수평 유전자 전달의 연구에 대한 방법론<em&gt; 황색 포도상 구균</em

요약

우리는 여기에서 황색 포도상 구균의 활용, 전달, 자연 변화의 체외 조사에 대한 세 가지 다른 프로토콜을 설명합니다.

초록

주요 기회 인간 병원체 황색 포도상 구균의 한 가지 중요한 특징은 빠른 속도로 항생제에 대한 내성을 획득하는 그것의 특별한 능력이다. 게놈 연구는 황색 포도상 구균이 수평 유전자 이동은 (HGT)은 황색 포도상 구균의 진화에 중요한 역할을한다는 것을 시사 모바일 유전 적 요소에있는 많은 독성 및 내성 유전자를 운반 것을 알 수있다. 그러나 여전히 부족한 특히 최근에이 박테리아에보고 된 자연의 변화를, 관련되는 황색 포도상 구균에 HGT을 연구하는 데 사용되는 방법론의 완전하고 상세한 설명. 접합, 파지 전달, 천연 변환 :이 작품은 체외 황색 포도상 구균의 HGT의 조사에 유용한 세 가지 프로토콜을 설명합니다. Phenicols을 부여,이 목표는 CFR 유전자 (클로람페니콜 / florfenicol 저항), Lincosamides, 옥사 졸리 디논, Pleuromutilins 및 Streptogramin A (PhLOPS에A) 표현형 - 저항을 사용 하였다. 황색 포도상 구균은 다른 균주에 유전 물질을 전달되는 메커니즘을 이해하는 것은 저항의 빠른 획득을 이해하는 필수적이며, 보급의 모드 감시 프로그램에보고 또는 더 미래에 확산 모드를 예측하기를 명확히하는 데 도움이됩니다.

서문

황색 포도상 구균은 자연스럽게 인간과 동물의 피부와 비강을 붙어 사는 공생 그람 양성 세균이다. 이 박테리아 종은 병원 및 의료 설정에서 원내 감염의 주요 원인이다. 또 다른 항균 화합물에 대한 내성을 발전 할 수있는 능력은 세계적으로 관심이 세균에 의한 감염의 관리했다.

저항 표현형의 확산에 관여하는 두 가지 주요 경로는 알려져 있습니다 저항성 유전자형의 클론 보급 및 세균 풀 중 유전 적 결정의 보급을. S. 아우 레 우스, 다른 항생제 내성 유전자 (및 병독성 결정자)의 경우 모바일 유전 요소 (MGEs)과 연관된 것으로 밝혀졌다 ^1. S. 아우 레 우스의 게놈에서 이들 요소의 존재는 세대의 수집 및 전송 것을 나타낸다세균 집단 내에서 etic 물질은 황색 포도상 구균 적응과 진화에 중요한 역할을 할 수있다.

변환, 접합 및 파지 형질 : 유전 물질은 그람 양성균에 HGT 세 공지 된 메커니즘을 통해 교환 될 수있다. 변환 무료 DNA의 흡수를 포함한다. 역량 단계 : 외국의 DNA를 획득하려면, 박테리아 세포는 특별한 생리 학적 위상을 개발해야합니다. 이 단계에 도달하면 적격 세포의 세포질 내로 DNA를 운반하는 새로운 유전 결정을 취득 할 수있다. 황색 포도상 구균의 경우, 자연 변화의 존재는 ^{최근이 입증되었다.} 이과 일치, 우리의 그룹은 구성 적 발현이 reachin 할 수있는 황색 포도상 구균을 렌더링하는 방법을 개발 역량 무대와의 한숨 인자의 발현의 관련성 (애매한 차 전사 시그마 인자)에 빛을 발산했습니다자연의 변화 ^(2)에 의한 내성 표현형의 취득을 허용 g 역량 단계.

활용은 다른 (받는 사람) 하나의 살아있는 세포 (기증자)에서 DNA의 전송을 포함하는 과정이다. 두 셀은 튜브 또는 구멍과 같은 특수한 구조에 의해 보호되는 상태에서 DNA를 교환 할 수 있도록 직접 접촉한다. 이 방법에 의해 DNA의 전송은 공역 기계가 필요합니다. S. 아우 레 우스에있어서, 원형 플라스미드 공역 공역 오페론 TraA ³ PGO1 품고있다.

파지 형질 도입은 감염 박테리오파지 통해 셀 사이의 DNA 전달을 포함 파지 캡시드 내로 바이러스 DNA 대신에, 박테리아 DNA의 패킹을 의미한다. S. 구균 균주의 대부분은 박테리오파지 ¹ 용 원화되어있다. 스트레스 조건시 prophages은 세균 genom로부터 절단 될 수있다전자 및 용 균성 생활사로 이동.

이는 S. 구균의 DNA 전달을위한 세 개의 공지 된기구이다. 예 : "의사 ^변환"2 병원성 섬 ^(4)의 전송에 파지와 같은 시스템과 같은 몇 가지 추가 전송 메커니즘이있다. 최근, 한 그룹은 "나노 튜브"는 인접한 셀 ^{(5), (6)} 사이 (플라스미드 DNA를 포함) 다공질 재료의 전사에 관여하지만, 후속 연구가 지금까지 다른 그룹 등장하지 않았 음을보고 하였다.

활용, 전달, 천연 변환 :이 작품은 세 가지 주요 이동 경로를 해결하여 황색 포도상 구균에 HGT을 연구하는 데 필요한 방법을 제공합니다. 이러한 방법으로 얻어진 결과 중에서 CFR 유전자 전달 (클로람페니콜 / florfenicol 저항)을 연구하기 위해 사용되었다황색 포도상 구균은 ⁷ 균주. 이 세 가지 기술은 황색 포도상 구균에 MGE 전송의 조사를 위해 다양한 도구입니다.

프로토콜

참고 :이 작업에 사용 된 균주 및 재료는 각각 표 1에 나열된 및 재료의 표합니다. 투과 실험에서 N315 및 양성 유도체 CFR COL은 CFR 유전자의 도너 (N315-45 및 COL-45)로 하였다. 이 균주는 이전에 표준 활용 프로토콜 (아래 참조)에 따라 기증자 임상 CFR 양성 Staphyloccocus 표피의 변형 (ST2)로 사용, 접합에 의해 얻어졌다. 이 균주는 pSCFS7 같은 플라스미드 ⁷ 일 CFR 유전자를 숨겨.

1. 활용 필터 - 결합 방법을 사용하여

주 : CFR 유전자 (N315-45) ^{7 (R 형상)을} 운반하는 S. aureus에 N315 균주 도너로서 사용 하였다. COL ⁸ Mu50 ⁹ 균주 (구정 ^R, CM ^S)를받는 사람으로 사용되었다. 더블-내성 콜로니 32 밀리그램 / 클로람페니콜 더하기 8 mg을 L의 존재하에 성장할 수 (테트 ^R, CM ^R은) / 테트라 사이클린 L은 추정 transconjugants로 간주하고, 콜로니 PCR에 의해 CFR의 존재를 결정하고를 결정하기 위해 분석 하였다 받는 사람의 감수성 프로필.

1. 약간의 수정과 함께 이전에 설명한 프로토콜 ¹⁰ 다음 접합을 수행합니다 :
   1. 37 ℃에서 진탕 (와 각각 32 밀리그램 / L의 클로람페니콜없이) 트립신 간장 국물 (TSB) 매체에 기증자와받는 사람의 하룻밤 문화 5 mL를 준비합니다.
   2. 신선한 TSB 배지를 사용하여 1 (OD = 1.0 _(600))에 하룻밤 동안 배양 물의 광학 밀도 (OD _600)를 조정한다. 받는 사람 문화의 0.5 ㎖ (COL 또는 Mu50)와 기증자 문화 (N315-45)의 0.5 mL의 혼합. 혼합물에 1 ml의 PBS를 추가합니다.
   3. 0.45 μm의 필터 멤브레인 USI에 박테리아의 혼합물 전송진공 펌프 시스템 겨.
   4. 양 혈액 아가 플레이트 상에 여과막을 넣어. 1 일 동안 37 ° C에서 품어.
      주 :이 단계에서, 농축 된 배지 더블 내성 세포의 성장을 허용 할 필요가있다.
   5. 플레이트로부터 여과막을 꺼내 인산 완충 식염수 (PBS) 10ml에 일시. 소용돌이 잘 막에 연결된 모든 박테리아를 수집합니다.
   6. 신선한 TSB를 사용하여 세균 현탁액 직렬 10 배 희석을 만든다. TSB 한천의 0 ~ 10 ^-4 희석 된 샘플 플레이트 100 μL은 (TSA) 판은 32 밀리그램 / L의 클로람페니콜 8 밀리그램 / transconjugants의 선택을위한 L의 테트라 사이클린 보충. 희석 현탁액 ^(10-5 -10 ^-6) TSA 플레이트 상에 단독으로 8 ㎎ / ℓ의 테트라 사이클린과 접시 100 ㎕를받는 사람의 총 수를 계산합니다. 18 ~ 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
   7. CF의 존재를 두 번 저항하는 식민지 (추정 transconjugants를) 분석식민지 PCR ^(7)과 감수성 프로필 (antibiogram)에 의해 R 유전자.
   8. 표준 희석법 또는 디스크 확산 방법 ^(11)에 따른 적절한 항생제의 최소 억제 농도 (MIC가)를 측정하여 antibiogram을 결정합니다. transconjugants의 감수성 프로필은 클로람페니콜 (그리고 CFR 유전자에 의해 영향을받는 다른 화합물)을 제외하고,받는 사람에게 동일해야합니다. 이 판정은 공여자 균주가 개발 테트라 사이클린 저항성을 배제하는 것이 필수적이다.

2. 파지 형질 도입

참고 : Siphoviridae 가족 (실험실 주)에 속하는 박테리오파지 MR83a는 전달 실험에 사용 하였다. N315-45 파지 감염에 대한 CFR 공여체로서 사용 하였다. N315, COL, 또는 Mu50 균주는받는 사람으로 사용되었다. CFR의 인수는 AB에 의해 결정되었다수신자 균주 ility 32 밀리그램 / L의 클로람페니콜의 존재 하에서 성장할. 이 조건에서 성장 콜로니 (콜로니 PCR에 의해) CFR의 존재를 결정하고, 오염 가능성을 배제하기 위해 민감성 프로파일을 결정하기 위해 분석 하였다.

1. 기증자에 파지 증폭
   1. (180 RPM)을 진탕 37 ° C에서 3.6 밀리미터 칼슘 2 ⁺ (NBCaCl ₂₎ 보충 영양 배지 5ml에 N315-45의 야간 문화를 준비합니다.
      참고 : 칼슘은 파지 감염이 필요합니다. 재료 표를 참조하십시오. 다른 회사의 영양소 국물은 칼슘 침전 등의 문제를 가지고 있습니다.
   2. 50ml의 유리 플라스크 또는 유리 바이알에 NBCaCl _(2)의 10 ㎖의 최종 부피 1000 : 밤새 배양 한 희석 계대 배양을 준비한다. (180 RPM)를 진탕하면서 37 ℃에서 1 시간 동안 박테리아 성장.
   3. NBCaCl ₂ 메디칼에 희석 파지 MR83a 일련의 준비UM ^{(10-2, 10-3, 10-4, 10-5} 및 ^10-6). 박테리아 문화에 희석 된 파지의 20 μl를 추가합니다. 또한 박테리아 세포의 성장에 대한 양성 대조군으로서 제공하고, 다음날 파지 역가를 결정하는데 사용될 수있다 파지 감염없이 제어 배양을 준비한다.
   4. 밤새 부드러운 흔들림 (100 RPM)와 37 ° C에서 문화를 성장.
      주 : 감염성 파지 초과하지 않는 경우에는 세포가 어느 정도 증가 할 것이다; 다음, 그들은 의한 용균 사이클을 통해 파지 증폭에 용해 단계로 들어갑니다. 파지와 문화가 투명성 별개의 비율을 보여줍니다 동안 파지없는 문화는 전체 성장을 보여줍니다.
   5. 추가 된 파지의 가장 높은 희석와 하나 또는 두 개의 해제 문화 튜브를 선택합니다.
   6. 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 문화를 전송합니다. 클로로포름 250 μl를 추가하고 튜브 반전에 의해 철저하게 섞는다.
   7. 5000에서 튜브를 원심 4 ℃에서 20 분 XG.
   8. 신선한 튜브에 상층 액을 전송하고 사용할 때까지 4 ° C에 저장합니다.
      파지는 적어도 몇 달 동안 안정적이지만, 너무 오래 파지 준비를 저장하면 역가 및 전달 효율을 감소 : 주.
2. 파지의 역가를 측정 (파지 플라크 분석)
   1. 영양 국물 한천 (1.5 % 한천) 매체를 준비; 55 ° C에서 물 목욕은 따뜻한 유지. 3.6 mM의 최종 농도로 배지에 멸균 된 0.5 M _CaCl2를 용액을 첨가. 90mm 배양 접시 (NBCaCl ₂ 판)로 하거라.
   2. 진탕 37 ° C에서 NBCaCl ₂ 5ml에 N315의 야간 문화를 준비; 이것은 상술 한 제어 배양한다 (단계 2.1.3)로 치환 될 수있다.
   3. NBCaCl ₂ 200 μL에 하룻밤 문화의 10 μl를 추가하고 균일하게 NBCaCl ₂ 판에 그것을 확산. 때 표면의 확산을 중지판은 액체로 덮여있다. 판 건조를 할 수 있습니다.
   4. 직렬 1시 10분 희석합니다 (10 ^-5 -10 ^-10) _NBCaCl이 매체를 사용하여 이전에 제조 된 파지 (단계 2.1.8)의.
   5. 스팟 박테리아로 덮여 접시에 각각 파지 희석의 3 μL.
   6. 30 ℃에서 하룻밤 접시를 품어.
   7. 플라크 수를 카운트하고, 다음의 방정식을 사용하여 파지 역가를 계산 : 플라크 형성 단위 (PFU) / ㎖ = 플라크의 수 X 희석 계수 / 발견 볼륨 (3 × ^10-3 mL) 중
3. 파지 전달
   주 : 이전 단계 (2.1.8)에서 제조 한 파아지 풀은 S. 아우 레 우스 균주에 CFR 유전자의 전달을 시험하는 데 사용된다. 이 실험에서는, N315, COL 또는 Mu50가 수신자로서 사용되는 균주.
   1. (180 RPM)을 진탕 37 ° C에서 NBCaCl ₂ 5 ㎖의 N315, COL, 또는 Mu50의 야간 문화를 준비합니다.
   2. t 희석그는 10 ⁹ PFU / mL로 ~에 NBCaCl ₂ 파지.
   3. 50 mL 유리 바이알에서 밤새 배양 500 μL의 신선한 _NBCaCl이 500 μL 및 파지 1 ㎖ (~ ¹⁰⁹ PFU / ㎖)를 혼합한다; 감염의 예상 다양성 (MOI)은 부드러운 30 분 (100 RPM)을 진탕 37 ° C에서 1 품어 혼합물을 초과 할 수 없습니다.
      주 : 직전 파지 첨가합니다 (내재적 제한 효소를 불 활성화하기 위해 2 분 동안 52 ° C)을받는 세포의 열처리 효율 ^{12을 증가시킬 수있다.}
   4. 20 % 나 ₃ -Citrate의 50 μl를 추가합니다. 37 ° C에서 30 분 동안 흔들어 부드러운 계속합니다.
      참고 : 나 ₃ -Citrate 칼슘의 적당한 킬레이트 역할을합니다.
   5. 녹은 뇌 - 심장 주입 (BHI) 한천 (1.5 % 한천) 매체를 준비하고 55 ° C에서 물을 욕조에 보관합니다.
   6. , 100 mL의 플라스크에 세균 파지 액 이동 32 ㎎ / ℓ의 chloramp 보충 따뜻한 BHI 한천 배지 50 ㎖를 추가henicol, 잘 섞는다. 90mm 배양 접시에 혼합물을 부어.
      참고 :이 방법은 성장 식민지 (추정 transductants) 적은 수의 검출을 가능하게한다.
   7. 24 ~ 48 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
   8. 또한 32 밀리그램 / L의 클로람페니콜로 보충 된 새로운 BHI 아가 플레이트 상에 콜로니를 전송함으로써 저항 생성 콜로니 (transductants)를 테스트한다. 식민지 PCR ^(7)에 의해 CFR 유전자의 존재를 확인합니다.

3. 자연 변환

참고 : S. 구균의 자연적인 형질 전환 분석은 이전 연구 ^2에 기재된 방법에 따라 수행 하였다. N315 유도체 N2-2.1 ^{2, 7,} 수신자로서 사용 하였다. 이 변형에서, 한숨의 궤적이 중복 된 구성 적 표현 ^{한숨이되도록.} DET의 경우한숨 발현 능력 변종을 분리하는 방법에 대한 ailed 절차는, 이전의 설명 ² 참조하시기 바랍니다. 전송에 대한 내성 마커 클로람페니콜 없으면 PRIT 한숨-CM ^{(R)는 이전이} 설명 된대로 한숨 표현하는데 사용될 수있다. 정제 된 플라스미드 또는 CFR에서 전체 DNA 추출물은 S. 아우 레 우스 COL-45 ^(7)는 변환을위한 DNA 도너로서 사용 -acquired.

1. 공여자 DNA의 제조
   1. TSB 50 ㎖을 함유하는 300 ㎖의 플라스크에서 37 ° C에서 진탕 COL-45 밤새 배양 32 밀리그램 / L의 클로람페니콜로 보충. 문화 대장균 HST04 수행 pHY300 플라스미드 ^{(테트 R)을} 대조 실험을 위해 플라스미드를 추출한다.
      참고 : HST04 (댐 ^- / DCM ^-)는 DNA가 유전자 ¹³ 메틸화 없다. DNA의 methylases와 다른 기존의 균주도 사용 될 수 있습니다DNA의 메틸화 상태는 변환 효율에 영향을주지 않기 때문에, D는 공여체 DNA를 제조 하였다. 대안 적으로, S. 아우 레 우스 균주 COL로부터 정제 pT181 플라스미드는 형질 전환 분석 ² 양성 대조군으로 사용할 수있다.
   2. 원심 분리 (4 ℃에서 10 분 동안 8,000 XG)에서 세포를 수집합니다.
   3. 전체 DNA를 정제 플라스미드 DNA 추출 키트 또는 종래 DNA 정제 방법을 이용하여 플라스미드를 추출한다.
   4. 분광계에 의해 정제 된 DNA를 정량화하고 사용할 때까지 4 ° C에서 보관하십시오.
      참고 : 변환 분석, 오래 보통 이하 1 주일 새로운 DNA의 준비를 사용합니다. 오래 DNA 제제 변환의 효율을 감소시킨다.
2. 변환 분석
   1. 문화 진탕 37 ° C에서 하룻밤 TSB 5 ㎖에받는 사람 세포 (N2-2.1).
   2. 1.5 ML 튜브에 하룻밤 문화의 0.5 ml에 전송합니다. Precipi원심 분리 (4 ℃에서 1 분 10,000 XG)에서 세포를 하므로.
   3. 50 ㎖의 튜브 CS2 배지 10 mL로 세포를 일시.
      참고 : CS2 매체 (재질 표 매체 구성 참조) 황색 포도상 ^구균이 자연 변환에 역량을 유도하는 완전한 합성 매체입니다. 이러한 TSB 또는 BHI 같은 다른 표준 실험실 매체는, ^{변환이, 13에} 적합하지 않습니다.
   4. 후반 지수 단계 (약 8 시간)까지 (180 RPM) 진탕 37 ° C에서 박테리아를 성장.
   5. 원심 분리 (4 ° C에서 5 분 5,000 XG)에서 세포를 수확.
   6. CS2 신선한 배지 10ml에 세포를 재현 탁.
   7. 세포 현탁액에 정제 플라스미드 또는 게놈 DNA (단계 3.1.4)의 10 μg의 추가. 37 ° C에서 흔들어 2.5 시간 동안 180 rpm으로.
      참고 : DNA와 짧은 배양 시간 (<2.5 시간)보다 낮은 TRANSF 결과ormation 주파수.
   8. 원심 분리 (5,000 XG에 5 분 4 ° C에서)에 의해 세포를 수집합니다.
   9. BHI 배지 10 ㎖로 세포를 재현 탁. 용융 BHI 한천 90 ㎖의 32 ㎎ / ℓ의 클로람페니콜 (제어 실험 5 ㎎ / ℓ 테트라 사이클린)을 (55 ° C) 보충하여 세포 현탁액을 혼합한다. 90mm 배양 접시에 혼합물을 부어. 신속 시원하고 한천이 응고 할 수 있습니다.
   10. 2 일 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
   11. 그들의 저항 특성을 확인하기 위해 적절한 항생제를 함유하는 새로운 BHI 아가 플레이트에 (이쑤시개를 이용) 콜로니를 전달함으로써 생성 콜로니 (형질 전환) 복제. 식민지 PCR ^(7)에 의해 획득 내성 유전자 (CFR 또는 tetM)를 확인합니다.

결과

여기에 표시되는 결과는 이전에 발표되었다 (게시자의 허가 기준 ^{7 일부터} 적용). 우리 HGT 세 가지 메커니즘을 조사하여 저레벨 리네 졸리 드 내성 및 S. 아우 레 우스 균주에 PhLOPSA 내성 표현형 ^{14, 15의} 발현을 일으키는 CFR 유전자의 잠재적 인 송신 경로를 연구 하였다.

토론

이 작품은 황색 포도상 구균의 유전 적 결정의 HGT을 연구하는 세 가지 주요 방법을 설명합니다. 전달 및 접합 수십 년 동안 연구되어 왔지만, 자연적인 변화의 존재는 ^{최근이 인정되었다.} 따라서, S. 구균 HGT의 세 가지 모드 모두 장착되며, 이들 모두의 시험은 유전자 결정 인자의 가능한 전파 경로를 명확히 할 필요가있다. 이 연구의 목적은 완전한 프로토콜을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)	Becton Dickinson	211825
Brain Heart Infusion (BHI)	Becton Dickinson	211059
Nutrient Broth No. 2	Oxoid	CM0067
Sheep blood agar	Eiken Chemical Co.,Ltd.	E-MR96	Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.
Agar powder	Wako Pure Chemical Industries	010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)	Wako Pure Chemical Industries	191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter	Merck Milipore	HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit	QIAGEN	12243