方法基因水平转移的研究<em&gt;金黄色葡萄球菌</em

摘要

我们在这里描述了用于在金黄色葡萄球菌接合，转导，和自然转化的体外研究三种不同的协议。

摘要

主要的机会人类病原体葡萄球菌的一个重要特点是其非凡的快速获得耐药性的能力。基因组学研究表明， 金黄色葡萄球菌携带位于移动遗传元件许多毒力和抗性基因，这表明水平基因转移（HGT）起着金黄色葡萄球菌发展的关键作用。然而，用于研究HGT在金黄色葡萄球菌仍然缺乏，特别是关于天然转化，这已在该细菌最近报道的方法的一个完整和详尽的描述。这部作品描述了三个协议，它们对金黄色葡萄球菌的HGT 体外调查有用:结合，噬菌体转导和自然转化。为了这个目标，CFR基因（氯霉素/氟苯尼考电阻），赋予了Phenicols，林可酰胺类，恶唑烷酮，截短侧耳素和链阳性菌素A（PhLOPSA）-resistance表型，使用。理解，通过该金黄色葡萄球菌的遗传物质转移给其它菌株的机制是理解的快速采集电阻的必要，有助于澄清报告监视计划或以进一步预测在未来的扩展模式传播的模式。

引言

金黄色葡萄球菌是一种共生革兰氏阳性菌天然栖息人类和动物的皮肤和鼻腔。此细菌种类是在医院和医疗机构的医院感染的主要原因。此外，它的发展到不同抗微生物化合物抗性的能力已取得由这种细菌引起成全球关注的感染的管理。

参与性表型的扩散两个主要途径是已知的:抗性基因型的克隆传播和遗传因素的细菌池之间的传播。在金黄色葡萄球菌 ，不同的抗生素抗性基因（以及毒力决定）的情况下，已发现与移动遗传元件（MGEs）相关联的^1。在金黄色葡萄球菌的基因组中这些元素的存在表明根的采集和传输细菌群体内客位材料可以发挥对金黄色葡萄球菌的适应和发展的重要作用。

转化，接合和转导噬菌体:遗传物质可通过HGT三个众所周知的机制在革兰氏阳性菌进行交换。变换涉及游离DNA的摄取。为了获得外源DNA，细菌细胞需要制定一个特殊的生理阶段:竞争力的阶段。当达到这个阶段，感受态细胞是能够传输的DNA进入细胞质，获得新的遗传决定的。在金黄色葡萄球菌的情况下，自然转化的存在最近已经证明^2。本着这一精神，我们小组已经阐明的叹息因子的表达在发展的能力阶段，其组成型表达如何呈现能够reachin的金黄色葡萄球菌的相关性（一个神秘的二次转录σ因子）克竞争力的阶段，这允许通过自然转化²收购耐药表型的。

缀合是涉及从一个活细胞（供体）到另一种（受体）DNA的传输的处理。两个小区必须是直接接触，从而允许同时通过特殊的结构，如管或孔被保护要交换的DNA中。的DNA通过该方法转移需要接合机械。在金黄色葡萄球菌 ，原型接合质粒是PGO1，它怀有接合操纵TRAA ^3。

噬菌体转导涉及DNA的细胞通过噬菌体感染转移到细胞并意味着细菌DNA的包装，而不是病毒DNA，进噬菌体衣壳。大多数金黄色葡萄球菌分离株被噬菌体¹溶源化。在应力条件下，原噬菌体可以从细菌染色体组中切除e和移到裂解周期。

这些是在金黄色葡萄球菌的DNA传输三种公知的机制。还有一些附加的传输机制，例如"伪转变^"2和致病岛⁴的转移噬菌体样系统。最近，一组报道，"纳米管"是参与细胞材料（包括质粒DNA）的相邻小区^5,6之间的转移，但后续的研究还没有从其他组出现为止。

这项工作提供了必要的方法，通过解决三个主要途径转移研究HGT在金黄色葡萄球菌 :接合，转导和自然转化。用这些方法所获得的结果被用来研究之间的CFR的基因的发送（氯霉素/氟苯尼考电阻）金黄色葡萄球菌菌株^7。这三种技术是MGE传输的金黄色葡萄球菌的调查多用途工具。

研究方案

注:在这项工作中使用的菌株和材料示于表1分别列出与材料的表 。在传输实验，N315和COL CFR的阳性衍生物被用作CFR的基因的供体（N315-45和COL-45）。这些菌株先前由缀合得到的，用作为供体的临床CFR的阳性金黄色表皮应变（ST2），按照标准缀合协议（见下面）。这株窝藏在pSCFS7般的质粒⁷ CFR基因。

1.共轭使用滤波器交配方法

注意:一个金黄色葡萄球菌 N315菌株携带CFR的基因^{（N315-45）7（}厘米^R）被用作供体。 COL ⁸或Mu50 ⁹株（四环素^R，厘米^S）被用作收件人。双-抗性菌落（四环素^R，厘米^R）能够以32毫克/氯霉素加8毫克L存在下生长/ L四环素被视为推定转导和分析通过菌落PCR来确定CFR的存在，并确定收件人易感性。

1. 以下先前描述的方案¹⁰提供了一些修改执行偶联:
   1. 制备5毫升的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）培养基（有和没有32毫克/升氯霉素，分别）供体和受体的过夜培养物，在37℃振荡。
   2. 通过使用新鲜TSB培养基调整过夜培养物以1（OD ₆₀₀ = 1.0）的光密度（OD _600）。混合0.5mL的供体培养物（N315-45）的用0.5mL收件人培养的（COL或Mu50）。 1ml的PBS添加到混合物中。
   3. 细菌的混合物转移到0.45μm的滤膜USI纳克真空泵系统。
   4. 把滤膜上的绵羊血琼脂平板上。孵育在37℃下1天。
      注:在这一步骤，富集介质是必要的，以允许抗双细胞的生长。
   5. 从板中取出滤膜并在10ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）的暂停。涡流以及收集附着在膜上的所有细菌。
   6. 通过使用新鲜的TSB使细菌悬浮液的连续10倍稀释。板100微升上的TSB琼脂0-10 ^-4稀释的样品（TSA）平板上补充有32毫克/升氯霉素和8毫克/升四环素为转导的选择。板100微升稀释悬浮液（10 ^-5 -10 ^-6）到TSA平板单独用8毫克/升四环素的计数收件人的总数。孵育所述板在37℃下18-24小时。
   7. 对于比照的存在分析抗性双菌落（推定的转导结合体）菌落PCR ⁷和敏感性图（抗菌谱）R基因。
   8. 通过根据标准微量稀释法或纸片法¹¹测定的适当的抗生素的最低抑菌浓度（MIC）测定抗菌素谱。在转导的易感性必须与接受者，除了氯霉素（和受CFR基因其他化合物）。这个决定是必要的，以排除由供体菌株开发的四环素抗性。

2.噬菌体转

注:属于长尾噬菌体科家族（实验室股票）噬菌体MR83a在转导实验中使用。 N315-45用作噬菌体感染的CFR的供体。 N315，COL，或Mu50菌株用作收件人。 CFR的收购是由AB确定受体菌株的ility在32毫克/升氯霉素的存在下生长。菌落在此条件下生长进行了分析，以确定CFR的存在（通过菌落PCR），并确定易感性排除潜在的污染。

1. 捐助噬菌体放大
   1. 在5毫升营养肉汤中于37℃补充有3.6毫米的Ca ^2+（NBCaCl _2）振荡（180转）制备N315-45的过夜培养。
      注:钙需要噬菌体感染。请参阅材料表 。从其他公司的营养肉汤可能具有问题，如钙沉淀。
   2. 在10mL NBCaCl ₂的在50毫升玻璃烧瓶或玻璃小瓶，最终体积1000:通过稀释过夜培养1准备传代培养。振荡（180转）生长1小时的细菌在37℃。
   3. 准备一系列的稀释噬菌体MR83a在NBCaCl ₂ MEDI微米（10 ^{-2，10 -3，10 -4，10 -5}和10 ^-6）。加入20μl的稀释噬菌体到细菌培养。还制备无噬菌体感染的控制培养，其用作细菌细胞生长的阳性对照，可以被用来确定第二天噬菌体滴度。
   4. 生长的培养物在过夜37℃温和振荡（100rpm）下。
      注:细胞会生长到一定程度时，感染的噬菌体是不超过;然后，他们将进入裂解阶段由于通过裂解周期噬菌体扩增。无噬菌体的文化将完全显示的增长，而噬菌体的文化会呈现不同的透明度率。
   5. 选择与添加的噬菌体的最高稀释一种或两种清零培养瓶中。
   6. 转移培养到15ml离心管中。加入250微升的氯仿和反相管调匀。
   7. 离心管在5000 xg离心在4℃下20分钟。
   8. 转移上清液至新管，并将它们在4℃下储存直到使用。
      注:噬菌体是稳定至少几个月，但存储噬菌体制备太久降低了效价和转导效率。
2. 测量噬菌体滴度（噬菌体斑块检测）
   1. 制备营养肉汤琼脂（1.5％琼脂）培养基;保持水浴在55℃的温水。蒸压的0.5M的CaCl ₂溶液在培养基中加入了3.6毫摩尔的最终浓度。倒入90毫米培养皿（NBCaCl _板 ）。
   2. 准备N315的过夜培养在37℃5毫升NBCaCl ₂的振荡;这可以用上述对照培养（步骤2.1.3）取代。
   3. 添加10微升过夜培养物于200微升NBCaCl ₂和均匀分布其上NBCaCl ₂板。停止扩频时的表面板覆盖有液体。让板干燥。
   4. 使用NBCaCl ₂介质中预先准备的噬菌体（步骤2.1.8）的使串行1:10稀释（10 ^-5 -10 ^-10）。
   5. 现货3微升每个稀释度噬菌体覆盖上细菌的板块。
   6. 过夜孵育所述板在30℃。
   7. 计数噬斑数量，并使用下列公式计算噬菌体滴度:空斑形成单位（PFU）/ ml的=斑块数×稀释因子/斑体积（3×10 ^-3毫升）
3. 噬菌体转
   注:在上一步（2.1.8）中制备的噬菌体池用于测试CFR基因转导到金黄色葡萄球菌菌株。在该实验中，菌株N315，COL，或Mu50用作收件人。
   1. 振荡（180转）制备N315，COL，或Mu50的5ml NBCaCl ₂的过夜培养物在37℃。
   2. 稀释ŧ他NBCaCl ₂噬菌体〜10 ⁹ PFU /毫升。
   3. 在50ml玻璃小瓶中，混合500微升过夜培养物，将500μl新鲜NBCaCl _2，和1ml噬菌体（〜10 ⁹ PFU / ml）的;感染的预期复数（MOI）不能在37℃超过1孵育的混合物轻轻摇动（100rpm）下进行30分钟。
      注:热处理受体细胞之前，为了在加入噬菌体（52℃，2分钟以灭活内源性限制性内切酶）可以提高效率^12。
   4. 加入50微升20％的Na ₃ -Citrate的。继续轻柔在37℃振荡30分钟。
      注:na ₃ -Citrate作为钙的中等螯合剂。
   5. 制备熔融脑心脏浸液（BHI）琼脂（1.5％琼脂）培养基，并保持它在水浴在55℃。
   6. 细菌噬菌体混合物转移到100毫升烧瓶中，加入50毫升温的BHI琼脂补充有32毫克/升chloramphenicol，拌匀。将混合物倒入90 25mm培养皿。
      注意:此方法使少数生长的菌落（假定的转导）的检测。
   7. 孵育在37℃的板24-48小时。
   8. 由殖民地转移到补充32毫克/升氯霉素新的BHI琼脂平板上进一步测试阻力所产生的殖民地（转导）。确认CFR基因的菌落PCR ⁷的存在。

3.自然变换

注:在金黄色葡萄球菌的天然转化测定以下在我们以前的研究^2中记载的方法进行。的N315衍生物，N2-2.1 ^2,7，被用来作为收件人。在这株， 感叹轨迹被复制，从而组成性表达的叹息^2。对于DET关于如何隔离感叹表达能力的变种ailed程序，请参见以前的说明^2。如果要传输的抗性标记不氯霉素，PRIT叹息（厘米^R）可以用来表达感叹，如前面所述的^2。纯化的质粒或从CFR的整个DNA的提取-acquired 金葡菌 COL-45 ⁷被用作供体DNA进行转化。

1. 供体DNA的制备
   1. 培育COL-45过夜在含有50毫升TSB的一个300ml的烧瓶中，在37℃振荡补充有32毫克/升氯霉素。文化的大肠杆菌 HST04携带pHY300 质粒^{（四环素 R）的}提取为对照实验的质粒。
      注:HST04（ 坝^- / DCM ^{- ）}缺乏DNA甲基化酶基因^13。用DNA甲基化酶其它常规菌株也可以是使用d，来制备DNA供体，因为DNA甲基化状态不影响转化效率。或者，从金黄色葡萄球菌 COL菌株纯化pT181的质粒也可以用作用于转化测定法²的阳性对照。
   2. 通过离心（在4℃下8000×g离心 10分钟）收集细胞。
   3. 提取使用质粒DNA提取试剂盒或常规DNA纯化方法以纯化整个DNA的质粒。
   4. 通过光谱仪定量纯化的DNA，并保持它在4℃下直到使用。
      注:使用的转化实验，通常不到一周龄一个新的DNA提取。古DNA制剂降低转化效率。
2. 转化试验
   1. 文化受体细胞（N2-2.1）隔夜在5毫升TSB在37℃振荡。
   2. 转移0.5过夜培养毫升到1.5毫升管中。 Precipi通过离心（在4℃万xg离心 1分钟）优化射孔细胞。
   3. 悬浮细胞用10mL CS2介质的在50毫升管中。
      注:CS2介质是诱导能力为金黄色葡萄球菌 ²天然转化（见材料表培养基组成）一个完整的合成培养基。其它标准实验室培养基，如TSB或BHI，不适合用于转化^2,13。
   4. 生长于37℃的细菌以摇动（180转）直到晚指数期（约8小时）。
   5. 通过离心（在4℃下5000×g离心 5分钟）收获细胞。
   6. 悬浮细胞在10毫升新鲜CS2介质。
   7. 添加纯化的质粒或基因组DNA（步骤3.1.4）的10微克到细胞悬浮液。摇动在37℃和180rpm下2.5小时。
      注:潜伏期较短时间与DNA（<2.5小时），导致较低的TRANSFormation频率。
   8. 通过离心（5,000×g离心 5分钟，4℃）收集细胞。
   9. 悬浮细胞在10毫升BHI培养基的。混合细胞悬浮液用90毫升熔融BHI琼脂（55℃）的补充有32毫克/升氯霉素（在对照实验或5毫克/升四环素）。将混合物倒入90 25mm培养皿。迅速冷静，让琼脂凝固。
   10. 孵育在37℃下将板2天。
   11. 通过转移殖民地（使用牙签），以包含适当的抗生素，以确认其阻力特性的新BHI琼脂平板上复制产生的殖民地（转化）。确认所获取的抗性基因（CFR或tetM）通过菌落PCR ^7。

结果

这里所代表的结果已经公布以前（改编自基准⁷与出版商的许可）。我们研究的CFR的基因，这会导致低级别利奈唑胺抗性和PhLOPSA-抗性表型^14，15的中金黄色葡萄球菌菌株的表达，潜在传输通路通过调查HGT的三种机制。

图1示出了在接合试验?...

讨论

这个工作描述来研究的金黄色葡萄球菌的遗传决定的HGT三大方法。虽然转导，接合已经研究了数十年，自然转化的存在是最近才认可^2。因此， 金黄色葡萄球菌配备所有HGT的三个主要模式的，和测试他们都需要澄清遗传决定的可能的传播途径。这项工作的目的是编制完成协议，并提供在以前发表的著作⁷采用的方法的实用信息。虽然共轭和转导?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)	Becton Dickinson	211825
Brain Heart Infusion (BHI)	Becton Dickinson	211059
Nutrient Broth No. 2	Oxoid	CM0067
Sheep blood agar	Eiken Chemical Co.,Ltd.	E-MR96	Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.
Agar powder	Wako Pure Chemical Industries	010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)	Wako Pure Chemical Industries	191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter	Merck Milipore	HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit	QIAGEN	12243