Méthodologie de l&#39;étude du transfert horizontal de gènes dans<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Résumé

Nous décrivons ici trois protocoles différents pour l'enquête in vitro de la conjugaison, la transduction et la transformation naturelle de Staphylococcus aureus.

Résumé

Une caractéristique importante de la principale pathogène humain opportuniste Staphylococcus aureus est son extraordinaire capacité à acquérir rapidement une résistance aux antibiotiques. Les études génomiques révèlent que S. aureus comporte de nombreux gènes de virulence et de résistance situées dans des éléments génétiques mobiles, ce qui suggère que le transfert horizontal de gènes (HGT) joue un rôle essentiel dans l' évolution de S. aureus. Cependant, une description complète et détaillée de la méthodologie utilisée pour étudier HGT à S. aureus qui manque encore, en particulier en ce qui concerne la transformation naturelle, qui a été récemment rapporté dans cette bactérie. Ce travail décrit trois protocoles qui sont utiles pour l'enquête in vitro de HGT à S. aureus: la conjugaison, la transduction du phage, et la transformation naturelle. Dans ce but, le gène cfr (chloramphénicol / résistance à la florfénicol), qui confère aux phénicols, Lincosamides, oxazolidinones, pleuromutilines et la streptogramine A (PhLOPSA) -résistance phénotype a été utilisé. Comprendre les mécanismes par lesquels S. aureus transfère le matériel génétique à d' autres souches est essentielle pour comprendre l'acquisition rapide de la résistance et aide à clarifier les modes de diffusion déclarés dans les programmes de surveillance ou pour prévoir en outre le mode d' étalement dans le futur.

Introduction

Staphylococcus aureus est une bactérie à Gram positif commensal qui habite naturellement la cavité de la peau et du nez des êtres humains et des animaux. Cette espèce bactérienne est la principale cause des infections nosocomiales dans les hôpitaux et les établissements de santé. De plus, sa capacité à développer une résistance aux différents composés antimicrobiens a fait de la gestion des infections causées par cette bactérie dans une préoccupation mondiale.

Deux principales voies impliquées dans la propagation des phénotypes de résistance sont connus: la diffusion clonale de génotypes résistants et la diffusion des déterminants génétiques entre la piscine bactérienne. Dans le cas de S. aureus, les différents gènes de résistance aux antibiotiques (ainsi que les déterminants de la virulence) se sont révélés être associés à des éléments génétiques mobiles ⁽¹⁾ MGES. La présence de ces éléments dans le génome de S. aureus indique que l'acquisition et le transfert de génmatériau étique au sein de la population bactérienne pourrait jouer un rôle important pour S. aureus adaptation et d' évolution.

Le matériel génétique peut être échangé par le biais de trois mécanismes bien connus de HGT dans les bactéries Gram-positives: la transformation, la conjugaison et la transduction du phage. La transformation implique l'absorption de l'ADN libre. Pour acquérir de l'ADN étranger, les cellules bactériennes ont besoin de développer une phase physiologique particulière: le stade de la compétence. Lorsque cette étape est atteinte, les cellules compétentes sont capables de transporter l'ADN dans le cytoplasme, l'acquisition de nouveaux déterminants génétiques. Dans le cas de S. aureus, l'existence de la transformation naturelle a été démontrée récemment ^2. Conformément à cela, notre groupe a mis en lumière la pertinence de l'expression du facteur de SigH (une transcription secondaire facteur sigma cryptique) au stade de la compétence du développement et sur la façon dont son expression constitutive rend S. aureus capable de reaching stade de la compétence, qui permet l'acquisition de phénotypes résistants par transformation naturelle ^2.

Conjugaison est un processus impliquant la transmission de l'ADN d'une cellule vivante (donneur) à un autre (receveur). Ces deux cellules doivent être en contact direct, permettant à l'ADN à échanger tout en étant protégés par des structures spéciales, telles que des tubes ou des pores. Le transfert de l'ADN par ce procédé nécessite la machine conjugatif. Chez S. aureus, le plasmide prototype conjugatif est PGO1, qui abrite l'opéron conjugatif Traa ^3.

Phagique transduction implique le transfert d'ADN d'une cellule à une infection par bactériophage et implique le garnissage de l'ADN bactérien, au lieu de l'ADN viral dans la capside de phage. La plupart des isolats de S. aureus sont lysogénées par bactériophages ^1. Des conditions de stress, prophages peuvent être excisées à partir du génome bactériene et le décalage du cycle lytique.

Ce sont les trois mécanismes bien connus pour la transmission de l' ADN de S. aureus. Il y a des mécanismes de transfert supplémentaires, tels que des «pseudo-transformation" ² et les systèmes de phages comme dans le transfert des îlots de pathogénicité ^4. Récemment, un groupe a rapporté que «nanotubes» sont impliqués dans le transfert de matériaux cellulaires (y compris l' ADN plasmidique) entre les cellules voisines ^{5, 6,} mais une étude de suivi n'a pas paru d'autres groupes jusqu'à présent.

Ce travail fournit la méthodologie nécessaire pour étudier HGT à S. aureus en abordant les trois principales voies de transfert: conjugaison, la transduction et la transformation naturelle. Les résultats obtenus avec ces méthodes ont été utilisées pour étudier la transmission du gène cfr (chloramphénicol / résistance de florfénicol) parmiLes souches de S. aureus ^7. Ces trois techniques sont des outils polyvalents pour l'enquête de la transmission MGE à S. aureus.

Protocole

NOTE: Les souches et les matériaux utilisés dans ce travail sont énumérés dans le tableau 1 et la Table des matières, respectivement. Dans les expériences de transmission, N315 et COL cfr dérivés -positif ont été utilisés en tant que donneurs du gène cfr (N315-45 et COL-45). Ces souches ont été obtenues précédemment par conjugaison, en utilisant comme donneur souche Staphylococcus epidermidis un cfr clinique (ST2), suivant le protocole de conjugaison standard (voir ci - dessous). Cette souche nourrissait le gène cfr sur un plasmide pSCFS7-like ^7.

1. Conjugaison Utilisation de la méthode du filtre de conjugaison

NOTE: Une souche de S. aureus N315 portant le gène cfr (N315-45) ⁷ (Cm ^R) a été utilisé comme donneur. COL ⁸ ou MU50 ⁹ souches (Tet ^{R, S} cm) ont été utilisés comme les destinataires. Double-les colonies résistantes (Tet ^R, Cm ^R) capable de croître en présence de 32 mg / l de chloramphenicol et de 8 mg / L de tetracycline ont été considérés comme des transconjugants putatifs et ont été analysés pour déterminer la présence d'cfr par PCR sur colonie et pour déterminer la destinataire profil de sensibilité.

1. Effectuer la conjugaison suivant un protocole décrit précédemment ¹⁰ avec quelques modifications:
   1. Préparer 5 ml de culture de la nuit du donneur et du receveur dans un bouillon de soja (TSB) moyen tryptique (avec et sans 32 mg / L de chloramphénicol, respectivement), en agitant à 37 ° C.
   2. Réglez la densité optique (DO ₆₀₀₎ des cultures d'une nuit à 1 (DO ₆₀₀ = 1,0) en utilisant milieu TSB frais. Mélanger 0,5 ml de la culture du donneur (N315-45) avec 0,5 ml de la culture du destinataire (COL ou MU50). Ajouter 1 ml de PBS au mélange.
   3. Transférer le mélange de bactéries sur un 0,45 um membrane filtrante using d'un système de pompe à vide.
   4. Mettez les membranes de filtration sur une plaque de gélose au sang de mouton. Incuber à 37 ° C pendant 1 jour.
      NOTE: Dans cette étape, le milieu enrichi est nécessaire pour permettre la croissance des cellules doubles-résistantes.
   5. Sortir la membrane filtrante de la plaque et mettre en suspension dans 10 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Vortex ainsi de recueillir toutes les bactéries fixées sur la membrane.
   6. Faire une série de 10 fois la dilution de la suspension bactérienne à l'aide du BST frais. Plate 100 pi des 0-10 ^-4 échantillons dilués sur gélose TSB (TSA) plaques complétées par 32 mg / L de chloramphénicol et 8 mg / L tétracycline pour la sélection des transconjugants. Plaque 100 pi de la suspension diluée (10 ^-5 -10 ^-6) sur des plaques de TSA avec 8 mg / L tétracycline seule pour compter le nombre total de bénéficiaires. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 18-24 h.
   7. Analyser colonies doubles-résistantes (transconjugants putatifs) pour la présence de la cfgène r par PCR sur colonie ⁷ et leurs profils de sensibilité (antibiogramme).
   8. Déterminer l'antibiogramme en mesurant les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des antibiotiques appropriés selon la méthode de microdilution ou de diffusion sur disque ¹¹ méthode standard. Le profil de sensibilité de transconjugants doit être identique au destinataire, à l' exception de la chloramphénicol (et d' autres composés affectés par le gène CCR). Cette détermination est essentielle pour éliminer la résistance à la tétracycline développée par la souche donneuse.

2. Phage transduction

NOTE: Le MR83a bactériophage appartenant à la famille Siphoviridae (laboratoire stock) a été utilisé dans les expériences de transduction. N315-45 a été utilisé comme donneur cfr pour l' infection par le phage. N315, COL, ou MU50 souches ont été utilisées comme les destinataires. L'acquisition de cfr a été déterminée par le abilité de la souche receveuse de croître en présence de 32 mg / l de chloramphénicol. Les colonies qui poussent sous cette condition ont été analysées pour déterminer la présence de cfr (par colonie PCR) et de déterminer le profil de sensibilité pour exclure la contamination potentielle.

1. L' amplification des phages sur le donneur
   1. Préparer une culture d'une nuit de N315-45 dans 5 ml de bouillon nutritif supplémenté avec 3,6 mM de Ca ²⁺ (NBCaCl ₂₎ à 37 ° C sous agitation (180 tpm).
      NOTE: Le calcium est nécessaire pour l'infection par le phage. Voir le tableau des matériaux. Bouillon nutritif d'autres entreprises pourrait avoir des problèmes, tels que la précipitation de calcium.
   2. Préparer des sous - cultures par dilution de la culture d'une nuit de 1: 1000 dans un volume final de 10 mL de NBCaCl ₂ dans 50 ml de flacons en verre ou des fioles en verre. Cultiver les bactéries pendant 1 heure à 37 ° C sous agitation (180 tpm).
   3. Préparer une série de dilution de phages dans MR83a NBCaCl ₂ médium (10 ^{-2, -3} 10, 10 ^-4, 10 ^-5 et 10 ^-6). Ajouter 20 pi de phages dilués dans la culture bactérienne. préparer aussi une culture témoin sans infection par le phage, qui sert de témoin positif pour la croissance de la cellule bactérienne et peut être utilisé pour déterminer le titre du phage dès le lendemain.
   4. Cultiver les cultures à 37 ° C avec agitation douce (100 rpm) pendant la nuit.
      REMARQUE: Les cellules se développent dans une certaine mesure lorsque le phage infectant ne dépasse pas; puis, ils vont entrer en phase de lyse en raison de l'amplification de phage à travers le cycle lytique. La culture sans phage montrera pleine croissance, alors que les cultures avec phage montreront des taux distincts de transparence.
   5. Sélectionnez un ou deux défrichées flacons de culture avec la plus forte dilution du phage ajouté.
   6. Transférer les cultures en tubes de 15 ml de centrifugeuse. Ajouter 250 ul de chloroforme et bien mélanger en inversant les tubes.
   7. Centrifuger les tubes à 5000 xg pendant 20 min à 4 ° C.
   8. Transférer les surnageants dans des tubes frais et les stocker à 4 ° C jusqu'à utilisation.
      NOTE: Le phage est stable pendant au moins quelques mois, mais le stockage de la préparation de phages trop longue diminue le rendement du titre et de la transduction.
2. Mesurer le titre de phage (phage plaque test)
   1. Préparer la gélose bouillon nutritif (1,5% de gélose); garder au chaud dans un bain-marie à 55 ° C. Ajouter une solution de CaCl autoclavée M 0,5 ₂ au milieu à une concentration finale de 3,6 mM. Versez- la dans 90 mm des boîtes de Pétri (NBCaCl ₂ plaques).
   2. Préparer une culture de nuit de N315 dans 5 ml de NBCaCl ₂ à 37 ° C avec agitation; ce qui peut être substitué par la culture témoin décrit ci-dessus (étape 2.1.3).
   3. Ajouter 10 ul de la culture de la nuit dans 200 ul de NBCaCl ₂ et répartir uniformément le sur la plaque NBCaCl _2. Arrêter la propagation lorsque la surface dela plaque est recouverte de liquide. Laissez la plaque sèche.
   4. Faire une dilution 1:10 de série (de 10 ^-5 -10 ^-10) du phage préparé précédemment (étape 2.1.8) en utilisant NBCaCl moyen _2.
   5. Point 3 pi de chaque phage dilution sur la plaque recouverte de bactéries.
   6. Incuber la plaque pendant une nuit à 30 ° C.
   7. Comptez les numéros de plaque et calculer le titre de phage en utilisant l'équation suivante: Plaque unité de formation (pfu) / ml = Nombre de plaques x facteur de dilution / volume de tacheté (3 x 10 ^-3 ml)
3. Phage transduction
   NOTE: Le pool de phage préparé à l'étape précédente (2.1.8) est utilisé pour tester la transduction du gène cfr dans les souches de S. aureus. Dans cette expérience, les souches N315, COL, ou MU50 sont utilisés comme les destinataires.
   1. Préparer la culture de nuit de N315, COL, ou MU50 dans 5 ml de NBCaCl ₂ à 37 ° C sous agitation (180 rpm).
   2. Diluer til phages dans NBCaCl ₂ à ~ 10 ⁹ pfu / mL.
   3. Dans un flacon de 50 ml en verre, mélanger 500 pi de culture de la nuit, 500 ul de frais NBCaCl _2, et 1 ml de phage (~ 10 ⁹ pfu / ml); la multiplicité attendue d'infection (MOI) ne doit pas dépasser 1. Incuber le mélange à 37 ° C avec agitation douce par secousses (100 rpm) pendant 30 min.
      REMARQUE: Le traitement thermique des cellules receveuses juste avant l'addition de phages ( à 52 ° C pendant 2 minutes pour inactiver les enzymes de restriction endogène) peut augmenter l'efficacité ^12.
   4. Ajouter 50 ul de 20% de Na ₃ -citrate. Continuer agitation douce pendant 30 min à 37 ° C.
      NOTE: Na ₃ -citrate agit comme un chélateur modéré de calcium.
   5. Préparer fondu infusion cerveau-coeur (BHI) agar (1,5% de gélose) et le garder dans un bain d'eau à 55 ° C.
   6. Transférer le mélange bactérie-phage à un flacon de 100 ml, ajouter 50 ml de gélose BHI chaude additionné de 32 mg / L chloramphenicol, et bien mélanger. Verser le mélange dans les 90 mm des boîtes de Pétri.
      NOTE: Cette méthode permet la détection d'un petit nombre de colonies en croissance (de transductants putatifs).
   7. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 24-48 h.
   8. tester davantage les colonies générées (les transductants) pour la résistance en transférant des colonies sur de nouvelles plaques de gélose BHI supplémenté avec 32 mg / l de chloramphenicol. Confirmer la présence du gène cfr par PCR sur colonie ^7.

3. Transformation naturelle

NOTE: Le test de transformation naturelle de S. aureus a été effectuée suivant la méthode décrite dans notre étude précédente ^2. Dérivé N315, N2-2.1 ^{2, 7,} a été utilisé comme receveur. Dans cette souche, le locus sigH a été dupliqué pour constitutivement SigH express ^2. Pour detprocédures ailed sur la façon d'isoler des variants de compétence Soupir exprimant, s'il vous plaît voir la description précédente ^2. Si le marqueur de résistance à transférer ne chloramphénicol, pRIT-sigh (Cm ^R) peut être utilisé pour exprimer SigH, comme décrit précédemment ^2. Plasmide purifié ou d'un extrait entier d'ADN à partir cfr -acquired S. aureus ^COL-7 45 est utilisé comme donneur d' ADN pour la transformation.

1. Préparation de l' ADN du donneur
   1. Cultiver COL-45 pendant une nuit sous agitation à 37 ° C dans un ballon de 300 ml contenant 50 ml de TSB complémenté avec 32 mg / l de chloramphenicol. Culture de E. coli portant HST04 pHY300 plasmide ^(TetR) pour extraire le plasmide pour l'expérience témoin.
      NOTE: HST04 (barrage ^- / dcm ^-) manque l'ADN méthylase gènes ^13. D'autres souches classiques avec des méthylases d'ADN peut également être utiliséd pour préparer l'ADN du donneur, parce que l'état de méthylation d'ADN ne modifie pas l'efficacité de transformation. En variante, le plasmide pT181 purifié à partir de la souche de S. aureus COL peut également être utilisé comme témoin positif pour la transformation de dosage ^2.
   2. Recueillir les cellules par centrifugation (8000 g pendant 10 min à 4 ° C).
   3. Extraire les plasmides en utilisant un kit d'extraction d'ADN de plasmide ou d'un procédé de purification d'ADN classique pour purifier l'ADN entier.
   4. Quantifier l'ADN purifié par spectromètre et maintenir à 4 ° C jusqu'à utilisation.
      REMARQUE: Utilisez une préparation d'ADN frais pour le test de transformation, généralement moins d'une semaine vieux. Préparations vieux ADN réduisent l'efficacité de la transformation.
2. Essai de transformation
   1. Culture de la cellule réceptrice (de N2-2.1) pendant la nuit dans 5 ml de TSB à 37 ° C avec agitation.
   2. Transférer 0,5 ml de culture d'une nuit dans un tube de 1,5 ml. Precipiliter les cellules par centrifugation (10 000 x g pendant 1 min à 4 ° C).
   3. Les cellules en suspension avec 10 ml de milieu CS2 dans un tube de 50 ml.
      NOTE: moyenne CS2 est un milieu synthétique complet qui induit compétence pour la transformation naturelle de S. aureus ² (voir la composition du milieu dans le tableau Material). Autres médias de laboratoire standard, tels que TSB ou BHI, ne sont pas adaptés pour la transformation ^{2, 13.}
   4. Cultiver les bactéries à 37 ° C sous agitation (180 rpm) jusqu'à la fin de la phase exponentielle (environ 8 heures).
   5. Récolter les cellules par centrifugation (5000 g pendant 5 min à 4 ° C).
   6. Resuspendre les cellules dans 10 ml de milieu CS2 frais.
   7. Ajouter 10 pg de plasmide purifié ou de l'ADN génomique (étape 3.1.4) à la suspension cellulaire. Agiter à 37 ° C et 180 tours par minute pendant 2,5 heures.
      NOTE: Réduction des temps d'incubation avec de l'ADN (<2,5 h) entraîner transf inférieurefréquences ormation.
   8. Recueillir les cellules par centrifugation (5000 g pendant 5 min à 4 ° C).
   9. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu BHI. Mélanger la suspension cellulaire avec 90 ml de gélose BHI fondu (55 ° C), supplément de 32 mg / l de chloramphenicol (ou 5 mg / L de tetracycline dans l'expérience témoin). Verser le mélange dans les 90 mm des boîtes de Pétri. Swiftly fraîche et laisser la gélose solidifier.
   10. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 2 jours.
   11. Répliquer les colonies générées (transformants) en transférant des colonies (en utilisant des cure-dents) vers de nouvelles plaques de gélose BHI contenant les antibiotiques appropriés afin de confirmer leurs caractéristiques de résistance. Confirmer le gène de résistance acquise (cfr ou tetM) par PCR sur colonie ^7.

Résultats

Les résultats représentés ici ont été publiées précédemment (adapté de la référence ⁷ avec la permission de l'éditeur). Nous avons étudié les voies de transmission potentielles du gène cfr, ce qui provoque une faible résistance au niveau du linézolide et l'expression du phénotype de résistance PhLOPSA ^{14, 15} dans les souches de S. aureus, en étudiant trois méc...

Discussion

Ce travail décrit les trois méthodes principales pour étudier la HGT des déterminants génétiques de S. aureus. Bien que la transduction et la conjugaison ont été étudiés depuis des décennies, l'existence de la transformation naturelle a été récemment reconnue ^2. Ainsi, S. aureus est équipé de tous les trois principaux modes de HGT, et de tester chacun d'entre eux est nécessaire pour clarifier les voies de diffusion possibles des déterminants gén?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)	Becton Dickinson	211825
Brain Heart Infusion (BHI)	Becton Dickinson	211059
Nutrient Broth No. 2	Oxoid	CM0067
Sheep blood agar	Eiken Chemical Co.,Ltd.	E-MR96	Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.
Agar powder	Wako Pure Chemical Industries	010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)	Wako Pure Chemical Industries	191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter	Merck Milipore	HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit	QIAGEN	12243