Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Здесь мы представляем протокол количественно определить содержание phycobiliprotein в цианобактерии Synechocystis спектрофотометрическим методом. Процедура извлечения также успешно применяется для других штаммов водорослей и цианобактерий; Однако из-за различий в спектрах поглощения пигмент, необходимо отдельно проверить спектрофотометрические уравнения для каждого штамма.
Это простой протокол для количественного определения содержания phycobiliprotein в модели цианобактерии Synechocystis. Фикобилипротеинов являются наиболее важных компонентов phycobilisomes, основных светособирающего антенн в цианобактерий и несколько таксонов водорослей. Phycobilisomes Synechocystis содержат два фикобилипротеинов: фикоцианина и аллофикоцианин. Этот протокол описывает простой, эффективный и надежный метод количественного определения фикоцианина и аллофикоцианин в этой модели цианобактерии. Мы сравнили несколько методов добычи phycobiliprotein и спектрофотометрические количественной оценки. Процедура извлечения, как описано в настоящем протоколе был также успешно применяется для других штаммов цианобактерий например Arthrospira sp., Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, спирулина sp., и Nostoc sp., а также относительно красных водорослей порфиридиума cruentum. Однако коэффициенты вымирания конкретных фикобилипротеинов из различных таксонов могут отличаться и таким образом, рекомендуется проверить метод спектрофотометрические квантификации для каждое одного штамма индивидуально. Протокол требует немного времени и могут быть выполнены в любой лаборатории стандартного науки о жизни, так как он требует только стандартное оборудование.
fPhycobiliproteins являются водорастворимый пигмент белковых комплексов, которые представляют собой основные компоненты светособирающего антенн в прокариотических цианобактерий (синезеленых) и несколько эукариотические таксоны (Glaucophyta, Rhodophyta и криптофитов)1. Они возникают главным образом как супрамолекулярные комплексы, называется phycobilisomes, и обычно они прикреплены к поверхности фотосинтетических мембран на стороне стромы, за исключением криптофитов, где фикобилипротеинов локализованы в тилакоидов люмен2. Были определены четыре вида фикобилипротеинов до Дата: аллофикоцианин основных и периферийных фикоцианин, фикоэритрин и Фикоэритроцианин1. Как основной светособирающих комплексов phycobilisomes представляют собой один из важнейших факторов производительности массовой культуры водорослей и цианобактерий. Доказано, что phycobilisomes усечение может повысить накопления биомассы под сильный свет3. С другой стороны под скромным или низкой освещенности, антенна усечения привело темпы роста и биомассы накопления сокращение3,4. Фикобилипротеинов коммерчески используются красители пищевые, фармацевтических препаратов и пищевых добавок, в косметической промышленности, а также флуоресценции зондов с приложениями в проточной цитометрии, флуоресцентного иммуноанализа и микроскопии флуоресцирования5.
Этот протокол фокусируется на количественное определение фикобилипротеинов в модели цианобактерии Synechocystis. Цианобактерии являются ранние oxygenic фотосинтетических автотрофы; они формировании биосферы земли более 2,4 миллиарда лет6. Они играют решающую роль в глобальных биогеохимических циклах, азота, углерода, кислорода и других элементов. Среди цианобактерий, одноклеточные штамм Synechocystis получила уникальное положение, поскольку он был первым цианобактерии с весь геном последовательности7,8, это естественно трансформер экзогенной ДНК9, и Он выполняет стабильным и относительно быстрый рост10,11. В Synechocystis, основной компонент антенна, аллофикоцианин, ассоциируется с составной мембранных белков и прилагаемый фикоцианина расположен на периферии тилакоидной мембраны.
Несколько методов для извлечения phycobiliprotein и количественной оценки сравниваются в рамках настоящего Протокола. Процедура окончательного извлечения был успешно применен Synechocystis, а также другие цианобактерий штаммов, включая Arthrospira Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, спирулина sp., СП.и Nostoc sp. и он был также успешно применяется для красных водорослей порфиридиума cruentum. Таким образом метод, разработанный в этом протоколе может рассматриваться как универсальный метод для извлечения phycobiliprotein. Даже несмотря на то, что некоторые из методов испытания извлечения привело к повышению урожайности общего белка, здесь описывается процедура извлечения условии высоким phycobiliprotein дает вместе с наименьшим содержанием остатков хлорофилла в Экстракт Phycobiliprotein. Для правильной фикоцианина и аллофикоцианин спектрофотометрические количественной оценки необходимо уменьшить содержание хлорофилла .
Спектры поглощения phycobiliprotein может значительно различаться между различными водоросли и цианобактерии видов12,13,14,,1516,17 и даже среди нескольких штаммов одного цианобактерий рода18. Таким образом конкретные длинах волн и поглощения коэффициенты, используемые для определения фикоцианина и аллофикоцианин в Synechocystis не применяются обычно для других штаммов. Кроме того Synechocystis не содержат фикоэритрин и Фикоэритроцианин, которые могут быть найдены в некоторых других водорослей и цианобактерий. Для целей определения фикобилипротеинов штаммов Synechocystisпомимо рекомендуется оценить спектрофотометрические уравнения для каждого штамма индивидуально.
Хотя протокол содержит два больше шагов (на ночь паром для лиофильной сушки сотовой окатышей и извлечения протеина 1 час), общее рабочее время для количественной оценки фикобилипротеинов не более 2 часов.
1. цианобактерий культивирование
2. образцы подготовка
3. сотовый гомогенизации и пигменты извлечения
4. Phycobiliprotein количественная оценка
5. Определение ячейки сухого веса (опционально)
Для первоначального метода испытаний, Synechocystis культивировалось как пакетного культур в колбах Эрленмейер на шейкер в BG11 культивирование средний20 (ДОПОЛНЕНО 17 мм HEPES) при 25 ° C, под теплый белый свет интенсивности 50 мкмоль (фотонов) / (м 2·s) и с 1% CO...
Этот протокол описывает простой, быстрый и воспроизводимый метод количественного определения содержания phycobiliprotein в модели цианобактерии Synechocystis. Сравниваются несколько методов клеток гомогенизации, экстракции белков и фикоцианина и аллофикоцианин количественной оценки, и Закл...
Авторы не имеют ничего сообщать.
Протокол был принят от предыдущей публикации11. Т. з., Ch. ум и J. Č. были поддержаны министерства образования, молодежи и спорта Чешской Республики в рамках национальной программы устойчивого развития я (НПУ я), предоставить номер LO1415. J. Č. было также поддержано GA CR, номер гранта 18-24397S. Доступ к документам и другим объектам было поддержано чешский исследовательской инфраструктуры для систем биологии C4SYS (проект не LM2015055). М. а. с. была поддержана грантом от российского фонда науки [№ 14-14-00904].
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены