Photometrische Bestimmung des Cyanobakteriums Synechocystis Phycobiliprotein Inhalt

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Phycobiliprotein Inhalt in cyanobakteriums Synechocystis eine photometrische Methode quantitativ zu bestimmen. Extraktionsverfahren wurde auch erfolgreich auf andere Cyanobakterien und Algen Stämme angewendet; jedoch aufgrund von Variationen in Pigment Absorptionsspektren ist es notwendig, die photometrische Gleichungen für jede Belastung individuell zu testen.

Zusammenfassung

Dies ist ein einfaches Protokoll für die quantitative Bestimmung der Phycobiliprotein Inhalt in das Modell cyanobakteriums Synechocystis. Phycobiliproteins sind die wichtigsten Komponenten des Phycobilisomes, das großen Licht-ernten Antennen in Cyanobakterien und einige Algen Taxa. Die Phycobilisomes Synechocystis enthalten zwei Phycobiliproteins: Phycocyanin und Allophycocyanin. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, effiziente, und zuverlässige Methode zur quantitativen Bestimmung von Phycocyanin und Allophycocyanin in diesem Modell Cyanobakterium. Wir haben mehrere Methoden der Phycobiliprotein Extraktion und spektralphotometrische Quantifikation verglichen. Extraktionsverfahren wie in diesem Protokoll beschrieben wurde auch erfolgreich auf andere Cyanobakterien Stämme wie Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., angewendet. und Nostoc SP., Rotalgen Porphyridium Cruentum. Jedoch die vom Aussterben bedroht-Koeffizienten der spezifischen Phycobiliproteins aus verschiedenen Taxa können unterschiedlich sein und es empfiehlt daher, die photometrische Quantifizierungsmethode für jede einzelne Belastung individuell zu validieren. Das Protokoll erfordert nur geringen Zeitaufwand und kann in jedem standard Life-Science-Labor durchgeführt werden, da es nur standard-Ausrüstung erfordert.

Einleitung

fPhycobiliproteins sind wasserlösliche Pigment-Protein-komplexe, die Hauptkomponenten des Licht-ernten Antennen in prokaryotic Cyanobacteria (Cyanophyta) und mehrere eukaryotischen Taxa (Glaucophyta, Rhodophyta darstellen , und Cryptophyta)¹. Sie kommen hauptsächlich als supramolekulare komplexe Phycobilisomes genannt und sie hängen in der Regel an die Oberfläche der photosynthetischen Membranen auf der Stromale Seite, mit Ausnahme von Cryptophyta, wo die Phycobiliproteins, in lokalisiert sind der Thylakoidmembran Lumen². Vier Arten von Phycobiliproteins wurden auf dem neuesten Stand: die Kern-Allophycocyanin und die peripheren Phycocyanin, Phycoerythrin und Phycoerythrocyanin¹. Als die wichtigsten lichtsammelkomplexe repräsentieren Phycobilisomes eines der entscheidenden Faktoren der Algen und Cyanobakterien massenkulturen Produktivität. Es wurde nachgewiesen, dass diese Phycobilisomes Abschneiden Biomasse Akkumulation unter starkem Licht³verbessern kann. Auf der anderen Seite führte unter bescheidenen oder niedrigen Bestrahlungsstärke, die Antenne Abschneiden Wachstumsraten und Biomasse Akkumulation Reduktion^3,4. Phycobiliproteins dienen im Handel als Lebensmittel-Farbstoffe, Pharma und Lebensmittel-Zusatzstoffe in der kosmetischen Industrie sowie Fluoreszenz Sonden mit Anwendungen in der Durchflusszytometrie, fluoreszierende Immunoassays und Fluoreszenz-Mikroskopie-⁵.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die quantitative Bestimmung der Phycobiliproteins in das Modell cyanobakteriums Synechocystis. Cyanobakterien sind die frühesten sauerstoffhaltige photosynthetischen Autotrophe; Sie haben die Biosphäre der Erde für mehr als 2,4 Milliarden Jahren⁶gebildet. Sie spielen eine entscheidende Rolle im globalen biogeochemischen Kreisläufe von Stickstoff, Kohlenstoff, Sauerstoff und anderen Elementen. Unter den Cyanobakterien, eine einzellige Sorte Synechocystis eine Alleinstellung gewonnen, da war es die erste Cyanobakterium mit dem gesamten Genom sequenziert^7,8, ist es natürlich umwandelbar durch exogene DNA-⁹, und Es führt stabil und relativ schnelles Wachstum^10,11. In Synechocystis, die Kernkomponente Antenne Allophycocyanin, die integraler Membranproteine zugeordnet ist und die beigefügten Phycocyanin befindet sich an der Thylakoidmembran Membran Peripherie.

Mehrere Methoden zur Phycobiliprotein Extraktion und Quantifizierung werden in diesem Protokoll verglichen. Die endgültige Extraktionsverfahren wurde erfolgreich Synechocystissowie andere Cyanobakterien Stämme, einschließlich Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira eingesetzt. SP., und Nostoc SP., und es wurde auch erfolgreich auf Rotalgen Porphyridium Cruentumangewendet. Daher kann die Methode entwickelt, die in diesem Protokoll als eine universelle Methode für die Extraktion von Phycobiliprotein betrachtet werden. Obwohl einige der getesteten Extraktionsmethoden Gesamtprotein Ertragssteigerungen geführt, die hier beschrieben Extraktionsverfahren vorausgesetzt ergibt sich die höchste Phycobiliprotein zusammen mit dem niedrigsten Inhalt von Chlorophyll ein Rückstand in der Phycobiliprotein zu extrahieren. Reduzierung des Gehalts an Chlorophyll ein war entscheidend für die richtige Phycocyanin und Allophycocyanin spektralfotometrische Quantifizierung.

Die Phycobiliprotein Absorptionsspektren können variieren erheblich zwischen den verschiedenen Algen und Cyanobakterien Arten^{12,13,14,15,16,17} und sogar unter mehrere Stämme von einem einzigen Cyanobakterien Gattung¹⁸. Daher sind die spezifischen Wellenlängen und Absorption Koeffizienten zur Bestimmung von Phycocyanin und Allophycocyanin in Synechocystis verwendet nicht allgemein anwendbar auf andere Stämme. Darüber hinaus bietet Synechocystis keine Phycoerythrin und Phycoerythrocyanin, die in einigen anderen Algen und Cyanobakterien gefunden werden können. Für die Zwecke der Bestimmung der Phycobiliproteins Stämme als Synechocystisempfiehlt es sich, die photometrische Gleichungen für jede Belastung individuell zu bewerten.

Obwohl das Protokoll länger zweistufig (über Nacht von der zellulären Pellets und 1 Stunde Proteingewinnung Gefriertrocknung) enthält, ist die gesamte Arbeitszeit für die Quantifizierung der Phycobiliproteins nicht länger als 2 Stunden.

Protokoll

(1) Cyanobakterien Anbau

1. Synechocystis Zellen im Erlenmeyerkolben oder in Photobioreaktoren^10,19 in gepufferten BG11 Medium²⁰ einen pH-Wert von < 10 (z. B.mit 17 mM HEPES¹⁰) weiterhin zu pflegen.
   Hinweis: Standard Anbaubedingungen erfordern einen kontrollierten Temperatur (30 ° C, die optimale Temperatur ist in der Regel 35 ° C)²¹, Beleuchtung (in der Regel ein weißes Licht mit einer Intensität bis zu 800 µmol [Photonen] / [m²·s])²¹und ein CO ₂ Lieferung (in der 400-mL-Flachbildschirm-Photobioreaktor ist das Wachstum Sättigung CO₂ -Konzentration 1.700 ppm)²¹.
2. Um die Kultur-Dichte zu bestimmen, Messen Sie die Kultur optische Dichte spektralphotometrisch bei 730 nm (OD₇₃₀) mit einer Küvette mit einer Schichtdicke von 1 cm. Alternativ zählen die Zellen unter dem Mikroskop mit einer Hemocytometer oder einer automatisierten Zelle Zähler.

2. Proben-Vorbereitung

1. Arbeiten Sie unter niedrigen Bestrahlungsstärke, Phycobiliprotein Abbau zu verhindern.
2. 3 x 1 mL Suspension Kultur zu Safe-Lock Tubes zu ernten. Verwenden Sie Triplicates für die Schätzung von technischen Fehlern bei der Messung. Um die Kultur-Probenahme unter sterilen Bedingungen durchzuführen, Ernten Sie die Zellen in einer laminaren Kapuze und folgen Sie die richtigen Arbeits- und Praktiken.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen im Labor Temperatur 5 min. Achten Sie auf die ausgewogene Zentrifuge Rotor 15.000 X g . Verwerfen Sie nach Zentrifugation die Überstände. Achten Sie darauf, nicht zu stören das Pellet.
4. Setzen Sie die Proben in einer Tiefkühltruhe. Halten Sie für die langfristige Lagerung die Proben bei-80 ° C. Dies ist notwendig, Phycobiliprotein Abbau zu verhindern. Für kurzfristige Lagerung ist-20 ° C ausreichend.
5. Gefriertrocknen Sie die Proben über Nacht. Für einen richtigen Gefriertrocknung Prozess halten die Temperatur des Kondensators Einfrieren-Trockner unter-60 ° C und der Druck in der Freeze-Trockner Kammer ca. 1 hPa.
6. Schließen Sie nach Beendigung des Gefriertrocknung Zyklus den Schlauch so bald wie möglich auf die Resorption von Wasser aus der Luft zu verhindern.

3. Handy-Homogenisierung und Pigmente Extraktion

1. Jede Probenröhrchen vier Stücke von Glasperlen (mit einem Durchmesser von 2 mm) hinzu und schließen Sie die Rohre.
   Hinweis: Wenn der Deckel der Safe-Lock-Röhre zur Homogenisierung zu dünn ist, kann es während der Homogenisierung zu brechen; Daher sind nur Safe-Lock Röhren mit starken Deckeln für dieses Protokoll empfohlen.
2. Homogenisieren der Proben mit den Glasperlen für 15 s auf einem Homogenisator bei Labor-Temperatur.
   Hinweis: Eine richtig homogenisierte Probe breitet sich über die ganze innere Fläche der Safe-Lock-Röhren.
3. Fügen Sie 1 mL PBS-Puffer (pH-Wert 7,4), bis 4 ° C, um die Proben um Phycobiliproteins extrahieren vorgekühlt.
   Hinweis: Halten Sie von diesem Schritt auf die Proben auf Eis, um den Abbau der extrahierten Proteine zu verhindern. Dies ist kritisch.
4. Mischen Sie die Proben mit PBS für 5 s auf den Homogenisator bei Labor-Temperatur.
   Hinweis: Nach dem Mischen sind die Proben grünlich.
5. Nach dem Mischen, halten Sie den Proben auf Eis für 60 min. Abdeckung das Eisbad mit einem Deckel zu Pigmenten Abbau zu verhindern.
6. Zentrifugieren Sie nach 60 min Phycobiliprotein Extraktion die Proben bei 15.000 X g bei 4 ° C für 5 min. Achten Sie darauf, die Zentrifuge Rotor richtig auszugleichen.
   Hinweis: Nach der Zentrifugation des Überstands hat eine Cyan blaue Farbe.

4. Phycobiliprotein Quantifizierung

1. Kalibrieren Sie bevor die photometrische Messung Spektralphotometer zur Grundlinie mit PBS-Puffer als Rohling.
2. Nach der Kalibrierung Spektralphotometer verwerfen die PBS von einem Spektrofotometer Küvetten und pipette des Überstands mit extrahierten Phycobiliproteins statt mit dem ausrangierten Puffer.
3. Quantifizierung die Phycobiliprotein Konzentration spektrophotometrisch, mit einer Spaltbreite von 0,5 nm.
   1. Messen Sie die Absorption von Phycocyanobilins in Phycocyanin und Allophycocyanin gegen die PBS-Puffer leer bei 615 nm (ein₆₁₅) und 652 nm (eine₆₅₂), bzw., und Messen Sie die Absorption der zelltrümmer bei 720 nm (A₇₂₀).
   2. Berechnen Sie die Konzentration von Phycocyanin und Allophycocyanin nach den Gleichungen (1) und (2) von Bennett und Bogorad¹²:
      
      
      Hinweis: Eine₆₁₅, eine₆₅₂und ein₇₂₀ sollte auf den Bereich der linearen Absorption des Spektralphotometers passen. Falls notwendig, verdünnen Sie die Probe mit PBS-Puffer.
4. Neuberechnung der Pigmentkonzentration in die original-Samples. Die Pigmentkonzentration in der Probe entspricht direkt mit den Ergebnissen der Gleichungen (1) und (2) bei 1 mL Kultur und 1 mL des Puffers Extraktion für die Analyse verwendet werden. Bei der Verwendung von unterschiedlichen Mengen von Cyanobakterien Proben und/oder PBS-Puffer, sollte die endgültige Pigmentkonzentration gemäß Gleichung (3) berechnet werden:
   (3)
   Hinweis: Im Falle einer Normalisierung Phycobiliprotein Inhalte pro Zelle Trockengewicht, die endgültige Pigmentkonzentration berechnet werden soll nach Gleichung (4) (4)

5. Ermittlung der Zelle Trockengewicht (Optional)

1. Analysenwaagen belasten Sie drei Safe-Lock-Leerhülsen.
   Achtung: Es ist wichtig, dass die Safe-Lock-Rohre trocken sind. Trocknen Sie bei Lagerung der Rohre in einer feuchten Umgebung die Rohre für mehrere Stunden in eine Gefriertrocknungsanlage vor dem wiegen sie. Manipulieren Sie die Rohre vorsichtig und nur mit puderfreien Handschuhen, jeglichen Kontakt zwischen dem Material und der Forscher Finger zu vermeiden. Halten Sie alle Inhaber und Zentrifugieren Sie sauber, um die Übertragung von Material an den Rohren zu vermeiden.
2. Probe 1 x 15 mL Kultur Suspension für 15 mL konische Rohr.
3. Zentrifugieren Sie die Kultur-Suspension in den 15 mL konische Röhrchen bei 4.000 X g bei Labor Temperatur 10 min. Gleichgewicht der Zentrifuge Rotor mit drei zusätzlichen 15 mL konische Röhrchen, jedes mit 15 mL Wasser. Verwerfen Sie nach Zentrifugation 12 mL des Überstands.
4. Aufschwemmen der Pellets im restlichen überstand und 3 x 1 mL des Gemisches auf drei 1,5 mL-Safe-Lock-Röhren mit einer Pipette übertragen. Für den Fall, dass einige Reste des Geschosses in der 15 mL konische Röhre bleiben, fügen Sie 1,5 mL entionisiertem Wasser zum konischem Rohr, Wirbel oder schütteln das Rohr auf die verbleibenden Aufschwemmen pellet und transfer 3 x 0,5 mL des Gemisches an den drei 1,5 mL-Safe-Lock-Rohren (bereits Containi hinzu 3 x 1 mL des Pellet-ng) mit einer Pipette.
   Hinweis: Aufteilung der Pellets über drei 1,5 mL-Safe-Lock-Rohre wird die Schätzung eines technischen Fehlers der Trockengewicht Messung ermöglichen.
5. Zentrifugieren Sie den Zellen in 1,5 mL-Safe-Lock-Röhren bei 15.000 X g bei Labor Temperatur 5 min. Balance des Zentrifuge Rotors mit einem zusätzlichen 1,5 mL Safe-Lock-Rohr, das enthält 1 mL Wasser. Verwerfen Sie nach der Zentrifugation die Überstände.
6. Legen Sie die Proben in den Gefrierschrank. Halten Sie für die langfristige Lagerung die Proben bei-80 ° C; für die kurzfristige Speicherung ist-20 ° C ausreichend.
7. Gefriertrocknen Sie die Proben über Nacht. Für einen richtigen Gefriertrocknung Prozess halten die Temperatur der Freeze Trockner Kondensator unter-90 ° C und der Druck in der Freeze-Trockner Kammer ca. 1 hPa.
8. Schließen Sie nach Gefriertrocknung die Rohre und Analysenwaagen belasten Sie Proben.
   Hinweis: Der Trockengewicht Wert kann für die Normalisierung des Phycobiliprotein Inhalts pro Zelle Trockengewicht verwendet werden.

Ergebnisse

Für die erste Methode Tests Synechocystis wurde angebaut als Batch-Kulturen im Erlenmeyerkolben auf einen Shaker in BG11 Anbau mittleren²⁰ (ergänzt mit 17 mM HEPES) bei 25 ° C, unter ein warmweißes Licht mit einer Intensität von 50 µmol (Photonen) / (m ²·s) und mit 1 % CO₂ in der Kultivierung Atmosphäre. Während des Anbaus der Kulturen wurden zu Safe-Lock Tubes abgetastet und zentrifugiert (15.000 X g bei Labor Tempe...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, schnelle und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der Phycobiliprotein Inhalt in das Modell cyanobakteriums Synechocystis. Verschiedene Methoden der Zelle Homogenisierung, Proteingewinnung und Phycocyanin und Allophycocyanin Quantifizierung werden verglichen und das endgültige Protokoll stellt eine Kombination der optimalen Schritte jedes einzelnen Verfahrens. Als repräsentative Daten wurde der Inhalt des Phycobiliproteins in Synechocystis Zellen unter...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synechocystis sp. PCC 6803	Institut Pasteur, Paris, France	6803	Cyanobacterium strain
Roti-CELL PBS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	9143.1	Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes	Eppendorf, Hamburk, Germany	30120086	Safe-lock tubes 1.5 ml
VWR 80-Place Storage System	VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA	30128-282	Holder for safe-lock tubes
RAININ 100 µl -1000 µl	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	17014382	Pipette
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	30389272	Pipette tips
Rotina 420R	Hettich, Kirchlengern, Germany	4701	Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes
LCexv 4010	Liebherr, Bulle, Switzerland	9005382197172	Refrigerator and freezer -20 °C
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	EXF24086V	Freezer -80 °C
CoolSafe	LaboGene, Lillerød, Denmark	7.001.000.615	Freeze dryer
UV-2600	Shimadzu, Kyoto, Japan	UV-2600	Spectrophotometer
Hellma absorption cuvettes, semi Micro	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z600288	VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm
Silamat S6	Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein	602286WU	Homogenizer
Solid-glass beads	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z273627	Glass bead of the diameter 2 mm
CPA225D-0CE	Sartorius AG, Göttingen, Germany	SECURA225D-1OBR	Analytical balances
C-Phycocyanin from Spirulina sp.	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P2172	Phycocyanin standard
Allophycocyanin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7472	Allophycocyanin standard
Bicinchoninic Acid Kit	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	BCA1, B9643	Complete kit for total proteins determination
AlgaeTron	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	AG 130-ECO	Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere
Photobioreactor	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	FMT-150	Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment
Cellometer	Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA	Auto M10	Cell counter
Corning 15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS430791	15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling
Herasafe KS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	51024579	Laminar flow hood