シアノ バクテリア阻害のフィコビリタンパク質の吸光光度定量

要約

ここでは、定量的阻害吸光光度法によるシアノ バクテリアのフィコビリタンパク質の内容を決定するためのプロトコルを提案する.抽出手順でした; 他のシアノ バクテリアや藻類の系統に適用も正常にただし、色素の吸収スペクトルの違いは、各緊張に吸光光度式を個別にテストする必要が。

要約

モデル シアノ バクテリア阻害フィコビリタンパク質含量の定量のための単純なプロトコルです。フィコビリタンパク質は、フィコビリソーム、シアノ バクテリアにおける主要集光性アンテナの最も重要なコンポーネントといくつかの藻類の分類群。阻害のフィコビリソームを含む 2 つのフィコビリタンパク質: フィコシアニン、アロフィコシアニン。このプロトコルでは、シンプルで効率的とフィコシアニン、アロフィコシアニンこのモデル シアノ バクテリアでの定量のための信頼性の高い方法をについて説明します。フィコビリタンパク質抽出吸光光度定量のいくつかの方法を比較しました。このプロトコルに従って抽出プロシージャもに応用したArthrospira sp.、 Cyanothece 、 Synechococcuselongatusの spスピルリナsp.など他のシアノ バクテリアの系統藍藻sp 紅藻チノリモに関して。様々 な分類から特定のフィコビリタンパク質の消散係数が異なることができ、それは、したがって、すべての単一のひずみの吸光光度定量法を個別に検証にオススメします。プロトコルは、少し時間が必要です、のみ標準装備が必要なので、任意の標準的な生命科学の研究所で実行できます。

概要

fPhycobiliproteins は原核生物のシアノ バクテリア (ラン藻) 光捕集アンテナといくつかの真核生物分類群 (Glaucophyta、紅藻の主要コンポーネントを表す水溶性色素蛋白複合体、およびCryptophyta)¹。超分子複合体フィコビリソームを呼ばれてとして主に発生して、彼らは通常間質側Cryptophytaで、フィコビリタンパク質をローカライズする場所を除いて光合成膜の表面に接続されて、チラコイド ルーメン²。日までフィコビリタンパク質の 4 つのタイプが識別されている: コア アロフィコシアニンと末梢フィコシアニン、フィコエ リスリンと phycoerythrocyanin¹。主要集光性複合体としてフィコビリソームは藻類やシアノ バクテリアの大量文化生産性の重要な要因の 1 つを表します。フィコビリソーム切り捨ては強い光³の下でバイオマス蓄積を高めることができることが実証されています。一方、中程度あるいは低照度下でアンテナ切り捨ては成長率とバイオマス蓄積低減^3,4で起因しました。フィコビリタンパク質、食品添加物、化粧品業界、医薬品、食品の着色剤と蛍光として商業栽培されているプローブをフローサイトメトリー、蛍光イムノアッセイ蛍光顕微鏡⁵のアプリケーション。

このプロトコルは、モデル シアノ バクテリア阻害のフィコビリタンパク質の定量分析に焦点を当てください。シアノ バクテリアが、最も早く酸素光合成独立栄養;彼らは 24 億年⁶以上の地球の生物圏を形成しました。彼らは、窒素、炭素、酸素、およびその他の要素のグローバル物質循環に重要な役割を果たします。シアノ バクテリアの間で単細胞ひずみ阻害全体のゲノムを持つ最初のシアノ バクテリアだったのでユニークなポジションを得たシーケンス^7、8、外因性 DNA⁹、当然のことながら変形、安定的かつ比較的高速な成長^10,11を実行します。阻害アンテナのコアコンポーネントにアロフィコシアニン、不可欠な膜タンパク質に関連付けられてし、添付のフィコシアニンはチラコイド膜周辺に位置します。

フィコビリタンパク質抽出と定量化のためのいくつかのメソッドは、このプロトコルで比較されます。Cyanothece sp Synechococcuselongatus、スピルリナsp.、 Arthrospiraを含む他のシアノ バクテリアの系統だけでなく阻害、最終的な抽出プロシージャが正常に適用されましたsp.と藍藻の sp は、紅藻チノリモにも正常に適用されました。したがって、このプロトコルで提案する手法は、フィコビリタンパク質抽出のための普遍的な方法として考えることが。ここに抽出手順が説明されている最高のフィコビリタンパク質利回りクロロフィルの残渣の最も低いコンテンツと共に提供されるにもかかわらず、いくつかのテストの抽出方法は、総蛋白収量の結果、フィコビリタンパク質を抽出します。クロロフィルの内容を減らすことは、正しいフィコシアニン、アロフィコシアニン吸光光度定量のために不可欠だった。

フィコビリタンパク質吸収スペクトルが様々 な藻類やシアノ バクテリア種^{12,13,14,15,16,17}の間で大きく異なるし、も単一のシアノ バクテリア属¹⁸系統。したがって、特定の波長と吸収係数としてフィコシアニン、アロフィコシアニン阻害での定量は一般的に他の系統に適用されません。また、フィコエ リスリンと他の藻類とシアノ バクテリアで見つけることができる phycoerythrocyanin、阻害は含まれません。阻害以外の系統のフィコビリタンパク質の定量を目的として、各緊張に吸光光度式を個別に評価することをお勧めします。

プロトコルには (細胞ペレットおよび 1 時間蛋白質の抽出の一晩凍結乾燥) 長いの 2 つの手順が含まれています、フィコビリタンパク質定量化のための総労働時間は 2 時間以内。

プロトコル

1 シアノ バクテリア栽培

1. エルレンマイヤー フラスコまたは < 10 (例えば、17 mM HEPES¹⁰を使用して) の pH を維持するためにバッファーに格納された BG11 の中²⁰フォトバイオリアクター^10,19 阻害細胞を養います。
   注: 標準的な栽培条件温度制御を必要とする (通常は、30 ° C、最適温度は 35 ° C)²¹照明 (800 µmol [光] 最大強度の通常、白色光/[m²·s])²¹、および CO₂供給 (400 mL フラット パネル フォトバイオリアクターの CO₂濃度を飽和成長は 1,700 ppm)²¹。
2. 文化の密度を決定する 730 でオンカラム文化の光学密度を測定 nm (外径₇₃₀) を用いたキュベット光路 1 cm. の代わりに、診断または自動化されたセルを用いた顕微鏡下のセルをカウントカウンター。

2. サンプル準備

1. フィコビリタンパク質の劣化を防ぐために低照度下で働きます。
2. 安全ロック チューブに文化を懸濁液の 3 x 1 mL を収穫します。トリプリケート測定の技術的な間違いの推定のために使用します。無菌条件下で文化サンプリングを実行するには、層流フードのセルを収穫し、適切な作業と安全性のプラクティスに従ってください。
3. 15,000 × g 5 分正しくバランスのとれた遠心ローターに注意を払うの温研究室で細胞を遠心します。遠心分離後、上清を破棄します。ペレットを邪魔しないようにします。
4. サンプルを冷凍庫に入れてください。長期保存を-80 ° C でサンプルをしてください。これはフィコビリタンパク質の劣化を防ぐために必要です。短期的なストレージ、-20 ° C で十分です。
5. サンプルを一晩凍結乾燥します。適切な凍結乾燥プロセスの凍結乾燥機コンデンサー-60 ° C 以下の温度を保ち、凍結乾燥機の圧力チャンバー周り 1 hPa。
6. 凍結乾燥のサイクルを終えた後、空気中の水分の再吸収を防ぐために、できるだけ早くチューブを閉じます。

3. セルの均質化と抽出を顔料

1. 各サンプル管にガラス ビーズ (直径 2 mm) を 4 枚を追加し、チューブを閉じます。
   注: 均質化用安全ロック チューブのふたが薄すぎる、それ間破るができる均質化;したがって、このプロトコルの強い蓋安全ロック チューブのみお勧めします。
2. サンプルは 15 のガラスビーズを均質化研究所温ホモジナイザーで s。
   注: 正しく均質化されたサンプルは、安全ロック チューブの全体の内側の表面に広がっています。
3. 1 mL の PBS バッファー (pH 7.4) のフィコビリタンパク質を抽出するためにサンプルへの 4 ° C に冷却を追加します。
   注: このステップから抽出したタンパク質の劣化を防ぐために氷のサンプルを保持します。これは重要です。
4. 5 サンプルを PBS でミックス研究所温ホモジナイザーで s。
   注: 混合した後、サンプルは緑がかったです。
5. 混合した後、顔料の劣化を防ぐためにふた付きの氷浴 60 分カバーのための氷のサンプルを保ちます。
6. フィコビリタンパク質抽出の 60 分後 15,000 × gで 5 分遠心ローターのバランスをとるために注意を払うのための 4 ° C でサンプルを遠心します。
   注: 遠心分離後上澄みシアン ブルーの色をが。

4. フィコビリタンパク質の定量

1. 吸光光度測定の前に空白として PBS バッファーを使用して基準に分光光度計を調整します。
2. 分光光度計を校正すると、いったん 1 つの分光光度計のキュベットから PBS を破棄し、破棄されたバッファーの代わりに抽出されたフィコピリン蛋白質の上澄みをピペットします。
3. オンカラム、スリット幅は 0.5 を使用してフィコビリタンパク質濃度を定量化 nm。
   1. フィコシアニン、アロフィコシアニン 615 で空白の PBS バッファーに対して phycocyanobilins の吸光度を測定 nm (₆₁₅) と 652 nm (₆₅₂)、それぞれ、720 で細胞の残骸の吸光度を測定して nm (₇₂₀)。
   2. (1) と (2) のベネットと Bogorad¹²フィコシアニン、アロフィコシアニン方程式に従っての濃度を計算します。
      
      
      注:₆₁₅,₆₅₂, と₇₂₀は、分光光度計の吸光度の線形範囲に収まるようにします。必要に応じて、PBS バッファーでサンプルを希釈します。
4. 元のサンプル中の顔料濃度を再計算します。サンプル中の顔料濃度は式 (1) と (2) 文化の 1 mL と 1 mL 抽出バッファーの使用分析の結果と直接対応しています。シアノ バクテリアのサンプルや PBS バッファーの別のボリュームを使用する場合最終的な顔料濃度は式 (3) に従って計算する必要があります。
   (3)
   注: セルの乾燥重量あたりの正規化フィコビリタンパク質コンテンツの場合最終的な顔料濃度計算するか式 (4) によると(4)

5. (オプション) 細胞の乾燥重量の測定

1. 分析的なバランスの 3 つの空の安全ロック チューブの重量を量る。
   注意: 安全なロック チューブ乾燥していることが重要です。チューブを湿潤環境に格納する場合それらを計量する前に乾燥機の凍結で数時間チューブを乾燥します。チューブを優しく操作と材料と研究者の指の間の接触を避けるために手袋をはめた手のパウダー フリーのみ。すべての者を維持し、クリーン チューブへの任意の材料の転送を避けるために遠心分離機します。
2. 15 mL の円錐管に文化を懸濁液の 1 x 15 mL のサンプルです。
3. 文化のサスペンション 3 追加 15 mL コニカル チューブ、4,000 x gで 10 分間遠心ローターのバランス研究所温で 15 mL の円錐管の水含む各 15 mL を遠心します。遠心分離の後上澄みの 12 mL を破棄します。
4. 残りの上清でペレットを再懸濁し、混合物の 3 x 1 mL をピペットで 3 つの 1.5 mL 安全ロック チューブに転送します。ペレットのいくつかの残り物は、15 mL の円錐管に残る場合に円錐管、渦または横に振る残り再懸濁しますチューブ、ペレットし、3 1.5 mL 安全ロック チューブ (すでに containi の混合物の 3 x 0.5 mL に転送する 1.5 mL の脱イオン水を追加します。ng ペレットの 3 x 1 mL) ピペットと。
   注: 3 1.5 mL 安全ロック チューブでペレットを分割乾燥重量測定の技術的なエラーの推定できるようになります。
5. 1 mL の水を含むその他の 1.5 mL 安全ロック チューブを遠心ローター 5 分バランス研究所温 15,000 × gで 1.5 mL 安全ロック チューブに細胞を遠心分離機します。、遠心分離後、上清を破棄します。
6. 冷凍庫の中にサンプルを置きます。長期保存のためサンプルを保つ-80 ° c;短期保存、-20 ° C で十分です。
7. サンプルを一晩凍結乾燥します。適切な凍結乾燥プロセスの凍結乾燥機コンデンサー-90 ° C 以下の温度を保ち、凍結乾燥機の圧力チャンバー周り 1 hPa。
8. 凍結乾燥後、管を閉じて、分析的なバランスのサンプルの重量を量る。
   注: 細胞の乾燥重量あたりのフィコビリタンパク質コンテンツ正規化の乾物重の値を使用できます。

結果

BG11 栽培中²⁰ (17 mM HEPES を補充) 25 ° c、50 µmol (光子) の強さの暖かい白色光の下で阻害されたシェーカーのエルレンマイヤー フラスコで培養として栽培初期メソッドのテスト/(m²·s) と養殖の雰囲気の中で 1% CO₂ 。、栽培期間中文化安全ロック チューブにサンプリングされた (15,000 x gで 5 分間実験室の温度) を遠心、上清が...

ディスカッション

このプロトコルでは、単純な高速で、再現性のあるモデル シアノ バクテリア阻害フィコビリタンパク質含量の定量法について説明します。セルの均質化、蛋白質の抽出、フィコシアニン、アロフィコシアニン定量化のいくつかの方法が比較され、最終的なプロトコルは、すべて単一の最適な手順の組み合わせを表します。代表的なデータとして光強度の増加の下で阻害細胞の?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synechocystis sp. PCC 6803	Institut Pasteur, Paris, France	6803	Cyanobacterium strain
Roti-CELL PBS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	9143.1	Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes	Eppendorf, Hamburk, Germany	30120086	Safe-lock tubes 1.5 ml
VWR 80-Place Storage System	VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA	30128-282	Holder for safe-lock tubes
RAININ 100 µl -1000 µl	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	17014382	Pipette
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	30389272	Pipette tips
Rotina 420R	Hettich, Kirchlengern, Germany	4701	Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes
LCexv 4010	Liebherr, Bulle, Switzerland	9005382197172	Refrigerator and freezer -20 °C
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	EXF24086V	Freezer -80 °C
CoolSafe	LaboGene, Lillerød, Denmark	7.001.000.615	Freeze dryer
UV-2600	Shimadzu, Kyoto, Japan	UV-2600	Spectrophotometer
Hellma absorption cuvettes, semi Micro	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z600288	VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm
Silamat S6	Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein	602286WU	Homogenizer
Solid-glass beads	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z273627	Glass bead of the diameter 2 mm
CPA225D-0CE	Sartorius AG, Göttingen, Germany	SECURA225D-1OBR	Analytical balances
C-Phycocyanin from Spirulina sp.	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P2172	Phycocyanin standard
Allophycocyanin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7472	Allophycocyanin standard
Bicinchoninic Acid Kit	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	BCA1, B9643	Complete kit for total proteins determination
AlgaeTron	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	AG 130-ECO	Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere
Photobioreactor	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	FMT-150	Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment
Cellometer	Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA	Auto M10	Cell counter
Corning 15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS430791	15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling
Herasafe KS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	51024579	Laminar flow hood