Determinazione spettrofotometrica del contenuto di Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per determinare quantitativamente il contenuto di phycobiliprotein nel cianobatterio Synechocystis utilizzando un metodo spettrofotometrico. La procedura di estrazione è stata applicata con successo anche ad altri ceppi di alghe e cianobatteri; Tuttavia, a causa delle variazioni negli spettri di assorbimento del pigmento, è necessario testare individualmente le equazioni spettrofotometriche per ogni ceppo.

Abstract

Si tratta di un semplice protocollo per la determinazione quantitativa del contenuto di phycobiliprotein nel cianobatterio modello Synechocystis. Ficobiliproteine sono i componenti più importanti di ficobilisomi, le antenne di luce-raccolta principali nei cianobatteri e diversi taxa di alghe. I ficobilisomi di Synechocystis contengono due ficobiliproteine: ficocianina e allophycocyanin. Questo protocollo descrive una semplice, efficiente e un metodo affidabile per la determinazione quantitativa di ficocianina e allophycocyanin in questo cianobatterio modello. Abbiamo confrontato i diversi metodi di phycobiliprotein estrazione e quantificazione spettrofotometrica. La procedura di estrazione come descritto in questo protocollo è stata applicata con successo anche ad altri ceppi di cianobatteri come Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., e Nostoc SP., anche per quanto riguarda le alghe rosse Porphyridium cruentum. Tuttavia, i coefficienti di estinzione di specifici ficobiliproteine da vari taxa possono differire e pertanto, si raccomanda di convalidare il metodo di quantificazione spettrofotometrica per ogni singolo ceppo individualmente. Il protocollo richiede poco tempo e può essere eseguito in qualsiasi laboratorio di scienze biologiche standard poiché si richiede attrezzature solo standard.

Introduzione

fPhycobiliproteins sono complessi pigmento-proteina solubile in acqua che rappresentano i componenti principali delle antenne di luce-raccoglitrici in cellule procariotiche cianobatteri (Cyanophyta) e diversi taxa eucariotiche (Glaucophyta, Rhodophyta e Criptofite)¹. Si presentano principalmente come complessi sopramolecolari chiamati ficobilisomi e sono in genere collegati alla superficie delle membrane fotosintetiche sul lato stromale, ad eccezione di Cryptophyta, dove sono localizzate le ficobiliproteine nella thylakoid lumen². Sono stati identificati quattro tipi di ficobiliproteine fino a Data: allophycocyanin il nucleo e la periferica di ficocianina e ficoeritrina phycoerythrocyanin¹. Come i complessi di raccolta di luce principali, ficobilisomi rappresentano uno dei fattori cruciali di produttività di massa colture di alghe e cianobatteri. È stato dimostrato che il troncamento ficobilisomi può migliorare accumulo di biomassa sotto forte luce³. D'altra parte, sotto modesto o basso irraggiamento, il troncamento dell'antenna ha provocato i tassi di crescita e biomassa accumulo riduzione^3,4. Ficobiliproteine commercialmente sono utilizzati come coloranti per alimenti, prodotti farmaceutici e additivi alimentari, nell'industria cosmetica e come fluorescenza sonde con applicazioni in citometria a flusso, immunodosaggi fluorescente e di microscopia di fluorescenza⁵.

Questo protocollo è centrato sulla determinazione quantitativa di ficobiliproteine nel cianobatterio modello Synechocystis. I cianobatteri sono più presto autotrofi fotosintetici ossigenati; Essi hanno stato formando la biosfera terrestre per più di 2,4 miliardi di anni⁶. Giocano un ruolo cruciale nei cicli biogeochimici globali di azoto, carbonio, ossigeno e altri elementi. Tra i cianobatteri, un ceppo unicellulare Synechocystis guadagnato una posizione unica, poiché era il primo cianobatterio con l'intero genoma sequenziato^7,8, è naturalmente trasformabile da DNA esogeno⁹, e esegue una crescita stabile e relativamente veloce^10,11. In Synechocystis, il componente principale dell'antenna, allophycocyanin, è associato con le proteine integrali di membrana e la ficocianina annesso si trova alla periferia di membrana tilacoidale.

Diversi metodi per phycobiliprotein estrazione e quantificazione sono confrontati all'interno di questo protocollo. La procedura di estrazione finale è stata applicata con successo a Synechocystis, nonché ad altri ceppi di cianobatteri, tra cui Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP.e di Nostoc SP. ed è stato applicato con successo anche alghe rosse Porphyridium cruentum. Pertanto, il metodo sviluppato in questo protocollo può essere considerato come un metodo universale per estrazione phycobiliprotein. Anche se alcuni dei metodi di estrazione testata ha provocato i rendimenti più elevati di proteina totale, qui descritta procedura di estrazione purché il phycobiliprotein più alto produce insieme con il più basso contenuto di clorofilla un residuo nella Estratto di Phycobiliprotein. Riduzione del contenuto di clorofilla un era essenziale per la corretta ficocianina e quantificazione spettrofotometrica allophycocyanin.

Gli spettri di assorbimento di phycobiliprotein può variare significativamente tra varie alghe e cianobatteri specie^{12,13,14,15,16,17} e anche tra i diversi ceppi di un genere di cianobatteri singolo¹⁸. Pertanto, le lunghezze d'onda specifiche e coefficienti di assorbimento come usato per la determinazione della ficocianina e allophycocyanin in Synechocystis non sono generalmente applicabili ad altri ceppi. Inoltre, Synechocystis non contiene ficoeritrina e phycoerythrocyanin che può essere trovato in alcune altre alghe e cianobatteri. Ai fini della determinazione di ficobiliproteine in ceppi diversi da Synechocystis, si raccomanda di valutare singolarmente le equazioni spettrofotometriche per ogni ceppo.

Sebbene il protocollo contiene due passi più lunghi (una notte liofilizzazione del pellet cellulare ed estrazione della proteina 1 ora), il tempo di lavoro totale per la quantificazione di ficobiliproteine è non più di 2 ore.

Protocollo

1. i cianobatteri coltivazione

1. Coltivare cellule Synechocystis in matracci di Erlenmeyer o in fotobioreattori^10,19 a tamponato BG11 medio²⁰ per mantenere un pH di < 10 (ad esempio, utilizzando 17 mM HEPES¹⁰).
   Nota: Condizioni di coltivazione Standard richiedono una temperatura controllata (30 ° C, la temperatura ottimale è in genere, 35 ° C)²¹, illuminazione (in genere, una luce bianca di intensità fino a 800 µmol [fotoni] / [m²p])²¹e un CO alimentazione ₂ (in fotobioreattore di piatto di 400 mL, la crescita saturando la concentrazione di CO₂ è 1.700 ppm)²¹.
2. Per determinare la densità di cultura, misurare la densità ottica di cultura spettrofotometricamente a 730 nm (OD₇₃₀) utilizzando una cuvetta con un percorso ottico di 1 cm. in alternativa, contare le cellule al microscopio usando un emocitometro o una cella automatizzata contatore.

2. preparazione di campioni

1. Lavorare sotto basso irraggiamento per prevenire il degrado phycobiliprotein.
2. Vendemmia: 3 x 1 mL di sospensione di cultura ai tubi di sicurezza bloccaggio. Utilizzare triplici copie per la stima di errori tecnici nella misurazione. Per eseguire il campionamento di cultura in condizioni sterili, raccogliere le cellule in una cappa laminare e seguire le pratiche di lavoro e di sicurezza adeguate.
3. Centrifugare le cellule a 15.000 x g a temperatura di laboratorio per 5 min, prestare attenzione al rotore della centrifuga correttamente bilanciata. Dopo la centrifugazione, eliminare i sovranatante. Essere sicuri di non disturbare il pellet.
4. Mettere i campioni in un congelatore. Per l'archiviazione a lungo termine, conservare i campioni a-80 ° C. Ciò è necessario per evitare la degradazione di phycobiliprotein. Per lo stoccaggio a breve termine, da-20 ° C è sufficiente.
5. Liofilizzare i campioni durante la notte. Per un corretto processo di liofilizzazione, mantenere la temperatura del condensatore liofilizzatore sotto-60 ° C e la pressione nella camera di liofilizzatore intorno 1 hPa.
6. Dopo aver terminato il ciclo di liofilizzazione, chiudere il tubo appena possibile per impedire il riassorbimento di acqua dall'aria.

3. cellula omogeneizzazione e pigmenti di estrazione

1. Aggiungere quattro pezzi di perle di vetro (con un diametro di 2 mm) per ogni provetta e chiudere i tubi.
   Nota: Quando il coperchio del tubo sicuro-blocco utilizzato per omogeneizzazione è troppo sottile, si può rompere durante l'omogeneizzazione; di conseguenza, solo il sicuro-blocco tubi con coperchi forte sono raccomandati per questo protocollo.
2. Omogeneizzare i campioni con i branelli di vetro per 15 s su un omogeneizzatore a temperatura di laboratorio.
   Nota: Un campione correttamente omogeneizzato si sviluppa sulla superficie interna di tutto dei tubi sicuro-blocco.
3. Aggiungere 1 mL di tampone PBS (pH 7,4), preraffreddata a 4 ° C, per i campioni al fine di estrarre ficobiliproteine.
   Nota: Da questo punto, mantenere i campioni sul ghiaccio per prevenire la degradazione delle proteine estratte. Questo è fondamentale.
4. Mescolare i campioni con PBS per 5 s sull'omogeneizzatore a temperatura di laboratorio.
   Nota: Dopo la miscelazione, i campioni sono verdastri.
5. Dopo la miscelazione, mantenere i campioni su ghiaccio per 60 min. copertura del bagno di ghiaccio con un coperchio per evitare il degrado di pigmenti.
6. Dopo 60 min di phycobiliprotein estrazione, centrifugare i campioni a 15.000 x g a 4 ° C per 5 min, prestare attenzione a bilanciare correttamente il rotore della centrifuga.
   Nota: Dopo la centrifugazione, il sovranatante ha un colore blu ciano.

4. Phycobiliprotein quantificazione

1. Prima della misurazione spettrofotometrica, calibrare lo spettrofotometro alla linea di base utilizzando il tampone PBS come uno spazio vuoto.
2. Una volta lo spettrofotometro è calibrato, scartare il PBS da una cuvette spettrofotometro e pipettare il surnatante con estratti ficobiliproteine anziché con il buffer scartato.
3. Quantificare la concentrazione di phycobiliprotein spettrofotometricamente, utilizzando una larghezza di fessura di 0,5 nm.
   1. Misurare l'assorbanza di phycocyanobilins in ficocianina e allophycocyanin contro il tampone PBS in bianco a 615 nm (un₆₁₅) e 652 nm (un₆₅₂), rispettivamente, e misurare l'assorbanza di detriti cellulari a 720 nm (un₇₂₀).
   2. Calcolare la concentrazione di ficocianina e allophycocyanin secondo le equazioni (1) e (2) di Bennett e Bogorad¹²:
      
      
      Nota: Un₆₁₅, un₆₅₂e un₇₂₀ dovrebbe adattarsi alla gamma lineare assorbanza dello spettrofotometro. Se necessario, diluire il campione con il tampone PBS.
4. Ricalcolare la concentrazione di pigmento nei campioni originali. La concentrazione di pigmento nel campione corrisponde direttamente con i risultati delle equazioni (1) e (2) quando 1 mL di coltura e 1 mL di tampone di estrazione vengono utilizzati per l'analisi. In caso di utilizzo di diversi volumi di campioni di cianobatteri e/o tampone PBS, la concentrazione di pigmento finale deve essere calcolata secondo l'equazione (3):
   (3)
   Nota: In caso di un contenuto di phycobiliprotein normalizzante per peso a secco delle cellule, la concentrazione di pigmento finale dovrebbe essere calcolata secondo equazione (4) (4)

5. determinazione del peso secco cellulare (opzionale)

1. Pesano tre tubi vuoti di sicurezza bloccaggio su bilance analitiche.
   Attenzione: È fondamentale che i tubi di sicurezza bloccaggio siano asciutti. In caso di immagazzinare i tubi in un ambiente umido, asciugare i tubi per diverse ore in un essiccatore prima della pesatura loro congelamento. Manipolare le provette delicatamente e solo con i guanti senza polvere per evitare qualsiasi contatto tra il materiale e le dita del ricercatore. Tenere tutti i sostegni e centrifugare pulite per evitare il trasferimento di qualsiasi materiale per i tubi.
2. Esempio 1 x 15 mL di sospensione per provetta conica da 15 mL.
3. Centrifugare la sospensione di cultura nelle provette coniche da 15 mL a 4.000 x g a temperatura di laboratorio per 10 min. bilanciamento del rotore della centrifuga con tre ulteriori provette coniche da 15 mL, ciascuna contenente 15 mL di acqua. Dopo la centrifugazione, scartando 12 mL di surnatante.
4. Risospendere il pellet nel surnatante rimanente e trasferire 3 x 1 mL di miscela a tre tubi di sicurezza bloccaggio 1,5 mL con una pipetta. Nel caso in cui alcuni avanzi del pellet rimangono nel tubo conico da 15 mL, aggiungere 1,5 mL di acqua deionizzata al tubo conico, vortice o agitare il tubo per risospendere il restante a pellet e trasferire i tre tubi di sicurezza bloccaggio di 1,5 mL (già containi 3 x 0,5 mL della miscela ng 3 x 1 mL del pellet) con una pipetta.
   Nota: Dividendo il pellet sopra tre tubi di sicurezza bloccaggio 1,5 mL consentirà la stima di qualsiasi errore tecnico di misura il peso a secco.
5. Centrifugare le cellule in 1,5 mL sicuro-blocco tubi a 15.000 x g a temperatura di laboratorio per 5 min, equilibrio del rotore della centrifuga con un tubo di sicurezza bloccaggio 1,5 mL aggiuntivo contenente 1 mL di acqua. Dopo la centrifugazione, eliminare i sovranatante.
6. Mettere i campioni nel congelatore. Per l'archiviazione a lungo termine, conservare i campioni a-80 ° C; per la memorizzazione a breve termine, da-20 ° C è sufficiente.
7. Liofilizzare i campioni durante la notte. Per un corretto processo di liofilizzazione, mantenere la temperatura del condensatore asciugatrice congelamento sotto-90 ° C e la pressione nella camera di liofilizzatore intorno 1 hPa.
8. Dopo liofilizzazione, chiudere le provette e pesare i campioni su bilance analitiche.
   Nota: Il valore di peso a secco può essere utilizzato per la normalizzazione del contenuto phycobiliprotein al peso a secco delle cellule.

Risultati

Per i test di metodo iniziale, Synechocystis era coltivata come batch colture in matracci di Erlenmeyer su un agitatore BG11 coltivazione medio²⁰ (completati con 17 mM HEPES) a 25 ° C, sotto una luce bianca calda di un'intensità di 50 µmol (fotoni) / (m p ²) e con 1% di CO₂ nell'atmosfera coltura. Durante la coltivazione, le culture sono state campionate a sicuro-blocco tubi e centrifugati (15.000 x g a temperatura di labo...

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo semplice, veloce e riproducibile per la quantificazione del contenuto di phycobiliprotein nel cianobatterio modello Synechocystis. Diversi metodi di omogeneizzazione delle cellule, estrazione di proteine e quantificazione di ficocianina e allophycocyanin vengono confrontati e protocollo finale rappresenta una combinazione della procedura ottima di ogni singola procedura. Come dati rappresentativi, il contenuto di ficobiliproteine è stato quantificato in Synechocystis

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synechocystis sp. PCC 6803	Institut Pasteur, Paris, France	6803	Cyanobacterium strain
Roti-CELL PBS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	9143.1	Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes	Eppendorf, Hamburk, Germany	30120086	Safe-lock tubes 1.5 ml
VWR 80-Place Storage System	VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA	30128-282	Holder for safe-lock tubes
RAININ 100 µl -1000 µl	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	17014382	Pipette
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	30389272	Pipette tips
Rotina 420R	Hettich, Kirchlengern, Germany	4701	Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes
LCexv 4010	Liebherr, Bulle, Switzerland	9005382197172	Refrigerator and freezer -20 °C
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	EXF24086V	Freezer -80 °C
CoolSafe	LaboGene, Lillerød, Denmark	7.001.000.615	Freeze dryer
UV-2600	Shimadzu, Kyoto, Japan	UV-2600	Spectrophotometer
Hellma absorption cuvettes, semi Micro	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z600288	VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm
Silamat S6	Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein	602286WU	Homogenizer
Solid-glass beads	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z273627	Glass bead of the diameter 2 mm
CPA225D-0CE	Sartorius AG, Göttingen, Germany	SECURA225D-1OBR	Analytical balances
C-Phycocyanin from Spirulina sp.	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P2172	Phycocyanin standard
Allophycocyanin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7472	Allophycocyanin standard
Bicinchoninic Acid Kit	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	BCA1, B9643	Complete kit for total proteins determination
AlgaeTron	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	AG 130-ECO	Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere
Photobioreactor	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	FMT-150	Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment
Cellometer	Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA	Auto M10	Cell counter
Corning 15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS430791	15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling
Herasafe KS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	51024579	Laminar flow hood