Spectrophotometric Cyanobacterium Synechocystis 에서 Phycobiliprotein 콘텐츠 결정

요약

여기, 선물이 양적 phycobiliprotein cyanobacterium Synechocystis spectrophotometric 메서드를 사용 하 여에서 콘텐츠를 결정 하는 프로토콜. 추출 프로시저 또한 성공적으로 다른 박테리아 및 조류 긴장;에 적용 했다 그러나, 안료 흡수 스펙트럼에 있는 변이 때문 그것은 각 스트레인에 대 한 spectrophotometric 방정식을 개별적으로 테스트 하는 데 필요한입니다.

초록

이것은 모델 cyanobacterium Synechocystisphycobiliprotein 콘텐츠의 양적 결정에 대 한 간단한 프로토콜 이다. Phycobiliproteins 있습니다 phycobilisomes, 박테리아에서 주요 광 수확 안테나의 가장 중요 한 구성 요소와 여러 조류 taxa. Synechocystis 의 phycobilisomes 포함 두 phycobiliproteins: phycocyanin와 allophycocyanin. 이 프로토콜은 간단 하 고, 효율적인, phycocyanin와이 모델 cyanobacterium에서 allophycocyanin의 양적 결정에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 우리는 phycobiliprotein 추출 및 spectrophotometric 정량화의 몇 가지 메서드를 비교. 이 프로토콜에서 설명 된 대로 추출 절차는 Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., 같은 다른 박테리아 변종에도 성공적으로 적용 했다 그리고 Nostoc sp., 또한 레드 조류 Porphyridium cruentum로. 그러나, 다양 한 taxa에서 특정 phycobiliproteins의 소멸 계수 다를 수 있습니다 그리고 그것은, 따라서, 개별적으로 모든 단일 스트레인에 대 한 spectrophotometric 정량화 방법의 유효성을 검사 권장. 프로토콜은 시간이 좀 필요 하 고 그것만 표준 장비를 필요로 하기 때문에 모든 표준 생명 과학 실험실에서 수행할 수 있습니다.

서문

fPhycobiliproteins는 간결한 박테리아 (Cyanophyta)에서 광 수확 안테나와 여러 진 핵 taxa (Glaucophyta, Rhodophyta의 주요 구성 요소를 나타내는 수용 성 색소 단백질 복합물 , 및 Cryptophyta)¹. 그들은 phycobilisomes 라는 supramolecular 단지도 주로 발생 하 고 Cryptophyta, 어디는 phycobiliproteins 지역화는 제외한 stromal 측에 광합성 세포 막의 표면에 일반적으로 연결 되는 thylakoid 루멘². 네 가지 유형의 phycobiliproteins 날짜까지 확인 되었습니다: 코어 allophycocyanin 및 주변 phycocyanin, phycoerythrin, 및 phycoerythrocyanin¹. 주요 빛 수확 단지로 phycobilisomes 조류와 남조류의 대량 문화 생산성의 중요 한 요소 중 하나를 나타냅니다. 그것은 그 phycobilisomes 잘림 강한 빛³바이오 매스 축적을 향상 시킬 수 입증 되었습니다. 다른 한편으로, 겸손 또는 낮은 irradiance에서 안테나 잘림 결과 성장 속도 바이오 매스 축적 감소^3,4. Phycobiliproteins는 상업적으로 사용 식용 염료, 의약품, 그리고 화장품 산업, 식품 첨가물, 형광 프로브 cytometry, 형광 immunoassays 및 형광 현미경 검사 법⁵에서 응용 프로그램과 함께.

이 프로토콜 phycobiliproteins 모델 cyanobacterium Synechocystis에서 양적 결정에 초점을 맞추고. 남조류는는 초기 oxygenic 광합성 슬에; 그들은 2.4 십억 년⁶이상에 대 한 지구의 생물권을 형성 되었습니다. 그들은 질소, 탄소, 산소, 및 기타 요소의 세계 생물 지구 화학적 순환에 중요 한 역할을 한다. 박테리아, 중 단 세포 변형 Synechocystis 이후 전체 게놈으로 첫 번째 cyanobacterium 독특한 위치를 얻은 시퀀싱^7,8, 그것은 자연스럽 게 외 인 DNA⁹, 변환 및 그것은 안정적이 고 비교적 빠른 성장^10,11을 수행합니다. Synechocystis, 핵심 안테나 구성에서에서 allophycocyanin, 완전 한 막 단백질 연관 이며 연결 된 phycocyanin thylakoid 막 주변에 위치 하 고 있습니다.

이 프로토콜 내에서 phycobiliprotein 추출 및 정량화에 대 한 여러 가지 방법은 비교 합니다. Synechocystis, 뿐만 아니라 다른 박테리아 변종, Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira 를 포함 하 여 최종 추출 절차 성공적으로 적용 했다 빨강 조류 Porphyridium cruentumsp., 그리고 Nostoc sp., 그것은 또한 성공적으로 적용 했다. 따라서,이 프로토콜에 개발 하는 방법 phycobiliprotein 추출에 대 한 보편적인 방법으로 여겨질 수 있다. 높은 phycobiliprotein 엽록소에 잔류물의 낮은 콘텐츠 함께 수익률 제공 여기 추출 절차를 설명 된 테스트 추출 방법의 일부 높은 총 단백질 수율 결과, 비록는 phycobiliprotein 압축을 풉니다. 엽록소의 한 콘텐츠를 줄이는 올바른 phycocyanin와 allophycocyanin spectrophotometric 정량화에 대 한 필수적 이었다.

Phycobiliprotein 흡수 스펙트럼 다양 한 조류와 박테리아 종^{12,13,14,15,,1617} 크게 다를 수 있으며 심지어 중 단일 박테리아 속¹⁸의 여러 변종. 따라서, 특정 파장 및 흡수 계수 phycocyanin 및 Synechocystis 에 allophycocyanin에 사용 된 다른 계통에 일반적으로 적용 되지 않습니다. 또한, Synechocystis 는 phycoerythrin와 일부 다른 조류와 박테리아에서 찾을 수 있는 phycoerythrocyanin를 포함 하지 않습니다. Phycobiliproteins 긴장 Synechocystis이외에 결정을 위해 각 변형에 대 한 spectrophotometric 방정식을 개별적으로 평가 하는 것이 좋습니다.

프로토콜 포함 2 개의 더 단계 (하룻밤 셀룰러 펠 릿 및 1 시간 단백질 추출의 동결), 비록 phycobiliproteins 정량화에 대 한 총 노동 시간 보다 2 시간 이상 이다.

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프로토콜

1. 남조류 재배

1. Synechocystis 셀 삼각 플라스 크 또는 photobioreactors^10,19 (예를 들어, 17 mM HEPES¹⁰를 사용 하 여) < 10의 pH를 유지 하기 위해 버퍼 BG11 중간²⁰ 에서 육성.
   참고: 표준 재배 조건 필요 제어 온도 (일반적으로 30 ℃, 최적 온도 35 ° C)²¹, 조명 (800 µmol [광양] 최대 강도의 일반적으로, 하얀 빛 / [m²·s])²¹, 그리고 CO ₂ 공급 (400 mL 평면 패널 photobioreactor CO₂ 농도 포화 성장 1700 ppm 이다)²¹.
2. 문화의 밀도 확인 하려면 spectrophotometrically 730에서 문화 광 밀도 측정 nm (OD₇₃₀) 또는 빛 경로 1 cm.의 베트를 사용 하 여 현미경으로 hemocytometer 또는 자동화 된 셀을 사용 하 여 셀의 개수 카운터입니다.

2. 샘플 준비

1. Phycobiliprotein 저하를 방지 하기 위해 낮은 irradiance에서 동작.
2. 안전 잠금 관에 문화 현 탁 액의 3 x 1 mL를 수확. Triplicates를 사용 하 여 측정에서 기술적 오류 추정에 대 한. 무 균 조건 하에서 문화 샘플링을 수행 하려면 층 류 후드에 세포를 수확 하 고 적절 한 작업 및 안전 관행에 따라.
3. 15000 x g 에 5 분 제대로 균형된 원심 분리기로 터에 관심을 지불에 대 한 실험실 온도에서 세포 원심 원심, 후는 supernatants 삭제 합니다. 수는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 하십시오.
4. 냉동 실에 샘플을 넣어. 장기 저장을 위한-80 ° c.에 샘플을 계속 이것은 phycobiliprotein 저하를 방지 해야 합니다. 단기 저장을 위해,-20 ° C 충분 하다.
5. Freeze-dry 샘플 하룻밤. 적절 한 동결 과정에 대 한 동결 건조 기 콘덴서-60 ° c의 온도 유지 하 고 동결 건조 기에서 압력 챔버 1 hPa.
6. 마친 후 동결 주기, 튜브 공기에서 물의 재흡수를 방지 하기 위해 가능한 한 빨리 닫습니다.

3. 세포 균질 및 추출 색소

1. 각 샘플 튜브 (직경 2 mm)와 유리 구슬의 4 조각을 추가 하 고 튜브를 닫습니다.
   참고: 때 균질 사용 안전 잠금 튜브의 뚜껑은 너무 얇은, 그것은 깨뜨릴 수 있는 동안 균질; 따라서, 강한 뚜껑만 안전 잠금 튜브는이 프로토콜에 대 한 것이 좋습니다.
2. 15 유리 구슬과 샘플 균질 실험실 온도에서 균질 화기에 s.
   참고: 제대로 무 균된 샘플 안전 잠금 튜브의 전체 내부 표면에 전염 됩니다.
3. 1 mL PBS 버퍼 (pH 7.4)의 phycobiliproteins을 추출 하기 위해 샘플을 4 ° C에 precooled를 추가 합니다.
   참고:이 단계에서 추출 된 단백질의 저하를 방지 하기 위해 얼음에 샘플 계속. 이것은 중요 한입니다.
4. 5 샘플 PBS 믹스 실험실 온도에서 균질 화기에 s.
   참고: 혼합 후, 샘플은 녹색.
5. 혼합 후, 샘플 60 분 커버에 대 한 얼음에 색소 저하를 방지 하기 위해 뚜껑 얼음 목욕 유지.
6. Phycobiliprotein 추출의 60 분, 후 5 분 원심 분리기 회전자를 제대로 균형에 관심을 지불에 대 한 4 ° C에서 15000 x g 에서 샘플 원심.
   참고: 원심, 후에 상쾌한 시안색 파란색이 있다.

4. Phycobiliprotein 정량화

1. Spectrophotometric 측정 하기 전에 빈으로 PBS 버퍼를 사용 하 여 기준선을 분 광 광도 계를 보정.
2. 분 광 광도 계 보정은 일단 무시 한 분 광 광도 계 베트에서 PBS 고 폐기 버퍼 대신 추출된 phycobiliproteins와 상쾌한 플라스틱.
3. Phycobiliprotein 농도 spectrophotometrically, 0.5의 슬릿 폭을 사용 하 여 계량 nm.
   1. Phycocyanin와 615에서 빈 PBS 버퍼에 대 한 allophycocyanin phycocyanobilins의 흡 광도 측정 (₆₁₅) 및 652 nm (₆₅₂), 각각, 720에 세포질 파편의 흡 광도 측정 하 고 nm (₇₂₀).
   2. Phycocyanin와 방정식에 따르면 allophycocyanin의 (1) 및 (2) 베넷과 Bogorad¹²의 농도 계산.
      
      
      참고:₆₁₅,₆₅₂및₇₂₀ 는 분 광 광도 계의 선형 흡 광도 범위에 적합 해야 한다. 필요한 경우, PBS 버퍼와 샘플을 희석.
4. 원래 샘플에 안료 농도 다시 계산. 샘플에서 안료 농도 방정식 (1) 및 (2) 사용 될 때 1 mL의 문화 및 추출 버퍼의 1 mL는 분석의 결과와 직접 해당 합니다. 박테리아 샘플 PBS 버퍼의 다른 볼륨을 사용 하는 경우 최종 안료 농도 식 (3)에 따라 계산 해야:
   (3)
   참고: 셀 건조 중량 당 정규화 phycobiliprotein 콘텐츠, 경우 최종 안료 농도 계산 해야 방정식 (4)에 따라 (4)

5. (선택 사항) 셀 건조 중량의 결정

1. 3 빈 안전 잠금 튜브 분석 균형에 무게.
   주의: 그것은 중요 안전 잠금 튜브는 건조입니다. 젖은 환경에 튜브를 저장 하는 경우 동결 건조 하기 전에 그들을 무게에 몇 시간 동안 튜브를 건조. 부드럽게 튜브를 조작 및만 손으로 파우더 무료 장갑 낀 자료와 연구자의 손가락 사이 어떤 접촉을 피하기 위해. 모든 소유자를 유지 하 고 깨끗 한 관에 자료의 전송을 방지 하기 원심.
2. 1 x 15 mL 15 mL 원뿔 튜브에 문화 현 탁 액의 샘플.
3. 각 포함 15 mL의 물에 15 mL 원뿔 튜브 4000 x g 에서 10 분 원심 분리기로 터의 균형에 대 한 실험실 온도에서 세 개의 추가 15 mL 원뿔 튜브에에서 문화의 정지 원심 원심, 후는 상쾌한의 12 mL를 삭제 합니다.
4. 나머지 상쾌한에 펠 릿을 resuspend 하 고 혼합물의 3 x 1 mL를 피펫으로 3 1.5 mL 안전 잠금 튜브 전송. 펠 릿의 일부 남은 15 mL 원뿔 튜브에 남아, 경우에 이온된 수의 1.5 mL 원뿔 튜브, 소용돌이 또는 악수 튜브 나머지 resuspend를 작은, 및 혼합물의 3 x 0.5 mL 3 1.5 mL 안전 잠금 튜브 (이미 containi 전송에 추가 ng는 펠 릿의 3 x 1 mL)는 피 펫으로.
   참고: 세 개의 1.5 mL 안전 잠금 튜브에 펠 릿을 나누어 건조 중량 측정의 기술적 오류 추정 수 있게 됩니다.
5. 원심 셀 5 분 균형에 대 한 실험실 온도에서 15000 x g 에서 1.5 mL 안전 잠금 튜브에 물 1 mL를 포함 하는 추가 1.5 mL 안전 잠금 튜브 원심 분리기 회전자. 원심, 후는 supernatants 삭제 합니다.
6. 냉동 실에 샘플을 넣어. 장기 저장을 위한-80 ° C에서 샘플을 계속 단기 저장용-20 ° C 충분 하다.
7. Freeze-dry 샘플 하룻밤. 적절 한 동결 과정에 대 한 동결 건조 기 콘덴서-90 ° c의 온도 유지 하 고 동결 건조 기에서 압력 챔버 1 hPa.
8. 동결, 후 튜브를 닫고 샘플 분석 균형에 무게.
   참고: 건조 중량 값 셀 건조 중량 당 phycobiliprotein 콘텐츠 정상화에 대 한 사용할 수 있습니다.

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결과

초기 메서드 테스트에 대 한 Synechocystis BG11 재배 매체²⁰ (17 mM HEPES 보충) 25 ° C, 50 µmol (광자)의 농도의 따뜻한 하얀 빛 아래에서 재배 통에 삼각 플라스 크에 배치 문화로는 / (m ²·s)와 1% CO₂ 자란 분위기에. 재배 기간 동안 문화 안전 잠금 튜브로 샘플링 된 centrifuged (15000 x g 5 분 동안 실험실 온도에서)는 상쾌한, 폐기 및 샘플 중...

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토론

이 프로토콜 모델 cyanobacterium Synechocystis에서 phycobiliprotein 콘텐츠의 정량화에 대 한 간단한 빠르고 재현할 수 방법을 설명합니다. 셀 균질, 단백질 추출과 phycocyanin와 allophycocyanin 정량화의 몇 가지 메서드를 비교 하 고 마지막 프로토콜의 모든 단일 절차의 최적의 단계 조합을 나타냅니다. 대표적인 데이터, phycobiliproteins의 콘텐츠는 빛의 강도 증가에서 Synechocystis 셀에 정량 했다. 비록 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synechocystis sp. PCC 6803	Institut Pasteur, Paris, France	6803	Cyanobacterium strain
Roti-CELL PBS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	9143.1	Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes	Eppendorf, Hamburk, Germany	30120086	Safe-lock tubes 1.5 ml
VWR 80-Place Storage System	VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA	30128-282	Holder for safe-lock tubes
RAININ 100 µl -1000 µl	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	17014382	Pipette
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	30389272	Pipette tips
Rotina 420R	Hettich, Kirchlengern, Germany	4701	Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes
LCexv 4010	Liebherr, Bulle, Switzerland	9005382197172	Refrigerator and freezer -20 °C
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	EXF24086V	Freezer -80 °C
CoolSafe	LaboGene, Lillerød, Denmark	7.001.000.615	Freeze dryer
UV-2600	Shimadzu, Kyoto, Japan	UV-2600	Spectrophotometer
Hellma absorption cuvettes, semi Micro	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z600288	VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm
Silamat S6	Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein	602286WU	Homogenizer
Solid-glass beads	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z273627	Glass bead of the diameter 2 mm
CPA225D-0CE	Sartorius AG, Göttingen, Germany	SECURA225D-1OBR	Analytical balances
C-Phycocyanin from Spirulina sp.	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P2172	Phycocyanin standard
Allophycocyanin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7472	Allophycocyanin standard
Bicinchoninic Acid Kit	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	BCA1, B9643	Complete kit for total proteins determination
AlgaeTron	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	AG 130-ECO	Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere
Photobioreactor	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic	FMT-150	Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment
Cellometer	Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA	Auto M10	Cell counter
Corning 15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS430791	15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling
Herasafe KS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	51024579	Laminar flow hood