サイクルを通じてによるファージ増幅に溶解段階に入ります。ファージと文化は透明性の明確な速度が表示されますしながら、ファージのない文化は、完全な成長が表示されます。
   5. 追加されたファージの最高希釈で1または2透明な培養バイアルを選択します。
   6. 15ml遠心チューブに培養液を移します。クロロホルム250μlを添加し、チューブを反転させることにより十分に混合します。
   7. 5000でチューブを遠心 4℃で20分間XG。
   8. 新鮮なチューブに上清を移し、使用するまで4℃で保管してください。
      注：ファージは、少なくとも数ヶ月間安定であるが、長すぎるためのファージ調製物を貯蔵することは力価及び形質導入効率を低下させます。
2. ファージ力価（ファージプラークアッセイ）を測定
   1. 栄養ブロス寒天（1.5％寒天）培地を準備。 55℃の水浴中で暖かいを保ちます。 3.6 mMの最終濃度を培地にオートクレーブし、0.5MのCaCl ₂溶液を加えます。 90ミリメートルペトリ皿（NBCaCl ₂板）にそれを注ぎます。
   2. 振盪しながら37℃でNBCaCl ₂ 5ml中のN315の一晩培養物を準備します。これは、上述した対照培養（ステップ2.1.3）で置換することができます。
   3. NBCaCl ₂の200μlの中に一晩培養物の10μlを添加して、均一にNBCaCl ₂プレートの上に広げました。時の表面拡散を停止プレートは、液体で覆われています。プレートが乾燥してみましょう。
   4. シリアル1:10希釈を行います（10 ^-5 -10から^-10）NBCaCl ₂培地を使用して、先に調製したファージ（ステップ2.1.8）の。
   5. スポット細菌で覆われたプレート上に各ファージ希釈液を3μl。
   6. 30℃で一晩プレートをインキュベートします。
   7. プラーク数をカウントし、以下の式を用いてファージ力価を計算します。プラーク形成単位（PFU）/ミリリットル=プラークの数のx希釈倍率/スポッティングボリューム（3×10 ^-3ミリリットル）
3. ファージ形質導入
   注：前のステップ（2.1.8）で調製したファージプールは、 黄色ブドウ球菌株にCFR遺伝子の導入をテストするために使用されます。この実験では、N315、COL、またはMU50をレシピエントとして使用されている株。
   1. （180 rpm）し振とうしながら37℃でNBCaCl ₂の5ミリリットルでN315、COL、またはMU50の一晩培養物を準備します。
   2. トンを希釈彼は10 ⁹ PFU / mLの〜にNBCaCl ₂中のファージ。
   3. 50ミリリットルのガラスバイアルでは、一晩培養物500μlを、新鮮なNBCaCl _2500μlの、およびファージの1ミリリットル（〜10 ⁹ PFU / mlで）混ぜます。感染の期待多重度（MOI）を、穏やかに30分間（100 rpm）し振とうしながら37℃で1インキュベート混合物を超えてはなりません。
      注記：直前ファージの添加（内因性制限酵素を不活性化するために2分間52°C）にレシピエント細胞の熱処理が効率^12を増大^させることができます。
   4. 20％のNa ₃ -クエン酸塩の50μLを加えます。 37℃で30分間穏やかに振盪続けます。
      注：のNa ₃ -クエン酸塩はカルシウムの適度なキレート剤として作用します。
   5. 溶融したブレインハートインフュージョン（BHI）寒天（1.5％寒天）培地を調製し、55℃の水浴に保管してください。
   6. 32 mg / Lのchlorampを補っ暖かいBHI寒天の50ミリリットルを追加し、100ミリリットルのフラスコに細菌ファージ混合物を移しhenicol、よく混ぜます。 90ミリメートルペトリ皿に混合物を注ぎます。
      注：この方法は、増殖するコロニー（推定形質導入）の少数の検出を可能にします。
   7. 24〜48時間、37℃でプレートをインキュベートします。
   8. また、32 mg / Lのクロラムフェニコールを補充した新しいBHI寒天プレート上にコロニーを転送することにより、抵抗のために生成されたコロニー（形質導入）をテストします。コロニーPCR ⁷によるCFR遺伝子の存在を確認してください。

3.自然変換

注： 黄色ブドウ球菌の自然形質転換アッセイは我々の以前の研究²に記載の方法に従って行いました。 N315誘導体、N2-2.1 ^2,7は 、レシピエントとして使用しました。この株では、 ため息座は構成的に発現ため息²になるように複製されました。 DETのためため息を発現する能力変異体を単離する方法についてailed手順は、前の説明^2を参照^してください。転送する耐性マーカーは、クロラムフェニコールでない場合、以前に²記載されているように、PRIT-ため息（CM ^R）は 、ため息を発現させることができます。精製されたプラスミドまたはCFRからの全DNAの抽出は、 黄色ブドウ球菌 COL-45 ⁷形質転換のためのドナーDNAとして使用さ-acquired。

1. ドナーDNAの調製
   1. TSBの50 mLを含む300ミリリットルのフラスコ中で37℃で振盪しながら一晩COL-45を養う32 mg / Lのクロラムフェニコールを補充しました。文化大腸菌 HST04運ぶpHY300 プラスミド^{（テト R）は、}対照実験のためにプラスミドを抽出します。
      注：HST04（ ダム^- / DCM ^{- ）}は、DNAが遺伝子^13をメチ欠いています。 DNAメチラーゼと他の従来の株も使用することができますDNAのメチル化状態は、変換効率に影響を与えないので、dは、DNA供与体を調製しました。代替的に、 黄色ブドウ球菌 COL株から精製pT181のプラスミドはまた、形質転換アッセイ²の陽性対照として使用することができます。
   2. 遠心分離（4℃で10分間、8000×gで ）によって細胞を収集します。
   3. 全DNAを精製し、プラスミドDNA抽出キットまたは従来のDNA精製法を用いてプラスミドを抽出します。
   4. 分析計によって精製されたDNAを定量化し、使用するまで4℃で保管してください。
      注：形質転換試験、古い通常一週間以内の新鮮なDNA調製物を使用してください。古いDNA調製物は、形質転換の効率を低下させます。
2. 形質転換試験
   1. 文化振とうしながら37℃で一晩TSB 5ml中の受容細胞（N2-2.1）。
   2. 1.5ミリリットルチューブに一晩培養の0.5ミリリットルを転送します。 Precipi遠心分離（4℃、1分間10,000×gで ）によって細胞をテート。
   3. 50mlのチューブ内CS2培地10mLで細胞を一時停止します。
      注：CS2媒体（材料表に培地組成を参照）、黄色ブドウ球菌 ²の自然形質転換のための能力を誘発する完全合成培地です。例えばTSBまたはBHIなどの他の標準的な実験用培地は、形質転換^2、13には適していません。
   4. 後期指数期（約8時間）まで（180 rpm）し振とうしながら37℃で細菌を成長させます。
   5. 遠心分離（4℃で5分間、5,000×gで ）により細胞を収穫。
   6. 新鮮CS2培地10mlに細胞を再懸濁。
   7. 細胞懸濁液に精製されたプラスミドまたはゲノムDNA（ステップ3.1.4）の10μgのを追加します。 37°Cと2.5時間、180rpmで振盪します。
      注：DNAと短いインキュベーション時間（<2.5時間）下TRANSFになりますormation周波数。
   8. 遠心分離（5000×gで 5分間4℃で）によって細胞を収集します。
   9. BHI培地10ml中で細胞を再懸濁します。 32 mg / Lのクロラムフェニコール（または対照実験では5 mg / Lのテトラサイクリン）との溶融BHI寒天（55°C）サプリメントの90ミリリットルで細胞懸濁液を混ぜます。 90ミリメートルペトリ皿に混合物を注ぎます。迅速クールと寒天を固化させます。
   10. 2日間37℃で培養します。
   11. その抵抗特性を確認するために、適切な抗生物質を含む新しいBHI寒天プレートに（楊枝を使って）コロニーを転送することによって生成されたコロニー（形質転換体）を複製します。コロニーPCR ⁷によって取得された耐性遺伝子（CFRまたはtetM）を確認してください。

結果

ここで示される結果は、以前に公開されている（出版社の許可を得て参照⁷から適応）。私たちは、HGTの三つのメカニズムを調査することにより、 黄色ブドウ球菌株で^15、低レベルのリネゾリド耐性とPhLOPSA耐性表現型¹⁴の発現を引き起こすCFR遺伝子の潜在的な伝送経路を検討しました。

ディスカッション

この作品は、黄色ブドウ球菌における遺伝的決定のHGTを研究するために、3つの主要な方法について説明します。形質導入および結合は数十年にわたって研究されてきたが、自然形質転換の存在はごく最近の^2を認識^しました。このように、 黄色ブドウ球菌は、HGTの3メジャーモードのすべてが装備され、それらのすべてのテストは遺伝的決...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)	Becton Dickinson	211825
Brain Heart Infusion (BHI)	Becton Dickinson	211059
Nutrient Broth No. 2	Oxoid	CM0067
Sheep blood agar	Eiken Chemical Co.,Ltd.	E-MR96	Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.
Agar powder	Wako Pure Chemical Industries	010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)	Wako Pure Chemical Industries	191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter	Merck Milipore	HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit	QIAGEN	12243