Dosage spectrophotométrique du Phycobiliprotein en cyanobactérie Synechocystis

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour déterminer quantitativement le contenu de phycobiliprotein dans la cyanobactérie Synechocystis en utilisant une méthode spectrophotométrique. La procédure d’extraction a été appliquée avec succès à d’autres souches de cyanobactéries et les algues ; Toutefois, en raison des variations dans les spectres d’absorption de pigment, il est nécessaire de tester les équations spectrophotométriques pour chaque souche individuellement.

Résumé

Il s’agit d’un protocole simple pour la détermination quantitative de la teneur en phycobiliprotein dans la cyanobactérie modèle Synechocystis. Phycobiliprotéines sont les éléments les plus importants des phycobilisomes, les antennes de lumière majeurs chez les cyanobactéries et plusieurs taxons d’algues. Les phycobilisomes de Synechocystis contiennent deux phycobiliprotéines : phycocyanine et allophycocyanin. Ce protocole décrit une simple, efficace et une méthode fiable pour la détermination quantitative de phycocyanine et allophycocyanin dans cette cyanobactérie modèle. Nous avons comparé plusieurs méthodes d’extraction de phycobiliprotein et de dosage spectrophotométrique. La procédure d’extraction tel que décrit dans le présent protocole a été appliquée avec succès à d’autres souches de cyanobactéries comme sp de Spirulina SP., Synechococcuselongatus, Cyanothece ., Arthrospira sp., et Nostoc SP., aussi bien quant à l’algue rouge Porphyridium cruentum. Cependant, les coefficients d’extinction des phycobiliprotéines spécifiques des différents taxons peuvent différer et il est donc recommandé de valider la méthode de dosage spectrophotométrique pour chaque souche unique individuellement. Le protocole exige peu de temps et peut être effectué dans un laboratoire de sciences de la vie standard car il nécessite des équipements standard uniquement.

Introduction

fPhycobiliproteins sont des complexes de pigment-protéine soluble dans l’eau qui représentent les principaux éléments des antennes chez les procaryotes cyanobactéries (cyanophytes) lumière et plusieurs taxons eucaryotes (Glaucophyta, Rhodophyta et Cryptophyta)¹. Ils se produisent principalement sous forme de complexes supramoléculaires appelés phycobilisomes et ils sont généralement attachés à la surface des membranes photosynthétiques côté stromal, à l’exception de Cryptophyta, où les phycobiliprotéines sont localisées dans le thylakoïde lumen². Quatre types de phycobiliprotéines ont été identifiées jusqu'à date : l’allophycocyanin de base et le périphérique de phycocyanine, phycoérythrine et phycoerythrocyanin¹. Les principaux complexes de lumière, phycobilisomes représentent un des facteurs essentiels de la productivité des cultures masse algues et cyanobactéries. Il a été démontré que cette troncature phycobilisomes peut améliorer l’accumulation de la biomasse sous forte lumière³. En revanche, éclairement faible ou modeste, la troncature de l’antenne a conduit à des taux de croissance et d’accumulation de biomasse réduction^3,4. Phycobiliprotéines sont commercialement utilisées comme colorants alimentaires, produits pharmaceutiques et les additifs alimentaires, dans l’industrie cosmétique et comme la fluorescence des sondes avec des applications en cytométrie en flux, fluorescents immuno-essais et microscopie de fluorescence⁵.

Ce protocole met l’accent sur la détermination quantitative des phycobiliprotéines dans la cyanobactérie modèle Synechocystis. Les cyanobactéries sont les premiers autotrophes photosynthétiques oxygénique ; ils ont été formant la biosphère de la terre depuis plus de 2,4 milliards d’années⁶. Ils jouent un rôle crucial dans les cycles biogéochimiques mondiaux d’azote, carbone, d’oxygène et d’autres éléments. Chez les cyanobactéries, une souche unicellulaire Synechocystis acquis une position unique puisqu’il s’agissait de la première cyanobactérie avec tout le génome séquencé^7,8, il est naturellement transformable par l’ADN exogène⁹, et Il réalise une croissance stable et relativement rapide,^10,11. Synechocystis, la composante de base antenne, allophycocyanin, est associée à des protéines membranaires intrinsèques, en la phycocyanine ci-joint est situé à la périphérie de membrane des thylakoïdes.

Plusieurs méthodes d’extraction de phycobiliprotein et de quantification sont comparées dans ce protocole. La procédure d’extraction finale a été appliquée avec succès aux Synechocystis, ainsi qu’à d’autres souches de cyanobactéries, y compris les sp de Spirulina SP., Synechococcuselongatus, Cyanothece ., Arthrospira SP.et Nostoc SP. et il a été également avec succès appliqués aux algues rouges Porphyridium cruentum. Donc, la méthode développée dans le présent protocole peut être considérée comme une méthode universelle pour l’extraction de phycobiliprotein. Même si certaines des méthodes éprouvées d’extraction a entraîné des rendements plus élevés de protéines totales, l’ici visées procédure d’extraction pourvu le phycobiliprotein plus haut rendements ainsi que la plus faible teneur d’un résidu de la chlorophylle dans la extrait de phycobiliprotein. Réduire la teneur en chlorophylle a a été essentielle à la phycocyanine correcte et allophycocyanin dosage spectrophotométrique.

Les spectres d’absorption de phycobiliprotein peut varier considérablement entre les différentes algues et cyanobactéries espèces^{12,13,14,15,16,17} et même parmi plusieurs souches d’un genre de cyanobactéries unique¹⁸. Par conséquent, les longueurs d’onde spécifiques et les coefficients d’absorption tel qu’utilisé pour la détermination de la phycocyanine et allophycocyanin dans Synechocystis ne sont pas généralement applicables à d’autres souches. En outre, Synechocystis ne contient pas de phycoérythrine et phycoerythrocyanin que l'on retrouve dans d’autres algues et cyanobactéries. Aux fins de la détermination des phycobiliprotéines chez les souches autres que Synechocystis, il est recommandé d’évaluer individuellement les équations spectrophotométriques pour chaque souche.

Même si le protocole contient deux étapes plus longues (du jour au lendemain la lyophilisation des granules cellulaires et extraction de protéine 1 heure), le temps de travail total pour la quantification des phycobiliprotéines n’excède pas 2 heures.

Protocole

1. culture de cyanobactéries

1. Cultiver des cellules Synechocystis en flacons Erlenmeyer ou photobioréacteurs^10,19 en tampon BG11 moyen²⁰ pour maintenir un pH de < 10 (par exemple, à l’aide de 17 mM HEPES¹⁰).
   Remarque : Les conditions de culture Standard nécessitent une température contrôlée (généralement, 30 ° C, la température optimale est de 35 ° C)²¹, l’éclairage (en règle générale, une lumière blanche d’une intensité jusqu'à 800 µmol [photons] / [m²·s])²¹et un CO alimentation en ₂ (dans le 400 mL plat photobioréacteur, la croissance saturant la concentration de CO₂ est de 1 700 ppm)²¹.
2. Pour déterminer la densité de la culture, mesurer la densité optique de culture par spectrophotométrie à 730 nm (OD₇₃₀), en utilisant une cuvette avec un trajet optique de 1 cm. par ailleurs, compter les cellules au microscope à l’aide d’un hémocytomètre ou une cellule automatisée compteur.

2. préparation des échantillons

1. Travailler sous faible éclairement à prévenir la dégradation de le phycobiliprotein.
2. Récolte 3 x 1 mL de suspension de la culture aux tubes de coffre-fort-serrure. Utilisez réanalysés pour l’estimation des erreurs techniques dans la mesure. Pour effectuer l’échantillonnage de la culture dans des conditions stériles, récolter les cellules dans une hotte laminaire et suivre les bonnes pratiques de travail et de sécurité.
3. Centrifuger les cellules à 15 000 x g à la température du laboratoire pendant 5 min. faites attention au rotor de la centrifugeuse correctement équilibré. Après centrifugation, jeter le surnageant. Veillez à ne pas déranger le culot.
4. Placer les échantillons dans un congélateur. Pour le stockage à long terme, conserver les échantillons à-80 ° C. Cela est nécessaire pour prévenir la dégradation de le phycobiliprotein. Pour le stockage à court terme,-20 ° C est suffisante.
5. Lyophiliser les échantillons du jour au lendemain. Pour un bon processus de lyophilisation, maintenir la température du condenseur lyophilisateur au-dessous de-60 ° C et la pression dans la chambre de lyophilisateur autour de 1 hPa.
6. Après avoir terminé le cycle de lyophilisation, fermer le tube dès que possible pour empêcher la réabsorption de l’eau de l’air.

3. cellule d’homogénéisation et d’Extraction des Pigments

1. Ajoutez quatre morceaux de perles de verre (avec un diamètre de 2 mm) dans chaque tube d’échantillon et fermer les tubes.
   Remarque : Lorsque le couvercle du coffre fort-serrure tube utilisé pour l’homogénéisation est trop mince, elle peut rompre pendant l’homogénéisation ; par conséquent, seulement des tubes de coffre-fort-serrure avec couvercles fortes sont recommandés pour ce protocole.
2. Homogénéiser les échantillons avec les perles de verre pour 15 s sur un homogénéisateur à température du laboratoire.
   Remarque : Un échantillon bien homogénéisé est réparti sur la surface entière interne des tubes safe-lock.
3. Ajouter 1 mL de tampon PBS (pH 7,4), refroidi à 4 ° C, pour les échantillons afin d’en dégager les phycobiliprotéines.
   Remarque : Cette étape sur, garder les échantillons sur la glace pour empêcher la dégradation des protéines extraites. Ceci est crucial.
4. Mélanger les échantillons avec du PBS pendant 5 s sur l’homogénéisateur à température du laboratoire.
   Remarque : Après avoir mélangé, les échantillons sont verdâtres.
5. Après avoir mélangé, conserver les échantillons sur la glace pour 60 min. de la couverture du bain de glace avec un couvercle à prévenir la dégradation des pigments.
6. Après 60 min d’extraction phycobiliprotein, centrifuger les échantillons à 15 000 x g à 4 ° C pendant 5 min. faites attention à bien équilibrer le rotor de la centrifugeuse.
   Remarque : Après la centrifugation, le surnageant a une couleur bleu cyan.

4. Quantification de le Phycobiliprotein

1. Avant la mesure spectrophotométrique, calibrer le spectrophotomètre à la ligne de base à l’aide de la mémoire tampon PBS comme blanc.
2. Une fois calibré le spectrophotomètre, jetez les PBS d’une cuvette de spectrophotomètre et Pipeter le surnageant avec extraits phycobiliprotéines plutôt qu’avec le tampon mis au rebut.
3. Quantifier la concentration phycobiliprotein par spectrophotométrie, en utilisant une largeur de fente de 0,5 nm.
   1. Mesurer l’absorbance de la phycocyanobilins en phycocyanine et allophycocyanin contre le tampon PBS vide à 615 nm (un₆₁₅) et 652 nm (une₆₅₂), respectivement, et mesurer l’absorbance des débris cellulaires à 720 nm (₇₂₀).
   2. Calculer la concentration de phycocyanine et allophycocyanin selon les équations (1) et (2) de Bennett et Bogorad¹²:
      
      
      Remarque : Un₆₁₅, une₆₅₂et une₇₂₀ doivent correspondre à la gamme linéaire absorbance du spectrophotomètre. Si nécessaire, diluer l’échantillon avec le tampon PBS.
4. Recalculer la concentration de pigment dans les échantillons originaux. La concentration de pigment dans l’échantillon correspond directement avec les résultats des équations (1) et (2) lorsque les 1 mL de culture et 1 mL de tampon d’extraction sont utilisés pour l’analyse. En cas d’utilisation de différents volumes d’échantillons de cyanobactéries et/ou tampon PBS, la concentration de pigment final devrait être calculée selon l’équation (3) :
   (3)
   Remarque : Dans le cas d’une teneur en phycobiliprotein normalisant par poids sec de cellule, la concentration de pigment final devrait être calculée selon l’équation (4) (4)

5. détermination de la masse sèche de cellulaire (facultative)

1. Peser trois tubes vides de coffre-fort-serrure sur balances analytiques.
   ATTENTION : Il est essentiel que les tubes de coffre-fort-serrure sont secs. En cas de stockage les tubes dans un environnement humide, sécher les tubes pendant plusieurs heures dans un séchoir avant la pesée de leur gel. Manipuler les tubes doucement et uniquement avec les mains gantées poudré pour éviter tout contact entre le matériel et les doigts du chercheur. Gardez tous les détenteurs et centrifuger propre afin d’éviter le transfert de matériel aux tubes.
2. 1 x 15 mL de suspension de la culture au tube conique de 15 mL de l’échantillon.
3. Centrifuger la suspension bactérienne dans les tubes coniques 15 mL à 4 000 x g à la température de laboratoire pendant 10 min. équilibre le rotor de la centrifugeuse avec trois autres tubes coniques 15 mL, chaque contenant 15 mL d’eau. Après centrifugation, éliminer 12 mL du surnageant.
4. Resuspendre le culot dans le surnageant restant et transfert 3 x 1 mL du mélange à trois tubes de coffre-fort-serrure de 1,5 mL avec une pipette. Dans le cas où certains restes de la pastille restent dans le tube conique de 15 mL, ajouter 1,5 mL d’eau désionisée au tube à fond conique, vortex ou secouer le tube pour remettre en suspension les autres pellets et transférer 3 x 0,5 mL du mélange dans les trois tubes de coffre-fort-serrure de 1,5 mL (déjà containi ng 3 x 1 mL de l’extrait concentré) avec une pipette.
   NOTE : Divisant le culot sur trois tubes de coffre-fort-serrure de 1,5 mL permettra l’estimation d’erreur technique de la mesure de poids sec.
5. Centrifuger les cellules dans des tubes de coffre-fort-serrure de 1,5 mL à 15 000 x g à la température du laboratoire pendant 5 min. équilibre le rotor de la centrifugeuse avec un tuyau additionnel de coffre-fort-serrure de 1,5 mL contenant 1 mL d’eau. Après la centrifugation, jeter le surnageant.
6. Placer les échantillons dans le congélateur. Pour le stockage à long terme, conserver les échantillons à-80 ° C ; pour le stockage à court terme,-20 ° C est suffisante.
7. Lyophiliser les échantillons du jour au lendemain. Pour un bon processus de lyophilisation, maintenir la température du condenseur sèche-linge gel au-dessous de-90 ° C et la pression dans la chambre de lyophilisateur autour de 1 hPa.
8. Après lyophilisation, fermer les tubes et peser les échantillons sur les balances analytiques.
   Remarque : La valeur de poids sec utilisable pour la normalisation de la teneur en phycobiliprotein par le poids sec de cellule.

Résultats

Pour les essais de la méthode initiale, Synechocystis a été cultivé comme cultures en batch en Erlenmeyers sur un agitateur BG11 culture moyenne²⁰ (additionné de 17 mM HEPES) à 25 ° C, sous une lumière blanche chaude d’une intensité de 50 µmol (photons) / (m ²·s) et avec 1 % de CO₂ dans l’atmosphère de culture. Au cours de la culture, les cultures ont été échantillonnés à tubes safe-lock et centrifugé (15 000 x <...

Discussion

Ce protocole décrit une méthode simple, rapide et reproductible pour la quantification de la teneur en phycobiliprotein dans la cyanobactérie modèle Synechocystis. Plusieurs méthodes d’homogénéisation de la cellule, d’extraction de protéine et quantification de phycocyanine et allophycocyanin sont comparés, et le protocole final représente une combinaison des mesures optimales de chaque procédure unique. Comme les données représentatives, le contenu des phycobiliprotéines a été quantifié dan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synechocystis sp. PCC 6803	Institut Pasteur, Paris, France	6803	Cyanobacterium strain
Roti-CELL PBS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	9143.1	Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes	Eppendorf, Hamburk, Germany	30120086	Safe-lock tubes 1.5 ml
VWR 80-Place Storage System	VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA	30128-282	Holder for safe-lock tubes
RAININ 100 µl -1000 µl	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	17014382	Pipette
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	30389272	Pipette tips
Rotina 420R	Hettich, Kirchlengern, Germany	4701	Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes
LCexv 4010	Liebherr, Bulle, Switzerland	9005382197172	Refrigerator and freezer -20 °C
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	EXF24086V	Freezer -80 °C
CoolSafe	LaboGene, Lillerød, Denmark	7.001.000.615	Freeze dryer
UV-2600	Shimadzu, Kyoto, Japan	UV-2600	Spectrophotometer
Hellma absorption cuvettes, semi Micro	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z600288	VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm
Silamat S6	Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein	602286WU	Homogenizer
Solid-glass beads	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z273627	Glass bead of the diameter 2 mm
CPA225D-0CE	Sartorius AG, Göttingen, Germany	SECURA225D-1OBR	Analytical balances
C-Phycocyanin from Spirulina sp.	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P2172	Phycocyanin standard
Allophycocyanin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7472	Allophycocyanin standard
Bicinchoninic Acid Kit	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	BCA1, B9643	Complete kit for total proteins determination
AlgaeTron	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	AG 130-ECO	Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere
Photobioreactor	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	FMT-150	Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment
Cellometer	Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA	Auto M10	Cell counter
Corning 15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS430791	15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling
Herasafe KS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	51024579	Laminar flow hood