מתודולוגיה לחקר ההעברה האופקית ג&#39;ין<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Summary

אנו מתארים כאן שלושה פרוטוקולים שונים לחקירה במבחנה של נטייה, תמרה, וטרנספורמציה טבעי Staphylococcus aureus.

Abstract

תכונה חשובה אחת של הפתוגן האנושי אופורטוניסטים הגדול Staphylococcus aureus היא היכולת יוצאת הדופן שניתן לה לרכישת התנגדות במהירות לאנטיביוטיקה. מחקרים הגנום עולים כי S. aureus שנושא גנים ארסיים והתנגדות רבים הנמצאים אלמנטים גנטיים ניידים, דבר המצביע על כך העברת גנים אופקית (HGT) ממלאת תפקיד קריטי באבולוצית aureus S.. עם זאת, תיאור מלא ומפורט של המתודולוגיה ששימשה ללמוד HGT ב S. aureus עדיין לוקה בחסר, במיוחד לגבי השינוי הטבעי, אשר דווחה לאחרונה החיידק הזה. עבודה זו מתארת שלושה פרוטוקולים מועילים לחקירה חוץ גופייה של HGT ב S. aureus: הנטייה, תמרה הפאג, וטרנספורמציה טבעי. למטרה זו, הגן CFR (chloramphenicol / התנגדות florfenicol), אשר מקנה את Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, ו Streptogramin A (PhLOPSא) -resistance פנוטיפ, היה בשימוש. הבנת המנגנונים שבאמצעותם S. aureus מעבירה חומרים גנטיים זנים אחרים היא חיונית כדי להבין את הרכישה המהירה של התנגדות ומסייעת להבהיר את דרך ההפצה דיווחה בתוכניות מעקב או להמשיך לחזות את מצב ההפצה בעתיד.

Introduction

Staphylococcus aureus הוא חיידק commensal חיובי-גראם שבאופן טבעי שוכנת חלל עור אף של בני אדם ובעלי חיים. מינים של חיידקים זהו הגורם העיקרי להיווצרות זיהומים הנרכשים בבית חולים בבתי חולים והגדרות בריאות. יתר על כן, יכולתה לפתח עמידות תרכובות מיקרוביאלית שונות הפכה הנהלת הזיהומים הנגרמים על ידי חיידק זה לתוך דאגה עולמית.

שני מסלולים עיקריים מעורבים בהפצת פנוטיפים התנגדות ידועים: הפצת המשובטים של גנוטיפים עמידים בהפצת גורמים גנטיים בין ברכת החיידקים. במקרה של S. aureus, גנים עמידים לאנטיביוטיקה שונה (כמו גם גורמים ארסיים) נמצא להיות מזוהה עם אלמנטים גנטיים ניידים (MGEs) ^1. הנוכחות של אלמנטים אלה בגנום של S. aureus מציינת כי הרכישה והעברת genחומר etic בתוך אוכלוסיית חיידקי יכול לשחק תפקיד חשוב עבור הסתגלות ואבולוציה aureus S..

ניתן להחליף חומר גנטי באמצעות מנגנוני שלושה ידועים של HGT בחיידקים החיוביים גראם: טרנספורמציה, נטייה, תמרה הפאג. טרנספורמציה כרוך את הספיגה של DNA החופשי. כדי לרכוש דנ"א זר, תאי חיידקיים צריכים לפתח שלב פיסיולוגי מיוחד: שלב היכולת. כאשר בשלב זה הוא הגיע, תאי מוסמכות מסוגלים הובלת DNA לתוך הציטופלסמה, רכישת גורמים גנטיים חדשים. במקרה של S. aureus, קיומו של שינוי טבעי הודגם ² לאחרונה. בקנה אחד עם זה, הקבוצה שלנו לשפוך אור על הרלוונטיות של הביטוי של גורם אנחה (גורם סיגמא שעתוק משני נסתר) בשלב סמכותה של פיתוח על איך ביטוי המכונן שלה הופך S. aureus מסוגל מגששתg לשלב יכולת, המאפשר לרכישת פנוטיפים עמיד ידי טרנספורמציה טבעית ^2.

הצמדתי הוא תהליך המערב את העברת הדנ"א מתא בית מגורים אחד (תורם) למשנו (נמען). תאי השני חייבים להיות בקשר ישיר, המאפשרים DNA שיוחלף בעוד מוגן על ידי מבנים מיוחדים, כגון צינורות או נקבובי. העברת ה- DNA על ידי שיטה זו דורשת מנגנון conjugative. ב S. aureus, הפלסמיד אבטיפוס conjugative הוא PGO1, אשר מטפח את אופרון TraA ³ conjugative.

תמרת הפאג כרוכה בהעברת DNA מתא לתא דרך הזיהום בקטריופאג ורומזת לאריזת DNA בקטריאלי, במקום ה- DNA הנגיפי, לתוך קפסיד הפאג. רוב הבידודים S. aureus הם lysogenized ידי bacteriophages ^1. עם בתנאי עקה, ניתן נכרת prophages מן genom חיידקידואר ולעבור מחזור ממס.

אלה הם המנגנונים השלושה ידועים שידור DNA ב S. aureus. ישנם כמה מנגנוני העברה נוספים, כגון "פסאודו-טרנספורמציה" ² ומערכות דמויות הפאג בהעברת האיים פתוגניות ^4. לאחרונה, קבוצה אחת דיווחה כי "צינורות" מעורבים בהעברת חומרים הסלולר (כולל DNA פלסמיד) בין תאים שכנים ^{5, 6,} אך מחקר מעקב לא הופיע מקבוצות אחרות עד כה.

עבודה זו מספקת את המתודולוגיה צורך ללמוד HGT ב S. aureus ידי טיפול השלושה מסלולי העברה עיקריים: נטייה, תמרה, וטרנספורמציה טבעי. התוצאות שהושגו עם מתודולוגיות אלה שימשו ללמוד את העברת הגן CFR (התנגדות chloramphenicol / florfenicol) ביןS. aureus זני ^7. טכניקות שלוש אלה הן כלים צדדיים לחקירת שידור MGE ב S. aureus.

Protocol

הערה: זנים וחומרים המשמשים בעבודה זו מפורטים בטבלה 1 ו טבלה של חומרים, בהתאמה. בניסויי השידור, N315 ו COL CFR נגזר -positive שמשו תורמים של גן CFR (N315-45 ו COL-45). זנים אלו התקבלו בעבר על ידי נטייה, באמצעות כמו התורם זן Staphyloccocus epidermidis -positive CFR הקליני (ST2), בעקבות פרוטוקול הנטייה הסטנדרטי (ראה להלן). זן זה טיפח את הגן CFR על פלסמיד pSCFS7 דמוי ^7.

הצמיד 1. לפי שיטת ההזדווגות המסננת

הערה: זן N315 S. aureus נושאת את הגן CFR (N315-45) ⁷ (ס"מ ^R) שימש התורם. COL ⁸ או ⁹ Mu50 זנים (ט ^R, Cm ^S) שימשו הנמענים. לְהַכפִּיל-מושבות עמידות ^(R ט, Cm ^R) מסוגל לגדול בנוכחות של 32 מ"ג / ליטר של chloramphenicol בתוספת 8 מ"ג / ליטר של טטרציקלין נחשבו transconjugants המשוערת ו נותחו על מנת לקבוע את נוכחותם של CFR ידי מושבת PCR ולקבוע את פרופיל רגישות נמען.

1. בצע נטייה בעקבות פרוטוקול שתואר לעיל ¹⁰ עם כמה שינויים:
   1. הכן 5 מ"ל של תרבות לילה של התורם והמקבל במרק סויה tryptic בינוני (TSB) (עם ובלי 32 chloramphenicol מ"ג / L, בהתאמה), עם רועד ב 37 ° C.
   2. התאם את הצפיפות האופטית (OD ₆₀₀₎ של תרבויות הלילה עד 1 (OD ₆₀₀ = 1.0) באמצעות מדיום TSB טרי. מערבבים 0.5 מ"ל של התרבות התורם (N315-45) עם 0.5 מ"ל של התרבות הנמען (COL או Mu50). הוסף 1 מ"ל של PBS לתערובת.
   3. מעבירים את התערובת של חיידקים על גבי usi קרום מסנן 0.45 מיקרומטרng מערכת משאבת ואקום.
   4. שים את ממברנות סינון על צלחת אגר דם כבשים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 יום.
      הערה: בשלב זה, בינוני מועשר הכרחי כדי לאפשר את הצמיחה של תאים כפולים עמידים.
   5. קח את קרום מסנן מהצלחת להשעות ב 10 מ"ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו (PBS). וורטקס היטב כדי לאסוף את כל החיידקים מצורפים על הממברנה.
   6. הפוך דילול של פי 10 סידורי של ההשעיה חיידקי באמצעות TSB הטרי. פלייט 100 μl של דגימות 0-10 ^-4 מדולל על אגר TSB (TSA) צלחות בתוספת 32 מ"ג / L chloramphenicol ו -8 מ"ג / L טטרציקלין לבחירת transconjugants. פלייט 100 μl של ההשעיה המדוללת (10 ^-5 -10 ^-6) לצלחות TSA עם 8 מ"ג / טטרציקלין L לבד לספור את המספר הכולל של מקבלים. דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18-24 שעות.
   7. לנתח מושבות כפולות עמידות (transconjugants המשוערת) לנוכחות של CFr הגן על ידי מושבת PCR ⁷ והפרופילים הרגישים שלהם (antibiogram).
   8. קבע את antibiogram ידי מדידת ריכוזי מעכבות מינימום (מיקרופונים) באנטיביוטיקה מתאימה בהתאם דיפוזיה דיסק או שיטת microdilution השיטה הסטנדרטית ^11. הפרופיל רגישות של transconjugants חייב להיות זהה לזה של הנמען, למעט chloramphenicol (ותרכובות אחרות מושפע גן CFR). קביעה זו היא חיונית כדי לשלול התנגדות טטרציקלין שפותחה על ידי הזן התורם.

2. התמרה הפאג

הערה: MR83a בקטריופאג השייכת למשפחת Siphoviridae (מלאי מעבדה) שימש בניסויים התמרה. N315-45 שמש תורם CFR לזיהום הפאג. N315, COL, או זנים Mu50 שימשו הנמענים. רכישת CFR נקבעה על ידי ABility של זן הנמען לגדול בנוכחות chloramphenicol 32 מ"ג / L. מושבות גדלו בתנאי זה נותחו על מנת לקבוע את נוכחותם של CFR (על ידי מושבת PCR) ולקבוע את פרופיל הרגישות כדי לשלול אפשרות של זיהום.

1. הגברה הפאג על התורם
   1. הכן תרבות הלילה של N315-45 ב 5 מ"ל של מרק מזין בתוספת 3.6 מ"מ Ca ^{2 +} (NBCaCl ₂₎ על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (180 סל"ד).
      הערה: סידן נדרש זיהום הפאג. עיין חומרי הטבלה. מרק מזין מחברות אחרות עלולים להיתקל בבעיות, כגון ממטרי סידן.
   2. הכן תרבויות משנה על ידי דילול התרבות לילה 1: 1,000 בנפח סופי של 10 מ"ל של NBCaCl ₂ צלוחיות זכוכית 50 מ"ל או צלוחיות זכוכית. לגדל את החיידקים עבור שעה 1 ב 37 ° C עם רועד (180 סל"ד).
   3. הכינו סדרה של MR83a הפאג מדולל NBCaCl ₂ Mediאממ (10 ^-2, 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^-5, ו -10 ^-6). הוסף 20 μl של הפאג מדולל לתוך התרבות חיידקים. כמו כן להכין תרבות שליטה ללא זיהום הפאג, אשר משמשת כביקורת חיובית לצמיחה תא החיידק וניתן להשתמש בו כדי לקבוע את כייל הפאג למחרת.
   4. לגדל את תרבויות על 37 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (100 סל"ד) למשך הלילה.
      הערה: התאים יגדלו במידה מסוימת כאשר הפאג המדביק אינו עולה; אז, הם ייכנסו לתוך שלב תמוגה בשל הגברת הפאג דרך המחזור הממס. התרבות ללא הפאג תציג צמיחה מלאה, בעוד תרבויות עם הפאג תצגנה שיעורים ברורים של שקיפות.
   5. בחר בקבוקוני תרבות פינה אחת או שניים עם הדילול הגבוה ביותר של הפאג הוסיף.
   6. מעבירים את תרבויות לתוך 15 מ"ל צינורות צנטריפוגות. הוסף 250 μl של כלורופורם ומערבבים היטב על ידי היפוך הצינורות.
   7. בצנטריפוגה צינורות ב 5000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C.
   8. מעבירים את supernatants לצינורות טריים ולאחסן אותם ב 4 ° C עד השימוש.
      הערה: הפאג הוא יציב במשך לפחות כמה חודשים, אבל לאחסון הכנת הפאג במשך זמן רב מדי מפחית את היעילות כייל תמרה.
2. מדידת כייל הפאג (assay פלאק הפאג)
   1. כן אגר מרק מזין (1.5% אגרו) בינוני; לשמור אותו חם באמבט מים ב 55 ° C. להוסיף autoclaved 0.5 M CaCl ₂ פתרון למדיום לריכוז סופי של 3.6 מ"מ. יוצקים את התערובת לתבנית 90 מ"מ צלחות פטרי (NBCaCl ₂ צלחות).
   2. הכן תרבות הלילה של N315 ב 5 מ"ל של NBCaCl ₂ ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד; זה יכול להיות מוחלף עם תרבות השליטה המתוארת לעיל (שלב 2.1.3).
   3. הוסף 10 μl של תרבות הלילה לתוך 200 μl של NBCaCl ₂ ובאופן שווה להפיץ אותו לצלחת ₂ NBCaCl. עצור את ההתפשטות כאשר פני השטח שלהצלחת מכוסה בנוזל. תן יבש הצלחת.
   4. הכן דילול סדרתי 01:10 (מ 10 ^-5 -10 ^-10) של הפאג שהוכן קודם לכן (שלב 2.1.8) באמצעות המדיום NBCaCl _2.
   5. ספוט 3 μl של דילול כל הפאג לצלחת מכוסה חיידקים.
   6. דגירה את צלחת הלילה ב C 30 °.
   7. לספור את המספרים רובד לחשב כייל הפאג באמצעות המשוואה הבאה: יחידת פלאק ויוצרים (pfu) / מ"ל = מספר הפלאק x דילול גורם / נפח הבחין (3 x 10 ^-3 מ"ל)
3. תמרת הפאג
   הערה: ברכת הפאג הערוכה בשלב הקודם (2.1.8) משמשת כדי לבדוק את התמרה של גן CFR לתוך זני S. aureus. בניסוי זה, זני N315, COL, או Mu50 משמש נמענים.
   1. הכן את תרבות הלילה של N315, COL, או Mu50 ב 5 מ"ל של NBCaCl ₂ ב 37 ° C עם רועד (180 סל"ד).
   2. לדלל tהוא הפאג ב NBCaCl ₂ עד ~ 10 ⁹ pfu / מ"ל.
   3. בקבוקון זכוכית 50 מ"ל, לערבב 500 μl של תרבות לילה, 500 μl של טרי NBCaCl _2, ו 1 מ"ל של הפאג (~ 10 מ"ל ⁹ pfu /); ריבוי הזיהום הצפוי (משרד הפנים) לא יעלה על 1. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (100 סל"ד) למשך 30 דקות.
      הערה: עיבוד תרמי של תאי נמען רק לפני התוספת של הפאג (52 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות כדי להשבית את אנזימי הגבלת endogeneous) עשוי להגביר את היעילות ^12.
   4. הוסף 50 μl של 20% Na ₃ -Citrate. המשך רעד עדין במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: Na ₃ -Citrate משמש chelator מתונה של סידן.
   5. כן עירוי המוח-לב מומס (BHI) אגר בינוני (1.5% אגרו) ולשמור אותו באמבט מים ב 55 ° C.
   6. מעביר את התערובת הפאג-חיידק בבקבוק 100 מיליליטר, להוסיף 50 מיליליטר של אגר BHI החם בתוספת 32 מ"ג / L chloramphenicol, ומערבבים היטב. יוצקים את התערובת לתוך מנות 90 מ"מ פטרי.
      הערה: שיטה זו מאפשרת זיהוי של מספר קטן של מושבות גדלות (transductants המשוערת).
   7. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות.
   8. בהמשך לבדוק המושבות שנוצר (transductants) להתנגדות ידי העברת מושבות על צלחות אגר BHI חדשים בתוספת 32 מ"ג / L chloramphenicol. לאשר את קיומו של הגן CFR ידי המושבה ⁷ PCR.

3. שינוי טבעי

הערה: assay השינוי הטבעי S. aureus בוצע בעקבות השיטה המתוארת במחקר הקודם שלנו ^2. נגזר N315, ^{2 N2-2.1, 7,} שמש הנמען. בנימה זו, מוקד אנחה היה כפולות כדי להביע constitutively אנחה ^2. לקבלת detנהלים שמציקים על איך לבודד גרסות יכולת להביע אנחה, מעיינים תיאור קודם ^2. אם סמן התנגדות שיועברו אינו chloramphenicol, pRIT-אנחה (ס"מ ^R) שניתן להשתמש בהם כדי להביע אנחה, כפי שתואר לעיל ^2. פלסמיד מטוהרים או תמצית ה- DNA שלם CFR -acquired S. aureus COL-45 ⁷ משמש DNA התורם לטרנספורמציה.

1. הכנת DNA התורם
   1. טפחו COL-45 לילה עם רועד ב 37 ° C בבקבוק 300 מ"ל המכיל 50 מ"ל של TSB בתוספת chloramphenicol 32 מ"ג / L. תרבות E. coli HST04 נושאת pHY300 פלסמיד ^{(ט R)} כדי לחלץ את הפלסמיד עבור הניסוי השליט.
      הערה: HST04 (סכר ^- / DCM ^-) חסרה את ה- DNA methylase גנים ^13. זנים אחרים קונבנציונליים עם methylases DNA יכול להיות גם שימושד להכין תורם DNA, משום שמדינת מתילציה DNA אינה משפיעה על יעילות השינוי. לחלופין, פלסמיד pT181 מטוהרים מן זן S. aureus COL יכול לשמש גם כביקורת חיובית עבור assay טרנספורמציה ^2.
   2. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה (8,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C).
   3. חלץ פלסמידים באמצעות ערכת חילוץ DNA פלסמיד או שיטה לטיהור DNA קונבנציונלית לטהר את ה- DNA כולו.
   4. לכמת את ה- DNA מטוהרים על ידי ספקטרומטר ולשמור אותו ב 4 ° C עד השימוש.
      הערה: השתמש ה- DNA הכנה טריה עבור assay טרנספורמציה, בדרך כלל פחות משבוע ישן. הכנות הישנות DNA להפחית את היעילות של טרנספורמציה.
2. assay טרנספורמציה
   1. תרבות התא המקבל (N2-2.1) לילה ב 5 מ"ל של TSB על 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
   2. העבר 0.5 מ"ל של תרבות הלילה לתוך צינור 1.5 מ"ל. Precipiטייט התאים על ידי צנטריפוגה (10,000 XG במשך 1 דקות ב 4 ° C).
   3. להשעות את התאים עם 10 מ"ל של מדיום CS2 בתוך שפופרת 50 מ"ל.
      הערה: בינוני CS2 הוא מדיום סינטטי מלא שגרם יכולת לשינוי טבעי S. aureus ² (ראה הרכב הבינוני בטבלת החומר). תקשורת מעבדה סטנדרטית אחרת, כגון TSB או BHI, אינה מתאימה טרנספורמציה ^{2, 13.}
   4. לגדל את החיידקים על 37 ° C עם רועד (180 סל"ד) עד לשלב מעריכים מאוחר (כ -8 שעות).
   5. קציר התאים על ידי צנטריפוגה (5,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C).
   6. Resuspend תאים 10 מיליליטר של מדיום CS2 טרי.
   7. הוסף 10 מיקרוגרם של פלסמיד מטוהרים או DNA בגנום (שלב 3.1.4) על השעיית התא. לנער על 37 מעלות צלזיוס ו 180 סל"ד במשך 2.5 שעות.
      הערה: פעמי דגירה קצרות יותר עם DNA (<2.5 שעות) לגרום transf הנמוךתדרי ormation.
   8. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה (5,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C).
   9. Resuspend התאים 10 מ"ל של מדיום BHI. מערבבים את ההשעיה תא עם 90 מ"ל של אגר BHI מומסת (55 מעלות צלזיוס) מוסף עם 32 מ"ג / chloramphenicol L (או 5 מ"ג / טטרציקלין L בניסוי שליטה). יוצקים את התערובת לתוך מנות 90 מ"מ פטרי. במהירות מגניבה ולתת אגרו לחזק.
   10. דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
   11. לשכפל מושבות שנוצרו (transformants) על ידי העברת המושבות (באמצעות קיסמים) צלחות אגרו BHI חדשים המכילות את האנטיביוטיקה המתאימה כדי לאשר מאפייני התנגדותם. אשר את גן התנגדות רכש (CFR או tetM) על ידי מושבה ⁷ PCR.

תוצאות

התוצאות יוצג כאן פורסמו בעבר (עיבוד התייחסות ⁷ באישורו של בעל האתר). למדנו את מסלולי שידור הפוטנציאל של גן CFR, הגורמת התנגדות linezolid ברמה הנמוכה לבין הביטוי של פנוטיפ PhLOPSA-התנגדות ^{14, 15} זני S. aureus, על י...

Discussion

עבודה זו מתארת שלוש השיטות העיקריות ללמוד את HGT של גורמים גנטיים ב S. aureus. למרות התמרה והזדווגות נחקרו במשך עשרות שנים, את קיומו של שינוי טבעי היה רק לאחרונה מוכר ^2. לפיכך, S. aureus מצויד בכל אחד משלושה המצבים הגדולים של HGT, ובדיקת כולם נדרשה להבהיר ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)	Becton Dickinson	211825
Brain Heart Infusion (BHI)	Becton Dickinson	211059
Nutrient Broth No. 2	Oxoid	CM0067
Sheep blood agar	Eiken Chemical Co.,Ltd.	E-MR96	Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.
Agar powder	Wako Pure Chemical Industries	010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)	Wako Pure Chemical Industries	191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter	Merck Milipore	HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit	QIAGEN	12243