Determinación espectrofotométrica de ficobiliproteína contenido en la cianobacteria Synechocystis

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para determinar cuantitativamente el contenido de ficobiliproteína en la cianobacteria Synechocystis mediante un método espectrofotométrico. El procedimiento de extracción fue aplicado con éxito a otras cepas de cianobacterias y algas; sin embargo, debido a variaciones en los espectros de absorción del pigmento, es necesario probar las ecuaciones espectrofotométricas para cada cepa individual.

Resumen

Esto es un protocolo simple para la determinación cuantitativa del contenido de ficobiliproteína en la cianobacteria Synechocystisdel modelo. Ficobiliproteínas son los componentes más importantes de phycobilisomes, las antenas principales de recolección de luz en cianobacterias y varios taxones de algas. Phycobilisomes de Synechocystis contienen dos ficobiliproteínas: ficocianina y allophycocyanin. Este protocolo describe un simple, eficiente y confiable método para la determinación cuantitativa de ficocianina y allophycocyanin en esta cianobacteria modelo. Se compararon varios métodos de extracción de ficobiliproteína y cuantificación espectrofotométrica. El procedimiento de extracción como se describe en este protocolo se aplicó con éxito a otras cepas de cianobacterias como Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., y Nostoc SP., así como las algas rojas Porphyridium cruentum. Sin embargo, los coeficientes de extinción de ficobiliproteínas específicos de distintos taxones pueden variar y por lo tanto, se recomienda validar el método de cuantificación espectrofotométrica para cada cepa individual. El protocolo requiere poco tiempo y puede realizarse en cualquier laboratorio de Ciencias de la vida estándar ya que requiere equipos estándar.

Introducción

fPhycobiliproteins son complejos de proteína pigmento soluble en agua que representan los componentes principales de las antenas de luz-cosechar en procariotas cianobacterias (Cyanophyta) y varios taxones eucariotas (Glaucophyta, Rhodophyta y Cryptophyta)¹. Se producen principalmente como complejos supramoleculares llamados phycobilisomes y por lo general se unen a la superficie de las membranas fotosintéticas en el lado del estroma, a excepción de Cryptophyta, donde se localizan las ficobiliproteínas en la tilacoides lumen². Hasta la fecha se han identificado cuatro tipos de ficobiliproteínas: el núcleo allophycocyanin y la ficocianina, ficoeritrina y phycoerythrocyanin periférica¹. Como los complejos principales de recolección de luz, phycobilisomes representan uno de los factores cruciales de la productividad de culturas masivas de algas y cianobacterias. Se ha demostrado que phycobilisomes truncamiento puede aumentar la acumulación de biomasa bajo luz fuerte³. Por otra parte, con irradiación moderada o baja, el truncamiento de la antena daba como resultado tasas de crecimiento y acumulación de biomasa reducción^3,4. Ficobiliproteínas comercialmente se utilizan como colorantes de alimentos, productos farmacéuticos y aditivos alimentarios, en la industria cosmética y fluorescencia sondas con aplicaciones en citometría de flujo, inmunoensayos fluorescentes y microscopía de fluorescencia⁵.

Este protocolo se centra en la determinación cuantitativa de ficobiliproteínas en la cianobacteria Synechocystisdel modelo. Cianobacterias están el primeros autótrofos fotosíntesis oxygenic; ha formando la Biosfera de la tierra por más de 2,4 billones de años⁶. Desempeñan un papel crucial en los ciclos biogeoquímicos globales de nitrógeno, carbono, oxígeno y otros elementos. Entre cianobacterias, una cepa unicelular Synechocystis ganó una posición única ya que fue el primer cianobacteria con la totalidad del genoma secuenciado^7,8, es naturalmente transformable por ADN exógeno⁹, y realiza un crecimiento estable y relativamente rápido de^10,11. En Synechocystis, el componente base de antena, allophycocyanin, se asocia con las proteínas integrales de membrana y la ficocianina adjunto se encuentra en la periferia de la membrana del thylakoid.

Varios métodos para la extracción de ficobiliproteína y cuantificación se comparan dentro de este protocolo. El procedimiento de extracción final fue aplicado con éxito para Synechocystis, así como a otras cepas de cianobacterias, incluyendo Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP.y Nostoc SP. y se aplicó con éxito a algas rojas Porphyridium cruentum. Por lo tanto, el método desarrollado en este protocolo puede considerarse como un método universal para la extracción de ficobiliproteína. A pesar de que algunos de los métodos de extracción probadas resultaron en mayores rendimientos de proteína total, aquí describe procedimiento de extracción siempre ficobiliproteína más rendimientos con el menor contenido de clorofila un residuo en el Extracto de ficobiliproteína. Reducir el contenido de clorofila a fue esencial para la correcta ficocianina y cuantificación espectrofotométrica allophycocyanin.

Los espectros de absorción de ficobiliproteína pueden variar significativamente entre diferentes algas y cianobacterias especies^{12,13,14,15,16,17} e incluso entre varias cepas de un género de cianobacterias solo¹⁸. Por lo tanto, las longitudes de onda específicas y coeficientes de absorción según lo utilizado para la determinación de ficocianina y allophycocyanin en Synechocystis no son generalmente aplicables a otras cepas. Además, Synechocystis no contienen ficoeritrina y phycoerythrocyanin que se puede encontrar en algunas algas y cianobacterias. A los efectos de la determinación de ficobiliproteínas en cepas que no sean de Synechocystis, se recomienda evaluar las ecuaciones espectrofotométricas para cada cepa individual.

Aunque el protocolo contiene dos pasos más (durante la noche la liofilización de los pellets celulares y extracción de proteínas de 1 hora), el tiempo de trabajo total para la cuantificación de ficobiliproteínas es no más de 2 horas.

Protocolo

1. cianobacterias cultivo

1. Cultivar células de Synechocystis en matraces Erlenmeyer o en fotobiorreactores^10,19 en tampón BG11 medio²⁰ a mantener un pH < 10 (p. ej., con 17 mM HEPES¹⁰).
   Nota: Las condiciones de cultivo estándar requieren una temperatura controlada (normalmente, 30 ° C, la temperatura óptima es de 35 ° C)²¹, iluminación (por lo general, una luz blanca de intensidad hasta 800 μmol [fotones] / [m²·s])²¹y un CO fuente ₂ (en el fotobiorreactor de planas de 400 mL, el crecimiento de saturar la concentración de CO₂ es 1.700 ppm)²¹.
2. Para determinar la densidad de cultivo, medir la densidad óptica de la cultura mediante espectrofotometría a 730 nm (OD₇₃₀) utilizando una cubeta con una trayectoria de la luz de 1 cm. por otra parte, contar las células bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro o una célula automatizada contador.

2. preparación de muestras

1. Trabajo con baja radiación para evitar la degradación de ficobiliproteína.
2. 3 x 1 mL de suspensión de cultivo en tubos safe-lock de la cosecha. Uso se triplica para la estimación de errores técnicos en la medición. Para realizar el muestreo del cultivo bajo condiciones estériles, cosechar las células en una campana laminar y siga las prácticas de trabajo y seguridad adecuadas.
3. Centrifugar las células a 15.000 x g a temperatura de laboratorio durante 5 min ponga atención en el rotor de la centrífuga correctamente equilibrada. Después de la centrifugación, descartar el sobrenadante. Asegúrese de no perturbar el sedimento.
4. Poner las muestras en un congelador. Para almacenamiento a largo plazo, mantener las muestras a-80 ° C. Esto es necesario para evitar la degradación de ficobiliproteína. Para el almacenamiento a corto plazo,-20 ° C es suficiente.
5. Las muestras por congelación durante la noche. Para un adecuado proceso de liofilización, mantener la temperatura del condensador secador de congelación por debajo de-60 ° C y la presión en la cámara de congelar-secador alrededor de 1 hPa.
6. Después de terminar el ciclo de liofilización, cierre el tubo tan pronto como sea posible para evitar la reabsorción de agua desde el aire.

3. célula de homogeneización y extracción de pigmentos

1. Añadir cuatro pedazos de granos de cristal (con un diámetro de 2 mm) a cada tubo de muestra y cerrar los tubos.
   Nota: Cuando la tapa del tubo de safe-lock usado para la homogeneización es demasiado fina, puede romper durante la homogeneización; por lo tanto, sólo el safe-lock tubos con tapas fuertes se recomiendan para este protocolo.
2. Homogeneizar las muestras con los granos de cristal de 15 s en un homogeneizador a temperatura de laboratorio.
   Nota: Una muestra bien homogeneizada se extiende sobre la superficie interna entera de los tubos safe-lock.
3. Añadir 1 mL de tampón PBS (pH 7.4), preenfriado a 4 ° C, para las muestras con el fin de extraer ficobiliproteínas.
   Nota: De este paso, mantener las muestras en hielo para evitar la degradación de las proteínas extraídas. Esto es fundamental.
4. Mezclar las muestras con PBS durante 5 s en el homogenizador a temperatura de laboratorio.
   Nota: Después de mezclar, las muestras son de color verdosas.
5. Después de mezclar, mantener las muestras en hielo durante 60 minutos tapa el baño de hielo con una tapa para evitar la degradación de pigmentos.
6. Después de 60 min de ficobiliproteína extracción, centrifugar las muestras a 15.000 x g a 4 ° C por 5 min atención para equilibrar adecuadamente el rotor de la centrífuga.
   Nota: Después de la centrifugación, el sobrenadante tiene un color azul cian.

4. ficobiliproteína cuantificación

1. Antes de la medición espectrofotométrica, calibrar el espectrofotómetro a la línea de base utilizando el tampón de PBS como un blanco.
2. Una vez calibrado el espectrofotómetro es descartar el PBS de una cubeta de espectrofotómetro y pipetear el sobrenadante con ficobiliproteínas extraído en vez de con el tampón de desecho.
3. Cuantificar la concentración de ficobiliproteína mediante espectrofotometría, utilizando un ancho de corte de 0.5 nm.
   1. Medir la absorbencia de la phycocyanobilins en ficocianina y allophycocyanin contra el tampón de PBS en blanco a 615 nm (un₆₁₅) y 652 nm (A₆₅₂), respectivamente, y medir la absorbencia de la ruina celular a 720 nm (un₇₂₀).
   2. Calcular la concentración de ficocianina y allophycocyanin según las ecuaciones (1) y (2) de Bennett y Bogorad¹²:
      
      
      Nota: A₆₁₅, A₆₅₂y un₇₂₀ deben ajustarse a la gama de absorbancia lineal del espectrofotómetro. Si es necesario, diluir la muestra con tampón PBS.
4. Calcular la concentración de pigmento en las muestras originales. La concentración de pigmento en la muestra se corresponde directamente con los resultados de las ecuaciones (1) y (2) cuando 1 mL de cultivo y 1 mL de la solución de extracción se utilizan para el análisis. En caso de utilizar diferentes volúmenes de las muestras de cianobacterias o tampón PBS, la concentración de pigmento final debe calcularse según la ecuación (3):
   (3)
   Nota: En caso de un contenido de ficobiliproteína normalización por peso seco de la célula, la concentración de pigmento final se calculará según la ecuación (4) (4)

5. determinación del peso seco celular (opcional)

1. Pesan tres tubos safe-lock vacíos en balanzas analíticas.
   PRECAUCIÓN: Es fundamental que los tubos safe-lock están secos. En el caso de almacenar los tubos en un ambiente húmedo, secar los tubos durante varias horas en congelar secador antes de pesarles. Manipular los tubos suavemente y sólo con las manos enguantadas para evitar cualquier contacto entre el material y los dedos del investigador libre de polvo. Mantenga todos los titulares y limpia para evitar a la transferencia de cualquier material de los tubos de centrífuga.
2. 1 x 15 mL de suspensión de cultivo en tubo cónico de 15 mL de la muestra.
3. Centrifugue la suspensión de la cultura en los tubos cónicos de 15 mL a 4.000 x g a temperatura de laboratorio durante 10 min equilibrio del rotor de la centrífuga con tres adicionales 15 mL tubos cónicos, cada uno conteniendo 15 mL de agua. Después de la centrifugación, descartar 12 mL del sobrenadante.
4. Resuspender el precipitado en el sobrenadante restante y la transferencia de 3 x 1 mL de la mezcla de tres tubos safe-lock de 1,5 mL con una pipeta. En el caso de algunas sobras de la pelotilla permanecen en el tubo cónico de 15 mL, agregar 1,5 mL de agua desionizada al tubo cónico, vortex o agitar el tubo para suspender de nuevo los restantes de la pelotilla y transferencia de 3 x 0,5 mL de la mezcla de los tres tubos de safe-lock de 1,5 mL (ya containi 3 x 1 mL de la pelotilla del ng) con una pipeta.
   Nota: Dividir la pastilla en tres tubos safe-lock de 1,5 mL permitirá la estimación de cualquier error técnico de medición de peso seco.
5. Centrifugar las células en tubos safe-lock de 1,5 mL a 15.000 x g a temperatura de laboratorio durante 5 min equilibrio del rotor de la centrífuga con un tubo adicional de safe-lock de 1,5 mL que contiene 1 mL de agua. Después de la centrifugación, descartar el sobrenadante.
6. Poner las muestras en el congelador. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener las muestras a-80 ° C; para el almacenamiento a corto plazo,-20 ° C es suficiente.
7. Las muestras por congelación durante la noche. Para un adecuado proceso de liofilización, mantener la temperatura del condensador secador de congelación por debajo de-90 ° C y la presión en la cámara de congelar-secador alrededor de 1 hPa.
8. Después de la liofilización, cierre los tubos y pese las muestras en balanzas analíticas.
   Nota: El valor del peso seco puede utilizarse para la normalización de los contenidos de ficobiliproteína por peso seco de la célula.

Resultados

Para las pruebas del método inicial, Synechocystis fue cultivado como culturas lote en matraces Erlenmeyer en una coctelera en BG11 cultivo medio²⁰ (complementado con 17 mM HEPES) a 25 ° C, bajo una luz blanca cálida de una intensidad de 50 μmol (fotones) / (m ²·s) y con 1% de CO₂ en la atmósfera de cultivo. Durante el cultivo, los cultivos fueron muestreados a los tubos safe-lock y centrifugaron (15.000 x g a temperatu...

Discusión

Este protocolo describe un método sencillo, rápido y reproducible para la cuantificación del contenido de ficobiliproteína en la cianobacteria Synechocystisdel modelo. Se comparan varios métodos de homogeneización de la célula, extracción de proteínas y cuantificación de ficocianina y allophycocyanin y el protocolo final representa una combinación de lo óptimo de cada procedimiento individual. Como datos representativos, se cuantificó el contenido de ficobiliproteínas en Synechocystis cél...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synechocystis sp. PCC 6803	Institut Pasteur, Paris, France	6803	Cyanobacterium strain
Roti-CELL PBS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	9143.1	Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes	Eppendorf, Hamburk, Germany	30120086	Safe-lock tubes 1.5 ml
VWR 80-Place Storage System	VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA	30128-282	Holder for safe-lock tubes
RAININ 100 µl -1000 µl	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	17014382	Pipette
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	30389272	Pipette tips
Rotina 420R	Hettich, Kirchlengern, Germany	4701	Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes
LCexv 4010	Liebherr, Bulle, Switzerland	9005382197172	Refrigerator and freezer -20 °C
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	EXF24086V	Freezer -80 °C
CoolSafe	LaboGene, Lillerød, Denmark	7.001.000.615	Freeze dryer
UV-2600	Shimadzu, Kyoto, Japan	UV-2600	Spectrophotometer
Hellma absorption cuvettes, semi Micro	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z600288	VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm
Silamat S6	Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein	602286WU	Homogenizer
Solid-glass beads	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z273627	Glass bead of the diameter 2 mm
CPA225D-0CE	Sartorius AG, Göttingen, Germany	SECURA225D-1OBR	Analytical balances
C-Phycocyanin from Spirulina sp.	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P2172	Phycocyanin standard
Allophycocyanin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7472	Allophycocyanin standard
Bicinchoninic Acid Kit	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	BCA1, B9643	Complete kit for total proteins determination
AlgaeTron	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	AG 130-ECO	Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere
Photobioreactor	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	FMT-150	Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment
Cellometer	Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA	Auto M10	Cell counter
Corning 15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS430791	15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling
Herasafe KS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	51024579	Laminar flow hood