Yatay Gen Transferi Çalışmasında Metodolojisi<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Özet

Burada Staphylococcus aureus konjugasyon, transdüksiyon ve doğal dönüşümün, in vitro incelenmesi için, üç farklı protokoller açıklanmaktadır.

Özet

Ana fırsatçı insan patojeni Staphylococcus aureus önemli bir özelliği, hızlı bir şekilde antibiyotiklere direnç elde etmek için olağanüstü yeteneğidir. Genomik çalışmalar S. aureus yatay gen transferi (HGT) S. aureus evriminde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir mobil genetik elementlerin bulunan birçok virülans ve direnç genleri taşıdığını ortaya koymaktadır. Ancak, yine de, eksik özellikle son zamanlarda bu bakterinin rapor edilmiştir doğal dönüşümü ile ilgili olan S. aureus HGT incelemek için kullanılan metodolojinin tam ve ayrıntılı bir açıklama. Konjugasyon faj iletimi ve doğal dönüşümün Bu çalışma, in vitro, S. aureus HGT incelemek için yararlı olan, üç protokollerini tasvir eder. Phenicols veren bu amaçla, cfr gen (kloramfenikol / florfenikol direnci), linkozamitler, Oksazolidinonlar, Pleuromutilins ve streptogramin A (PhLOPS içinA) fenotipi -karşı kullanılmıştır. S. aureus, diğer suşlar genetik materyaller aktaran geçtiği mekanizmaları anlamak direncin hızlı satın kavrama esastır ve yaygınlaştırma modları gözetim programlarında bildirilen veya gelecekte daha da yayılmasını moduna tahmin etmek netleştirmek için yardımcı olur.

Giriş

Staphylococcus aureus, doğal insan ve hayvanların deri ve burun boşluğu yaşar bir ortakçı Gram pozitif bir bakteridir. Bu bakteri türleri hastane ve sağlık ortamlarında hastane enfeksiyonlarının önde gelen nedenidir. Ayrıca, farklı antimikrobiyal bileşiklere direnç geliştirme kabiliyeti küresel bir endişe içine bu bakterinin neden olduğu enfeksiyonların yönetimini yapmıştır.

direnç fenotipleri yayılmasında karışan iki ana yollar bilinmektedir: dayanıklı genotiplerin klonal yayılmasını ve bakteriyel havuz arasındaki genetik belirleyicileri yayılmasını. S. aureus, farklı antibiyotik direnç genleri (ve hastalık oluşumunu belirleyen etkenin) durumunda, hareketli genetik elemanlara (MGES) ile ilişkili bulunmuştur ^1. S. aureus genomunda bu unsurların varlığı gen kazanılması ve transfer olduğunu gösterirBakteriyel nüfus içinde etik malzeme S. aureus adaptasyonu ve evrim için önemli bir rol oynayabilir.

dönüşüm, konjugasyon ve faj iletimi: Genetik materyal, Gram-pozitif bakterilerde HGT üç iyi bilinen mekanizmalarla değiştirilebilir. Dönüşüm serbest DNA alımını kapsar. yetkinlik sahne: yabancı DNA elde etmek için, bakteri hücrelerinin özel bir fizyolojik faz geliştirmek gerekir. Bu aşamada ulaşıldığında, kompetan hücreler, sitoplazmaya DNA taşıyan yeni genetik determinantlar elde edebilmektedir. S. aureus durumunda, doğal transformasyon varlığı en son ² gösterilmiştir. Buna paralel olarak, bizim grubun kurucu ifade reachin yeteneğine sahip S. aureus işler nasıl gelişme yeterlilik aşamasında ve üzerinde iç çekişi faktörünün ifade alaka (şifreli ikincil transkripsiyon sigma faktörü) ışık tutmuşturDoğal dönüşümü ² ile dayanıklı fenotipleri edinimi için izin verir g yetkinlik sahne.

Konjugasyon başka bir (alıcı), bir canlı hücrenin (donör) DNA iletimi ile ilgili bir süreçtir. Her iki hücreleri, tüpler ya da gözenek gibi özel yapılar tarafından korunması suretiyle, DNA değiştirilmesine olanak verir, doğrudan temas içinde olması gerekmektedir. Bu yöntemle DNA transferi konjugatif makine gerektirir. S. aureus, prototip konjugatif plazmid konjugatif operon traa ³ barındıran PGO1 vardır.

Faj transdüksiyon bakteriyofaj enfeksiyonu yoluyla hücreden hücreye DNA transferini içermektedir ve faj kapsid içine yerine viral DNA'nın bakteriyel DNA ambalaj ifade eder. S. aureus izolatlarının çoğu bakteriyofajlar ¹ ile lysogenized edilir. stres koşullarında üzerine prophages bakteriyel genom eksize edilebilirE ve litik döngüsü vardiya.

Bunlar S. aureus DNA aktarımı için üç iyi bilinen mekanizmalardır. Bu tür "sözde dönüşüm" ² ve patojenite adaları ⁴ transferinde faj benzeri sistemler gibi bazı ek aktarım mekanizmaları vardır. Son zamanlarda, bir grup "nanotüpler" komşu hücreler ^{5, 6} arası (plazmid DNA dahil), hücresel materyallerin transferi dahil, ancak bir izlem çalışması şimdiye kadar diğer gruplardan ortaya olmadığını bildirdi.

Konjugasyon, transdüksiyon ve doğal dönüşümü: Bu çalışma üç ana aktarma yollarının ele alarak S. aureus HGT incelemek için gerekli bir metodoloji sağlar. Bu yöntemler ile elde edilen sonuçlar arasındaki CFR gen iletimini (kloramfenikol / florfenikol direnci) yapısını incelemek için kullanılmıştırS. aureus ⁷ suşları. Bu üç teknik S. aureus MGE iletim soruşturma çok yönlü araçlardır.

Protokol

NOT: Bu çalışmada kullanılan suşlar ve malzemeler sırasıyla Tablo 1'de belirtilen ve Malzeme Tablosu vardır. Iletim deneylerinde, N315 ve pozitif türevleri cfr COL CFR geninin donör (N315-45 ve Col-45) olarak kullanılmıştır. Bu suşlar, daha önceden standart konjügasyon protokolü (aşağıya bakınız), aşağıdaki, verici klinik CFR pozitif Staphylococcus epidermidis soyu (ST2) halinde kullanılarak konjugasyon ile elde edilmiştir. Bu suş pSCFS7 benzeri plazmid ⁷ cfr genini barındırmıştır.

1. Konjugasyon Filtre çiftleşme Yöntemiyle

Not: CFR gen (N315-45) ⁷ (Cm ^R) taşıyan bir S. aureus N315 suşu verici olarak kullanılmıştır. COL ⁸ veya Mu50 ⁹ suş (Tet ^R Cm ^S) alıcı olarak kullanılmıştır. Çift-dirençli koloniler 32 mg / kloramfenikol ve 8 mg L mevcudiyetinde büyüyebilen (Tet ^R Cm ^R) / tetrasiklin L, farazi Transkonjuganlardaki olarak kabul edildi ve koloni PCR ile CFR varlığını tespit etmek ve belirlemek için analiz edilmiştir alıcı duyarlılık profili.

1. Bir kaç değişiklik ile önceden tanımlanmış bir protokole ¹⁰ aşağıdaki çekimleri gerçekleştirin:
   1. 37 ° C'de çalkalanarak (ve sırasıyla, 32 mg / L kloramfenikol olmadan) triptik soya suyu (TSB) ortam içinde alıcı ve verici arasındaki bir gece boyunca kültür 5 mL hazırlayın.
   2. Taze TSB ortamı kullanılarak 1 (OD = 1.0 ₆₀₀₎ gecede kültürlerin optik yoğunluk (OD ₆₀₀₎ ayarlayın. Alıcı kültürü 0.5 mL (COL ya Mu50) donör kültürü (N315-45) 0.5 mL karıştırın. karışıma PBS 1 ml ilave edilir.
   3. 0.45 um'lik bir membran filtre USI üzerine bakteri karışımı aktarınBir vakum pompası sistemi ng.
   4. Bir koyun kanlı agar plaka üzerinde filtre membranlar koyun. 1 gün süreyle 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Bu adımda, zenginleştirilmiş orta çift dirençli hücrelerin büyümesine izin vermek için gereklidir.
   5. plaka filtre membran dışarı atın ve fosfat tamponlu salin (PBS) 10 ml askıya. Vortex iyi membran üzerine bağlı tüm bakterileri toplamak için.
   6. Taze TSB kullanılarak bir bakteri süspansiyonu içerisinde seri 10-misli seyreltme sağlayın. TSB agar üzerinde 0-10 ^-4 seyreltilmiş numune levhalar 100 ul (TSA) levhalarında 32 mg / ml Kloramfenikol ve 8 mg / transkonjugamn seçimi L tetrasiklin ile takviye edilmiştir. Seyreltilmiş süspansiyonu (10 ^-5 -10 ^-6) TSA plakaları üzerine tek başına 8 mg / L tetrasiklin plaka 100 ul alıcı sayısını saymak için. 18-24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   7. Cf varlığı için çift dayanıklı koloniler (varsayılan transkonjugamn) analizKoloni PCR ⁷ ve duyarlılık profili (antibiyograma) ile r geni.
   8. Standart mikrodilüsyon yöntemi veya disk difüzyon yöntemi ^11'e göre, uygun antibiyotik minimum inhibitör konsantrasyonlar (MIC) ölçerek antibiyogram belirler. Transkonjugamn duyarlılık profili kloramfenikol (ve cfr geni tarafından etkilenen diğer bileşiklerin) hariç, alıcıya aynı olmalıdır. Bu belirleme donör suşu tarafından geliştirilen tetrasiklin direnci ekarte etmek için esastır.

2. Faj İletimi

Not: Sıphovındae ailesi (laboratuvar stok) ait bakteriyofaj MR83a transdüksiyon deneyleri kullanılmıştır. N315-45 faj enfeksiyonu için CFR verici olarak kullanılmıştır. N315, COL ya da Mu50 suşları alıcı olarak kullanılmıştır. CFR edinimi ab belirlendiAlıcı soyunun ility 32 mg / L kloramfenikol varlığında gelişme. Bu koşullarında yetiştirilen Kolonileri (koloni PCR ile) CFR varlığını belirlemek ve potansiyel kontaminasyonu ekarte etmek duyarlılık profilini belirlemek için analiz edilmiştir.

1. Donör üzerinde faj amplifikasyon
   1. (180 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de 3.6 mM Ca2 ⁺ (NBCaCl ₂₎ ile takviye edilmiş bir besin sıvısının 5 ml N315-45 bir gecelik kültürü hazırlayın.
      Not: Kalsiyum faj enfeksiyonu için gereklidir. Malzemeler Tablo Bkz. diğer şirketlerden Besin suyu, kalsiyum yağış gibi konuları, olabilir.
   2. 50 ml cam şişeler veya cam şişeler içinde NBCaCl ₂ 10 mL'lik bir son hacim içinde 1.000: gece boyunca kültür 1 seyreltilmesi ile alt kültür hazırlayın. (180 rpm) çalkalama ile 37 ° C'de 1 saat boyunca bakteri büyütün.
   3. NBCaCl ₂ medi içinde seyreltilmiş faj MR83a bir dizi hazırlanmasıum (10 ^-2 10 ^-3 10 ^-4 10 ^-5 ve 10 ^-6). Bakteriyel kültür seyreltilmiş faj 20 ul ekle. Ayrıca, bakteriyel hücre büyümesi için pozitif kontrol olarak hizmet eder ve bir sonraki gün faj titresini belirlemek için kullanılabilen faj enfeksiyonu olmayan bir kontrol kültürü hazırlamak.
   4. gece boyunca hafifçe çalkalanarak (100 rpm) ile 37 ° C 'de kültür büyütün.
      NOT: bulaşmasını faj fazla değilken hücrelerin bir ölçüde artacaktır; Daha sonra, onlar yüzünden litik döngüsü boyunca faj amplifikasyon lizis fazına girecektir. faj ile kültürler şeffaflık farklı oranlarını gösterir iken faj olmadan kültür, tam büyüme gösterecek.
   5. katma faj en yüksek seyreltme ile bir ya da iki temizlenir kültür şişeleri seçin.
   6. 15 mi santrifüj tüplerine kültürleri aktarın. kloroform 250 ul ekleyin ve tüpler tersini iyice karıştırın.
   7. 5,000 tüpler santrifüj 4 ° C'de 20 dakika boyunca x g.
   8. yeni tüplere transfer süpernatantlar ve kullanılana kadar 4 ° C'de saklayın.
      faj en az birkaç ay boyunca stabil, ancak çok uzun süre faj hazırlık depolama titre ve transdüksiyon etkinliğini azaltır: NOT.
2. Faj titresi Ölçme (faj plak deneyi)
   1. besin sıvısı agar (% 1.5 ağar) orta hazırlayın; 55 ° C 'de bir su banyosunda sıcak tutmak. 3.6 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar orta otoklavlanmış, 0.5 M _CaCI2 çözeltisi ekleyin. 90 mm Petri kapları (NBCaCl ₂ tabak) içine dökün.
   2. Çalkalanarak 37 ° C'de NBCaCl ₂ 5 ml N315 bir gecelik kültürü hazırlamak; Bu, yukarıda tarif edilen kontrol kültürü (aşama 2.1.3) ile ikame edilebilir.
   3. NBCaCl ₂ 200 ul içinde bir gece boyunca kültürün 10 ul ekle ve eşit NBCaCl ₂ plaka üzerine yayıldı. zaman yüzey yayılmasını durdurmakPlaka, sıvı ile kaplanır. plaka kurumasını bekleyin.
   4. Seri 1:10 seyreltme yapın (10 ^-5 -10 ^-10) NBCaCl ₂ ortamı kullanılarak önceden hazırlanmış faj (aşama 2.1.8) arasında.
   5. Noktası bakteri ile kaplı plaka üzerine, her faj seyreltme 3 ul.
   6. 30 ° C'de gece boyunca inkübasyona bırakılır.
   7. Plak sayıları sayın ve aşağıdaki denklem kullanılarak faj titresi hesaplanır: plak oluşturma birimi (pfu) / ml = plakların sayısı x seyreltme faktörü / lekeli hacmi (3 x 10 mi ^-3)
3. faj iletimi
   NOT: Bir önceki aşamada (2.1.8) 'da hazırlanmış faj havuzu, S. aureus suşları içine CFR genin transdüksiyonunu test etmek için kullanılır. Bu deneyde, N315, sütun veya Mu50 alıcı olarak kullanılan türler.
   1. (180 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de NBCaCl ₂ 5 ml N315, COL ya da Mu50 gece boyunca kültür hazırlayın.
   2. t seyreltinO 10 ⁹ pfu / mL ° 'ye kadar NBCaCl ₂ faj.
   3. 50 ml'lik bir cam şişe içinde, bir gece boyunca kültür, 500 ul taze NBCaCl ₂ 500 ul ve faj 1 ml (~ 10 ⁹ pfu / ml) karışımı; enfeksiyonun beklenen (MOI) yumuşak bir 30 dakika (100 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de 1 inkübe kanşım aşmamalıdır.
      Not: hemen önce faj ilavesiyle (endojen restriksiyon enzimleri etkisiz hale getirmek 2 dakika boyunca 52 ° C), alıcı hücrelerin ısı tedavisi verimliliği ¹² artırabilir.
   4. % 20 Na ₃ -Citrate 50 ul ekle. 37 ° C'de 30 dakika boyunca hafif sallama devam edin.
      Not: Na ₃ -Citrate kalsiyum ılımlı kenetleyici olarak işlev görür.
   5. Erimiş beyin kalp infüzyon (BHI) agarı (% 1.5 ağar) orta hazırlayın ve 55 ° C'de bir su banyosu içinde muhafaza edin.
   6. , 100 ml'lik bir şişeye bakteri faj karışımı aktarın 32 mg / ml ile takviye edilmiş chloramp sıcak BHI agar 50 ml ilavehenicol ve iyice karıştırın. 90 mm Petri kapları içine karışımı dökün.
      NOT: Bu yöntem, büyüyen koloniler (putatif transdüklenmişler) az sayıda belirlenmesini sağlar.
   7. 24-48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plakası.
   8. Bundan başka, 32 mg / L kloramfenikol ile takviye edilmiş yeni bir BHI agar plakları üzerine koloniler aktarılarak direnç koloniler (transdüklenmişler) test edin. Kolonisi PCR ⁷ tarafından cfr genin varlığını doğrulamaktadır.

3. Doğal Dönüşüm

Not: S. aureus doğal transformasyon deneyi daha önceki çalışmamızda ² de tarif edilen yönteme göre gerçekleşir. N315 türevi N2-2.1 ^{2, 7,} alıcı olarak kullanılmıştır. Bu zorlanma ise, iç çekişi odağı çoğaltılamaz edildi yapısal ekspres sigh ² şekilde. det içiniç-ifade yetkinlik varyantlarını izole etmek için nasıl ailed prosedürler, bir önceki açıklamasına ² bakınız. Transfer edilecek direnç marker kloramfenikol değilse, pRIT-nefes (Cm ^R), daha önce tarif edildiği ^{gibi, 2,} iç geçirerek ifade etmek için kullanılabilir. Saflaştırılmış plasmid ya da CFR gelen bütün DNA ekstraktı, S. aureus COL-45 ⁷ transformasyon için donör DNA olarak kullanılmıştır -acquired.

1. Donör DNA'nın hazırlanması
   1. TSB 50 mL içeren 300 ml'lik bir şişe içinde 37 ° C'de çalkalama ile COL-45, gece boyunca yetiştirmek 32 mg / L kloramfenikol ile takviye edilmiştir. Kültür, E. coli HST04 taşıyan pHY300 Plazmid ^{(Tet R)} kontrol deneyi için plazmid elde etmek için.
      NOT: HST04 (baraj ^- / dcm ^-) DNA genleri ¹³ metilazıyla yoksundur. DNA, metilazlar olan diğer geleneksel suşlar da kullanmak olabilirDNA metilasyonu devlet dönüşüm verimini etkilemez çünkü d DNA donör hazırlamak. Seçenek olarak ise, S. aureus, COL suşundan saflaştırılmıştır pT181 Plazmid aynı zamanda transformasyon deneyi ² için bir pozitif kontrol olarak kullanılabilir.
   2. Santrifüj (4 ° C'de 10 dakika boyunca 8,000 x g) hücreleri toplamak.
   3. Bütün DNA arındırmak için bir plazmid DNA ekstraksiyon kiti ya da geleneksel DNA saflaştırma yöntemiyle plasmidler ekstrakte edin.
   4. spektrometresi ile saflaştırılmış DNA sayısal olarak ve kullanılana kadar 4 ° C'de tutun.
      NOT: dönüşüm deneyi, eski genellikle az bir hafta taze bir DNA hazırlık kullanın. Alt DNA preparatları dönüşümün etkinliğini azaltır.
2. Dönüşüm deneyi
   1. Kültür çalkalanarak 37 ° C'de gece boyunca TSB 5 ml alıcı hücre (N2-2.1).
   2. 1.5 ml tüp içine gece boyunca kültür 0.5 mi aktarın. precipisantrifüj (4 ° C 'de 1 dakika süre ile 10,000 x g) hücreleri Tate.
   3. 50 ml'lik bir tüp içinde CS2 ortamı 10 mL süspanse.
      NOT: CS2 orta (Malzeme Tablo orta kompozisyon bakınız) S. aureus ² doğal dönüşümü için yeterlilik uyaran bir tam sentetik ortamıdır. Örneğin TSB ya BHI gibi diğer standart laboratuvar ortamı, dönüşüm ^{2, 13} için uygun değildir.
   4. Geç üstel faz (yaklaşık 8 saat) kadar (180 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de bakterileri büyür.
   5. Santrifüj (4 ° C'de 5 dakika boyunca 5000 xg) hücreleri hasat.
   6. Taze CS2 ortamı 10 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
   7. Hücre süspansiyonuna saflaştırılmış plazmid ya da genom DNA (aşama 3.1.4) 10 ug ekleyin. 37 ° C 'de çalkalanır ve 2.5 saat için 180 rpm.
      Not: DNA ile kısa bir kuluçkalama süresi (<2.5 saat) daha düşük transf nedenormation frekansları.
   8. Santrifüj (5,000 x g 5 dakika, 4 ° C) hücreleri toplamak.
   9. BHI ortamı 10 mL tekrar süspansiyon hücreleri. erimiş BHI agar ve 90 ml 32 mg / L kloramfenikol (kontrol deneyinde veya 5 mg / L tetrasiklin) ile (55 ° C) ek hücre süspansiyonu karıştırın. 90 mm Petri kapları içine karışımı dökün. Hızla serin ve agar katılaşmaya edelim.
   10. 2 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   11. onların direnç özelliklerini teyit etmek için uygun antibiyotik içeren yeni BHI agar plakalarına (kürdan kullanarak) koloniler aktararak üretilen koloniler (dönüştürücüler) çoğaltmak. Kolonisi PCR ⁷ tarafından satın direnç geni (cfr veya tetM) onaylayın.

Sonuçlar

Burada temsil edilen sonuçlar, daha önce yayınlanmıştır (yayıncının izni ile referans ⁷ uyarlanmıştır). Biz HGT üç mekanizmaları araştırmak düşük düzeyli linezolid direnci ve S. aureus suşları PhLOPSA dirençli fenotip ^{14, 15} ifade edilmesine neden olur CFR geninin, potansiyel iletim yollarını inceledi.

...

Tartışmalar

Bu eser S. aureus genetik belirleyicilerin HGT incelemek için üç büyük yöntem açıklanır. Iletimi ve konjügasyon yıllardır incelenmiştir, ancak doğal dönüşümün mevcudiyeti son ² tanındı. Böylece, S. aureus HGT üç ana modları hepsi ile donatılmıştır ve hepsi test genetik belirleyicilerinin olası yayma yolları açıklığa kavuşturmak için gereklidir. Bu çalışmanın amacı, tam protokolleri derlemek ve önceden yayınlanmış çalışmalar?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)	Becton Dickinson	211825
Brain Heart Infusion (BHI)	Becton Dickinson	211059
Nutrient Broth No. 2	Oxoid	CM0067
Sheep blood agar	Eiken Chemical Co.,Ltd.	E-MR96	Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.
Agar powder	Wako Pure Chemical Industries	010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)	Wako Pure Chemical Industries	191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter	Merck Milipore	HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit	QIAGEN	12243