Determinação espectrofotométrica de Phycobiliprotein conteúdo em associação Synechocystis

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar quantitativamente o conteúdo de phycobiliprotein na associação Synechocystis , usando um método espectrofotométrico. O procedimento de extração foi aplicado também com sucesso para outras cepas de cianobactérias e algas; no entanto, devido às variações em espectros de absorção do pigmento, é necessário testar as equações espectrofotométricas para cada estirpe individualmente.

Resumo

Este é um protocolo simples para a determinação quantitativa do teor de phycobiliprotein na associação modelo Synechocystis. Phycobiliproteins são os componentes mais importantes de ficobilissoma captadores, as grandes antenas de luz-colheita em cianobactérias e vários táxons de algas. Os ficobilissoma captadores de Synechocystis contêm dois phycobiliproteins: ficocianina e allophycocyanin. Este protocolo descreve uma simples, eficiente e confiável método para a determinação quantitativa de ficocianina e allophycocyanin na associação deste modelo. Comparou-se vários métodos de extração de phycobiliprotein e quantificação espectrofotométrica. O procedimento de extração, conforme descrito neste protocolo foi aplicado também com sucesso para outras cepas de cianobactérias como Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp.,sp intoxicante ., e Nostoc SP., bem como sobre algas vermelhas Porphyridium Dendrobrium. No entanto, os coeficientes de extinção de phycobiliproteins específicas de vários táxons podem diferir e, portanto, recomenda-se validar o método de quantificação espectrofotométrica para cada estirpe única individualmente. O protocolo requer pouco tempo e pode ser executado em qualquer laboratório de Ciências da vida padrão, pois requer equipamento padrão somente.

Introdução

fPhycobiliproteins são complexos de proteína-pigmento hidrossolúvel que representam os componentes principais das antenas de luz-colheita em procariontes cianobactérias (Cyanophyta) e vários táxons eucariontes (Glaucophyta, Rhodophyta e Cryptophyta)¹. Eles ocorrem principalmente como complexos supramoleculares chamados ficobilissoma captadores e estão normalmente ligados à superfície das membranas fotossintéticas do lado do estroma, com excepção dos Cryptophyta, onde os phycobiliproteins são localizadas no tilacoides lúmen². Foram identificados quatro tipos de phycobiliproteins até a data: allophycocyanin o núcleo e o periférico ficocianina, ficoeritrina e phycoerythrocyanin¹. Como os principais complexos de luz-colheita, ficobilissoma captadores representam um dos fatores cruciais de produtividade de culturas em massa de algas e cianobactérias. Foi demonstrado que truncamento ficobilissoma captadores pode aumentar o acúmulo de biomassa sob luz forte³. Por outro lado, sob o modesta ou baixa irradiância, o truncamento de antena resultou em taxas de crescimento e acúmulo de biomassa a redução^3,4. Phycobiliproteins comercialmente são usados como corantes de alimentos, medicamentos e aditivos alimentares, na indústria de cosmético e como fluorescência sondas com aplicações em citometria de fluxo fluorescentes imunoensaios e de microscopia de fluorescência⁵.

Este protocolo centra-se na determinação quantitativa de phycobiliproteins na associação modelo Synechocystis. Cianobactérias são os primeiros autotróficos fotossintéticos Membros; Eles têm sido formando da Biosfera da terra por mais de 2,4 bilhões de anos⁶. Eles jogam um papel crucial nos ciclos biogeoquímicos globais de carbono, nitrogênio, oxigênio e outros elementos. Entre cianobactérias, uma estirpe unicelular Synechocystis ganhou uma posição única, já que foi a primeira associação com o todo o genoma sequenciado^7,8, é naturalmente transformável por exógeno DNA⁹, e Ele executa o crescimento estável e relativamente rápido^10,11. Em Synechocystis, o componente central de antena, allophycocyanin, está associado com as proteínas de membrana integrais e a ficocianina anexada está localizada na periferia de membrana tilacoides.

Vários métodos de extração de phycobiliprotein e quantificação são comparados neste protocolo. O procedimento de extração final foi aplicado com êxito Synechocystis, bem como outras estirpes de cianobactérias, incluindo Cyanothece sp de Spirulina SP., Synechococcuselongatus,., intoxicante SP..e Nostoc SP. e foi também aplicado com sucesso algas vermelhas Porphyridium Dendrobrium. Portanto, o método desenvolvido no presente protocolo pode ser considerado como um método universal para a extração de phycobiliprotein. Apesar de alguns dos métodos de extração testados resultaram em rendimentos mais elevados de proteína total, o aqui descrito procedimento de extração, desde o mais alto phycobiliprotein produz juntamente com o menor teor de um resíduo de clorofila na extrato de phycobiliprotein. Redução do teor de clorofila um foi essencial para a correta ficocianina e quantificação espectrofotométrica de allophycocyanin.

Os espectros de absorção de phycobiliprotein pode variar significativamente entre diferentes algas e cianobactérias espécie^{12,13,14,15,16,17} e até mesmo entre várias cepas de cianobactérias único género¹⁸. Portanto, os comprimentos de onda específicos e coeficientes de absorção como usado para a determinação de ficocianina e allophycocyanin em Synechocystis não são geralmente aplicáveis a outras estirpes. Além disso, Synechocystis não contiver ficoeritrina e phycoerythrocyanin que pode ser encontrado em algumas outras algas e cianobactérias. Para a determinação de phycobiliproteins em cepas diferentes Synechocystis, recomenda-se avaliar as equações espectrofotométricas para cada estirpe individualmente.

Embora o protocolo contém duas etapas mais tempo (durante a noite de liofilização de pelotas celulares e extração da proteína 1 hora), o tempo de trabalho total para a quantificação de phycobiliproteins é não mais de 2 horas.

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Protocolo

1. cultivo de cianobactérias

1. Cultive células Synechocystis em Erlenmeyers ou em fotobiorreatores^10,19 em buffer BG11 médio²⁰ para manter um pH de < 10 (por exemplo, usando 17 mM HEPES¹⁰).
   Nota: As condições de cultivo padrão exigem uma temperatura controlada (normalmente, 30 ° C, a temperatura ideal é 35 ° C)²¹, iluminação (normalmente, uma luz branca de uma intensidade até 800 µmol [fótons] / [m²·s])²¹e um CO fornecimento de ₂ (no photobioreactor plana de 400 mL, o crescimento, saturando a concentração de CO₂ é 1.700 ppm)²¹.
2. Para determinar a densidade de cultura, medir a densidade óptica da cultura por espectrometria no 730 nm (OD₇₃₀), utilizando uma cubeta com um caminho de luz de 1 cm. Alternativamente, contar as células em um microscópio usando um hemocytometer ou uma célula automatizada contador.

2. preparação de amostras

1. Trabalho sob baixa irradiância para prevenir a degradação de phycobiliprotein.
2. 3 x 1 mL de suspensão de cultura para cofre-bloqueio tubos de colheita. Use o triplica de estimativa de erros técnicos na medição. Para realizar a amostragem de cultura sob condições estéreis, colher as células em uma capa laminar e siga as práticas de trabalho e segurança adequadas.
3. Centrifugar as células a 15.000 x g a temperatura do laboratório por 5 min. Preste atenção para o rotor de centrífuga devidamente equilibrada. Após a centrifugação, descarte os sobrenadantes. Certifique-se para não perturbar a pelota.
4. Colocar as amostras no congelador. Para armazenamento a longo prazo, manter as amostras a-80 ° C. Isso é necessário para prevenir a degradação de phycobiliprotein. Para o armazenamento a curto prazo,-20 ° C é suficiente.
5. Congela as amostras durante a noite. Para um adequado processo de liofilização, manter a temperatura do condensador Liofilizador abaixo de-60 ° C e a pressão na câmara Liofilizador em torno de 1 hPa.
6. Depois de terminar o ciclo de liofilização, feche o tubo logo que possível para evitar a reabsorção de água do ar.

3. pilha de homogeneização e extração de pigmentos

1. Adicione quatro pedaços de grânulos de vidro (com um diâmetro de 2 mm) para cada tubo de amostra e fechar os tubos.
   Nota: Quando a tampa do cofre-fechamento tubo usado para homogeneização é magra demais, pode quebrar durante a homogeneização; Portanto, apenas segura-bloqueio tubos com tampas fortes são recomendados para este protocolo.
2. Homogeneizar as amostras com os grânulos de vidro por 15 s em um homogeneizador a temperatura do laboratório.
   Nota: Uma amostra devidamente homogeneizada é espalhada sobre a superfície interior dos tubos de bloqueio de segurança.
3. Adicione 1 mL de tampão PBS (pH 7,4), pré-resfriado a 4 ° C, para as amostras a fim de extrair o phycobiliproteins.
   Nota: Este passo no, mantenho as amostras no gelo para evitar a degradação das proteínas extraídas. Isto é crítico.
4. Misturar as amostras com PBS para 5 s do homogenizador a temperatura do laboratório.
   Nota: Após a mistura, as amostras são esverdeadas.
5. Após a mistura, manter as amostras no gelo por 60 min. tampa o banho de gelo com uma tampa para evitar a degradação de pigmentos.
6. Após 60 min de extração phycobiliprotein, Centrifugar as amostras a 15.000 x g a 4 ° C por 5 min. Preste atenção para equilibrar corretamente o rotor de centrífuga.
   Nota: Após a centrifugação, o sobrenadante tem uma cor azul ciana.

4. Phycobiliprotein quantificação

1. Antes da medição espectrofotométrica, calibre o espectrofotômetro para a linha de base usando o tampão PBS como um espaço em branco.
2. Uma vez que o espectrofotômetro calibrado, descartar a PBS de um fluorímetro e pipetar o sobrenadante com phycobiliproteins extraído em vez de com o buffer de descartados.
3. Quantificar a concentração de phycobiliprotein espectrofotometricamente, usando uma largura de fenda de 0,5 nm.
   1. Medir a absorvância do phycocyanobilins em ficocianina e allophycocyanin contra o tampão PBS em branco no 615 nm (₆₁₅) e 652 nm (₆₅₂), respectivamente, e medir a absorvância dos restos celulares em 720 nm (₇₂₀).
   2. Calcule a concentração de ficocianina e allophycocyanin de acordo com as equações (1) e (2) de Bennett e Bogorad¹²:
      
      
      Nota: Um₆₁₅, um₆₅₂e um₇₂₀ devem caber ao intervalo linear absorvância do espectrofotómetro. Se necessário, dilua a amostra com o tampão PBS.
4. Recalcule a concentração de pigmento nas amostras originais. A concentração de pigmento na amostra corresponde diretamente com os resultados das equações (1) e (2) quando a 1 mL de cultura e 1 mL de tampão de extração são utilizados para a análise. No caso de utilizar diferentes volumes de amostras de cianobactérias e/ou tampão PBS, a concentração de pigmento final deve ser calculada de acordo com a equação (3):
   (3)
   Nota: No caso de um normalização phycobiliprotein conteúdo por peso seco de célula, a concentração de pigmento final deve ser calculada de acordo com a equação (4) (4)

5. determinação do peso seco da célula (opcional)

1. Pesa três tubos de fechadura de cofre vazios em balanças analíticas.
   Atenção: É fundamental que os tubos de bloqueio de segurança estão secos. No caso de armazenar os tubos em um ambiente úmido, seque os tubos durante várias horas em um secador antes da pesagem-los de gelo. Manipular os tubos com cuidado e somente com as mãos enluvadas sem pó para evitar qualquer contato entre o material e os dedos do pesquisador. Manter todos os titulares e limpo para evitar a transferência de qualquer material para os tubos de centrifugação.
2. 1 x 15 mL de suspensão de cultura em tubo cônico de 15 mL de amostra.
3. Centrifugar a suspensão de cultura em tubos cônicos de 15 mL a 4.000 x g a temperatura do laboratório durante 10 min. de equilíbrio do rotor de centrífuga com três adicionais-15ml cónicos tubos, contendo cada uma 15 mL de água. Após a centrifugação, descarte 12 mL do sobrenadante.
4. Resuspenda o pellet em restante sobrenadante e transferir 3 x 1 mL da mistura de três tubos de bloqueio de segurança de 1,5 mL com uma pipeta. No caso de algumas sobras da pelota permanecem no tubo cônico de 15 mL, adicionar 1,5 mL de água desionizada ao tubo cônico, vórtice ou agitar o tubo para Ressuspender o restante da pelota e transferir 3 x 0,5 mL da mistura para os três tubos de cofre-fechamento 1,5 mL (já containi ng 3 x 1 mL da pelota) com uma pipeta.
   Nota: Dividindo a pelota sobre três tubos de 1,5 mL cofre-fechadura permitirá a estimativa de qualquer erro técnico de medição de peso seco.
5. Centrifugar as células em tubos de 1,5 mL cofre-bloqueio a 15.000 x g a temperatura do laboratório por 5 min. de equilíbrio do rotor de centrífuga com um tubo de segurança-bloqueio de 1,5 mL adicional que contém 1 mL de água. Após a centrifugação, descarte os sobrenadantes.
6. Colocar as amostras no congelador. Para armazenamento a longo prazo, manter as amostras a-80 ° C; para armazenar a curto prazo,-20 ° C é suficiente.
7. Congela as amostras durante a noite. Para um adequado processo de liofilização, manter a temperatura do condensador secador de congelamento abaixo de-90 ° C e a pressão na câmara Liofilizador em torno de 1 hPa.
8. Após a liofilização, feche os tubos e pesar as amostras em balanças analíticas.
   Nota: O valor do peso seco pode ser usado para a normalização do conteúdo por peso seco celular phycobiliprotein.

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Resultados

Para os testes do método inicial, Synechocystis era cultivada como culturas de lote em Erlenmeyers num agitador em BG11 cultivo médio²⁰ (suplementado com 17 mM HEPES) a 25 ° C, sob uma luz branca quente de uma intensidade de 50 µmol (fótons) / (m ²·s) e com 1% de CO₂ na atmosfera de cultivo. Durante o cultivo, as culturas foram amostradas para tubos de bloqueio seguro e centrifugaram (15.000 x g a temperatura do laborat...

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Discussão

Este protocolo descreve um método simples, rápido e reprodutível para a quantificação do teor de phycobiliprotein na associação modelo Synechocystis. Vários métodos de homogeneização de células, extração de proteínas e quantificação de ficocianina e allophycocyanin são comparados, e o protocolo final representa uma combinação das etapas de cada procedimento único ideais. Como dados representativos, o conteúdo de phycobiliproteins foi quantificado em células de Synechocystis sob cr...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synechocystis sp. PCC 6803	Institut Pasteur, Paris, France	6803	Cyanobacterium strain
Roti-CELL PBS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	9143.1	Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes	Eppendorf, Hamburk, Germany	30120086	Safe-lock tubes 1.5 ml
VWR 80-Place Storage System	VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA	30128-282	Holder for safe-lock tubes
RAININ 100 µl -1000 µl	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	17014382	Pipette
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	30389272	Pipette tips
Rotina 420R	Hettich, Kirchlengern, Germany	4701	Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes
LCexv 4010	Liebherr, Bulle, Switzerland	9005382197172	Refrigerator and freezer -20 °C
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	EXF24086V	Freezer -80 °C
CoolSafe	LaboGene, Lillerød, Denmark	7.001.000.615	Freeze dryer
UV-2600	Shimadzu, Kyoto, Japan	UV-2600	Spectrophotometer
Hellma absorption cuvettes, semi Micro	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z600288	VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm
Silamat S6	Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein	602286WU	Homogenizer
Solid-glass beads	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z273627	Glass bead of the diameter 2 mm
CPA225D-0CE	Sartorius AG, Göttingen, Germany	SECURA225D-1OBR	Analytical balances
C-Phycocyanin from Spirulina sp.	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P2172	Phycocyanin standard
Allophycocyanin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7472	Allophycocyanin standard
Bicinchoninic Acid Kit	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	BCA1, B9643	Complete kit for total proteins determination
AlgaeTron	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	AG 130-ECO	Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere
Photobioreactor	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	FMT-150	Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment
Cellometer	Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA	Auto M10	Cell counter
Corning 15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS430791	15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling
Herasafe KS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	51024579	Laminar flow hood