Metodologia per lo studio del orizzontale Gene Transfer in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Riepilogo

Descriviamo qui tre protocolli diversi per la ricerca in vitro di coniugazione, trasduzione e trasformazione naturale in Staphylococcus aureus.

Abstract

Una caratteristica importante dei principali patogeni umani opportunista Staphylococcus aureus è la sua straordinaria capacità di acquisire rapidamente la resistenza agli antibiotici. Studi di genomica rivelano che S. aureus porta molti geni di virulenza e di resistenza si trovano in elementi genetici mobili, suggerendo che il trasferimento genico orizzontale (HGT) svolge un ruolo critico in S. aureus evoluzione. Tuttavia, una descrizione completa e dettagliata della metodologia utilizzata per lo studio HGT in S. aureus è ancora carente, soprattutto per quanto riguarda la trasformazione naturale, che è stato recentemente riportato in questo batterio. Questo lavoro descrive tre protocolli che sono utili per le indagini in vitro di HGT in S. aureus: coniugazione, trasduzione dei fagi, e trasformazione naturale. A questo scopo, il gene CFR (cloramfenicolo / resistenza florfenicolo), che conferisce le fenicoli, Lincosamidi, oxazolidinoni, pleuromutiline, e streptogramine A (PhLOPSA) -Resistenza fenotipo, è stato utilizzato. La comprensione dei meccanismi attraverso i quali S. aureus trasferisce materiale genetico ad altri ceppi è essenziale per comprendere la rapida acquisizione di resistenza e aiuta a chiarire le modalità di diffusione riportati in programmi di sorveglianza o per prevedere ulteriormente la modalità di diffusione in futuro.

Introduzione

Staphylococcus aureus è un batterio Gram-positivi commensale che abita naturalmente la cavità nasale e la pelle degli esseri umani e degli animali. Questa specie batterica è la principale causa di infezioni nosocomiali negli ospedali e case di cura. Inoltre, la sua capacità di sviluppare resistenza a diversi composti antimicrobici ha reso la gestione delle infezioni causate da questo batterio in un problema globale.

Due vie principali coinvolti nella diffusione di fenotipi di resistenza sono noti: la diffusione clonale di genotipi resistenti e la diffusione dei determinanti genetici tra la piscina batterica. Nel caso di S. aureus, diversi geni di resistenza agli antibiotici (così come determinanti di virulenza) sono stati trovati per essere associate a elementi genetici mobili (MGEs) ^1. La presenza di questi elementi nel genoma di S. aureus indica che l'acquisizione e il trasferimento di genmateriale etico all'interno della popolazione batterica potrebbe svolgere un ruolo importante per S. aureus l'adattamento e l'evoluzione.

Il materiale genetico può essere scambiato attraverso tre meccanismi ben noti di HGT nei batteri Gram-positivi: trasformazione, coniugazione, e fago trasduzione. La trasformazione comporta l'assorbimento del DNA libero. Per acquisire DNA estraneo, le cellule batteriche devono sviluppare una speciale fase fisiologica: la fase di competenza. Quando viene raggiunto questo stadio, le cellule competenti sono in grado di trasportare DNA nel citoplasma, acquisire nuovi determinanti genetici. Nel caso di S. aureus, l'esistenza di trasformazione naturale è stato recentemente dimostrato ^2. In linea con questo, il nostro gruppo ha messo in luce l'importanza dell'espressione del fattore Sigh (un criptico trascrizione secondario fattore sigma) in fase di competenze di sviluppo e su come la sua espressione costitutiva rende S. aureus in grado di reaching la fase di competenza, che consente l'acquisizione di fenotipi resistenti da trasformazione naturale ^2.

La coniugazione è un processo che comporta la trasmissione di DNA da una cellula vivente (donatore) ad un altro (ricevente). Entrambe le cellule devono essere a contatto diretto, permettendo il DNA da scambiare essendo protetto da strutture speciali, come tubi o pori. Il trasferimento di DNA da questo metodo richiede la macchina conjugative. In S. aureus, il plasmide prototipo conjugative è PGO1, che ospita il conjugative operone Traa ^3.

Phage trasduzione comporta il trasferimento di DNA da cellula a cellula attraverso l'infezione batteriofago ed implica il confezionamento di DNA batterico, invece di DNA virale, nel capside fagico. La maggior parte degli isolati di S. aureus sono lysogenized dai batteriofagi ^1. Al condizioni di stress, profagi possono essere asportati dal genom battericaee passaggio al ciclo litico.

Questi sono i tre meccanismi ben noti per la trasmissione DNA in S. aureus. Ci sono alcuni meccanismi di trasferimento aggiuntivi, come "pseudo-trasformazione" ² e sistemi fago come nel trasferimento delle isole di patogenicità ^4. Recentemente, un gruppo riferito che "nanotubi" sono coinvolte nel trasferimento di materiali cellulari (compreso il DNA plasmidico) tra cellule adiacenti ^{5, 6,} ma un studio di follow-up non è apparsa altri gruppi finora.

Questo lavoro fornisce la metodologia necessario studiare HGT in S. aureus affrontando le tre principali vie di trasferimento: coniugazione, trasduzione e trasformazione naturale. I risultati ottenuti con queste metodologie sono stati usati per studiare la trasmissione del gene cfr (cloramfenicolo / resistenza Florfenicolo) traS. aureus ceppi ^7. Queste tre tecniche sono strumenti versatili per l'indagine della trasmissione MGE in S. aureus.

Protocollo

NOTA: I ceppi e materiali utilizzati in questo lavoro sono elencati nella Tabella 1 e la Tabella dei Materiali rispettivamente. Negli esperimenti di trasmissione, N315 e COL CFR derivati -positive sono stati utilizzati come donatori del gene CFR (N315-45 e COL-45). Questi ceppi sono stati precedentemente ottenuti per coniugazione, utilizzando come donatore di un quadro comune di riferimento clinico -positivo ceppo Staphyloccocus epidermidis (ST2), seguendo il protocollo standard di coniugazione (vedi sotto). Questo ceppo ospitava il gene cfr su un plasmide pSCFS7 simile ^7.

1. Coniugazione Usando il metodo del filtro-accoppiamento

NOTA: Un ceppo di S. aureus N315 porta il gene cfr (N315-45) ⁷ (Cm ^R) è stato utilizzato come donatore. COL ⁸ o ⁹ Mu50 ceppi (Tet ^R, Cm ^S) sono stati utilizzati come destinatari. Raddoppiare-colonie resistenti (Tet ^R, Cm ^R) in grado di crescere in presenza di 32 mg / L di cloramfenicolo e di 8 mg / L di tetraciclina sono stati considerati transconjugants putativi e sono stati analizzati per determinare la presenza di cfr dalla colonia PCR e di determinare il destinatario profilo di suscettibilità.

1. Eseguire coniugazione seguendo un protocollo precedentemente descritto ¹⁰ con alcune modifiche:
   1. Preparare 5 ml di cultura durante la notte del donatore e ricevente in media Tryptic brodo di soia (TSB) (con e senza 32 mg / L cloramfenicolo, rispettivamente), con agitazione a 37 ° C.
   2. Regolare la densità ottica (OD ₆₀₀₎ delle culture overnight a 1 (OD ₆₀₀ = 1.0) utilizzando medie TSB fresco. Mescolare 0,5 ml della cultura del donatore (N315-45) con 0,5 ml di cultura ricevente (COL o Mu50). Aggiungere 1 ml di PBS alla miscela.
   3. Trasferire la miscela di batteri su una membrana filtrante usi 0,45 micronng un sistema pompa a vuoto.
   4. Mettere le membrane filtranti su una piastra di agar sangue di pecora. Incubare a 37 ° C per 1 giorni.
      NOTA: In questo passaggio, terreno arricchito è necessario per consentire la crescita di cellule doppio-resistenti.
   5. Estrarre la membrana filtrante dalla piastra e sospendere in 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Vortex bene a raccogliere tutti i batteri attaccati sulla membrana.
   6. Effettuare una diluizione di 10 volte seriale della sospensione batterica utilizzando TSB fresco. Piatto 100 l di 0-10 ^-4 campioni diluiti su TSB agar (TSA) piastre integrato con 32 mg / L cloramfenicolo e 8 mg / L di tetraciclina per la selezione di transconjugants. Piastra 100 microlitri della sospensione diluita (10 ^-5 -10 ^-6) su piastre TSA con 8 mg / L da solo tetraciclina per contare il numero totale di destinatari. Incubare le piastre a 37 ° C per 18-24 ore.
   7. Analizzare colonie doppio resistente (transconjugants putativi) per la presenza del cfR gene da colonia PCR ⁷ e i loro profili di suscettibilità (antibiogramma).
   8. Determinare all'antibiogramma misurando le concentrazioni minime inibenti (MIC) di antibiotici appropriati secondo il metodo microdiluizione o diffusione disco metodo standard ^11. Il profilo di sensibilità dei transconjugants deve essere identico al destinatario, tranne cloramfenicolo (e altri composti colpite dal gene cfr). Questa determinazione è essenziale per escludere resistenza alla tetraciclina sviluppato dal ceppo donatore.

2. fagi trasduzione

NOTA: Il MR83a batteriofago appartenente alla famiglia siphoviridae (laboratorio stock) è stato utilizzato negli esperimenti di trasduzione. N315-45 è stato utilizzato come donatore cfr dell'infezione fagica. N315, COL, o Mu50 ceppi sono stati utilizzati come destinatari. L'acquisizione di cfr era determinata dalla abilità del ceppo ricevente di crescere in presenza di 32 mg / L cloramfenicolo. Colonie crescono in questa condizione sono stati analizzati per determinare la presenza di cfr (dalla colonia PCR) e per determinare il profilo di sensibilità per escludere potenziale contaminazione.

1. Amplificazione Phage sul donatore
   1. Preparare una cultura durante la notte di N315-45 in 5 ml di brodo nutritivo integrato con 3,6 mM Ca ²⁺ (NBCaCl ₂₎ a 37 ° C con agitazione (180 rpm).
      NOTA: Il calcio è necessario per l'infezione dei fagi. Vedere la tabella materiali. brodo nutriente da altre società potrebbe avere problemi, come ad esempio la precipitazione del calcio.
   2. Preparare subcolture diluendo la coltura overnight 1: 1.000 in un volume finale di 10 ml di NBCaCl ₂ in boccette di vetro 50 ml o flaconi di vetro. Crescere i batteri per 1 ora a 37 ° C con agitazione (180 rpm).
   3. Preparare una serie di MR83a fago diluito in NBCaCl ₂ medium (10 ^{-2, -3} 10, 10 ^{-4, -5} 10 e 10 ^-6). Aggiungere 20 ml di fago diluito nella coltura batterica. Anche preparare una coltura di controllo senza infezione fagica, che serve come controllo positivo per la crescita cellulare batterica e può essere utilizzato per determinare il titolo fago il giorno successivo.
   4. Far crescere le colture a 37 ° C con dolce agitazione (100 rpm) durante la notte.
      NOTA: Le cellule saranno crescono in certa misura quando il fago infettante non è in eccesso; quindi, essi entreranno in fase di lisi dovuta all'amplificazione fago attraverso il ciclo litico. La cultura senza fago mostrerà piena crescita, mentre le culture con fago mostreranno tassi distinti di trasparenza.
   5. Selezionare una o due flaconi di coltura liquidati con la più alta diluizione del fago aggiunto.
   6. Trasferire le culture in 15 ml provette da centrifuga. Aggiungere 250 ml di cloroformio e mescolare accuratamente invertendo i tubi.
   7. Centrifugare le provette a 5.000 xg per 20 min a 4 ° C.
   8. Trasferire i supernatanti in provette freschi e conservarli a 4 ° C fino all'utilizzo.
      NOTA: Il fago è stabile per almeno alcuni mesi, ma memorizzare la preparazione fago per troppo tempo riduce l'efficienza titolo e trasduzione.
2. Misurare il titolo del fago (saggio di placca fago)
   1. Preparare il brodo nutriente agar (agar 1,5%) media; tenere in caldo in un bagno di acqua a 55 ° C. Aggiungere autoclavato 0,5 M CaCl ₂ soluzione al mezzo ad una concentrazione finale di 3,6 mM. Versare il tutto in 90 mm piastre di Petri (NBCaCl ₂ piastre).
   2. Preparare una cultura durante la notte di N315 in 5 ml di NBCaCl ₂ a 37 ° C con agitazione; questo può essere sostituito con la coltura di controllo sopra descritto (punto 2.1.3).
   3. Aggiungere 10 ml di cultura durante la notte in 200 ml di NBCaCl ₂ e distribuito uniformemente sulla piastra NBCaCl _2. Arrestare la diffusione quando la superficie dila piastra è ricoperta con liquido. Lasciare la piastra a secco.
   4. Fare un diluizione 1:10 di serie (da 10 ^-5 -10 ^-10) del fago precedentemente preparato (fase 2.1.8) utilizzando NBCaCl ₂ di media.
   5. Spot 3 ml di ciascuna diluizione fago sulla piastra coperta con batteri.
   6. Incubare la piastra per una notte a 30 ° C.
   7. Contare i numeri placca e calcolare il titolo fago utilizzando la seguente equazione: Plaque unità di formatura (pfu) / ml = Numero di placche x fattore di diluizione / Volume trovato (3 x 10 ^-3 ml)
3. fagi trasduzione
   NOTA: La piscina fago preparato nel passaggio precedente (2.1.8) è utilizzato per testare la trasduzione del gene cfr nei ceppi di S. aureus. In questo esperimento, ceppi N315, COL, o Mu50 sono usati come destinatari.
   1. Preparare la cultura durante la notte di N315, COL o Mu50 in 5 ml di NBCaCl ₂ a 37 ° C con agitazione (180 rpm).
   2. Diluire tegli fago in NBCaCl ₂ a ~ 10 ⁹ pfu / ml.
   3. In un flaconcino di vetro da 50 ml, mescolare 500 ml di cultura durante la notte, 500 ml di fresco NBCaCl _2, e 1 ml di fago (~ 10 ⁹ pfu / ml); la molteplicità atteso di infezione (MOI) non deve superare 1. Incubare la miscela a 37 ° C agitando delicatamente (100 rpm) per 30 minuti.
      NOTA: Trattamento termico di cellule riceventi appena prima dell'aggiunta del fago (52 ° C per 2 minuti per inattivare gli enzimi di restrizione endogeno) può aumentare l'efficienza ^12.
   4. Aggiungere 50 ml di 20% di Na ₃ -Citrate. Continuare delicata agitazione per 30 minuti a 37 ° C.
      NOTA: Na ₃ -Citrate agisce come un chelante moderata di calcio.
   5. Preparare agar (agar 1,5%) media fuso infusione cuore-cervello (BHI) e conservarlo in un bagno d'acqua a 55 ° C.
   6. Trasferire il composto batterio-fago in un pallone da 100 ml, aggiungere 50 ml di caldo agar BHI integrato con 32 mg / L chloramphenicol, e mescolare bene. Versare il composto in piatti di 90 mm di Petri.
      NOTA: Questo metodo consente il rilevamento di un piccolo numero di crescita colonie (transductants putativi).
   7. Incubare la piastra a 37 ° C per 24-48 ore.
   8. Ulteriori testare le colonie generati (transductants) per la resistenza trasferendo le colonie su nuove piastre di agar BHI integrato con 32 mg / L cloramfenicolo. Confermare la presenza del gene cfr dalla colonia PCR ^7.

3. trasformazione naturale

NOTA: Il saggio naturale trasformazione in S. aureus è stata effettuata secondo il metodo descritto nel precedente studio ^2. Il derivato N315, N2-2.1 ^{2, 7,} è stato utilizzato come destinatario. In questo ceppo, il locus sospiro è stato duplicato in modo da costitutivamente sospiro Express ^2. per detprocedure affliggeva su come isolare varianti di competenza sospiro che esprimono, si prega di vedere la descrizione precedente ^2. Se il marcatore di resistenza da trasferire non è cloramfenicolo, PRIT-Sigh (Cm ^R) può essere utilizzato per esprimere sospiro, come descritto in precedenza ^2. Plasmide purificata o intero estratto il DNA da CFR -acquired S. aureus COL-45 ⁷ viene utilizzato come il DNA del donatore per la trasformazione.

1. Preparazione di DNA donatore
   1. Coltivazione COL-45 durante la notte con agitazione a 37 ° C in una beuta da 300 ml contenente 50 ml di TSB completato con 32 mg / L cloramfenicolo. Cultura E. coli HST04 pHY300 portando plasmide ^{(Tet R)} per estrarre il plasmide per l'esperimento di controllo.
      NOTA: HST04 (dam ^- / DCM ^-) manca il DNA metilasi geni ^13. Altri ceppi convenzionali con metilasi DNA possono anche essere usod per preparare il donatore del DNA, perché lo stato di metilazione del DNA non influenza l'efficienza di trasformazione. In alternativa, pT181 plasmide purificato dal ceppo S. aureus COL può anche essere usato come controllo positivo per il test di trasformazione ^2.
   2. Raccogliere le cellule per centrifugazione (8000 xg per 10 min a 4 ° C).
   3. Estrarre i plasmidi usando un kit di estrazione di DNA plasmidico o un metodo di purificazione del DNA convenzionale per purificare l'intero DNA.
   4. Quantificare il DNA purificato tramite spettrometro sé a 4 ° C fino all'utilizzo.
      NOTA: Utilizzare una preparazione del DNA fresco per il test di trasformazione, di solito meno di una settimana di età. preparazioni Old DNA riducono l'efficienza della trasformazione.
2. test trasformazione
   1. Cultura cellula ricevente (N2-2.1) durante la notte in 5 ml di TSB a 37 ° C con agitazione.
   2. Trasferire 0,5 ml di coltura durante la notte in una provetta da 1,5 ml. di precipitazionetate le cellule per centrifugazione (10.000 xg per 1 min a 4 ° C).
   3. Sospendere le cellule con 10 ml di mezzo CS2 in un tubo da 50 ml.
      NOTA: media CS2 è un mezzo sintetico completo che induce la competenza per la trasformazione naturale in S. aureus ² (vedere la composizione media nella tabella materiale). Altri media di laboratorio standard, come TSB o BHI, non sono adatti per la trasformazione ^{2, 13.}
   4. Crescere i batteri a 37 ° C con agitazione (180 rpm) fino alla fine fase esponenziale (circa 8 ore).
   5. Raccogliere le cellule per centrifugazione (5000 xg per 5 minuti a 4 ° C).
   6. Risospendere le cellule in 10 ml di terreno fresco CS2.
   7. Aggiungere 10 mg di plasmide purificato o DNA genoma (fase 3.1.4) alla sospensione cellulare. Agitare a 37 ° C e 180 rpm per 2,5 ore.
      NOTA: i tempi di incubazione più brevi con il DNA (<2,5 hr) provocare trasf bassafrequenze ormazione.
   8. Raccogliere le cellule per centrifugazione (5000 xg per 5 minuti a 4 ° C).
   9. Risospendere le cellule in 10 ml di terreno BHI. Mescolare la sospensione cellulare con 90 ml di agar fuso BHI (55 ° C) supplemento con 32 mg / L cloramfenicolo (o 5 mg / L di tetraciclina nel esperimento di controllo). Versare il composto in piatti di 90 mm di Petri. Rapidamente fresco e lasciare che l'agar solidificare.
   10. Incubare le piastre a 37 ° C per 2 giorni.
   11. Replicare colonie generati (trasformanti) trasferendo le colonie (utilizzando stuzzicadenti) alle nuove piastre di agar BHI contenenti antibiotici appropriati per confermare le loro caratteristiche di resistenza. Confermare il gene di resistenza acquisita (cfr o tetM) dalla colonia PCR ^7.

Risultati

I risultati qui rappresentati sono stati precedentemente pubblicati (adattato da riferimento ⁷ con il permesso dell'editore). Abbiamo studiato le possibili vie di trasmissione del gene cfr, che provoca la resistenza linezolid basso livello e l'espressione del PhLOPSA resistenza fenotipo ^{14, 15} in ceppi di S. aureus, analizzando tre meccanismi di HGT.

Discussione

Questo lavoro descrive i tre metodi principali per studiare la HGT di determinanti genetici di S. aureus. Anche se trasduzione e coniugazione sono stati studiati per decenni, l'esistenza di trasformazione naturale è stata solo di recente riconosciuta ^2. Così, S. aureus è dotato di tutti i tre principali modalità di HGT, e testare tutti loro è necessario per chiarire le possibili vie di diffusione dei determinanti genetici. Lo scopo di questo lavoro è quello di co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)	Becton Dickinson	211825
Brain Heart Infusion (BHI)	Becton Dickinson	211059
Nutrient Broth No. 2	Oxoid	CM0067
Sheep blood agar	Eiken Chemical Co.,Ltd.	E-MR96	Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.
Agar powder	Wako Pure Chemical Industries	010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)	Wako Pure Chemical Industries	191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter	Merck Milipore	HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit	QIAGEN	12243