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Resumen

La senescencia celular es el factor clave en el desarrollo de patologías crónicas relacionadas con la edad. La identificación de las terapias que se dirigen a las células senescentes son prometedoras para extender el envejecimiento saludable. Aquí, presentamos un nuevo ensayo para la identificación de senoterapéuticos basado en la medición de la actividad de senescencia asociada a la galactosidasa en células individuales.

Resumen

La senescencia celular es una de las señas de identidad del envejecimiento que se sabe que influye negativamente en una vida saludable. Los medicamentos capaces de matar las células senescentes específicamente en el cultivo celular, llamados snolíticos, pueden reducir la carga celular senescente in vivo y extender la vida sanitaria. Hasta la fecha se han identificado múltiples clases de sílíticos, incluidos los inhibidores del HSP90, los inhibidores de la familia Bcl-2, la piperlongumina, un péptido inhibidor de FOXO4 y la combinación de Dasatinib/Quercetina. La detección de SA-a-Gal a un pH lisosomal aumentado es uno de los marcadores mejor caracterizados para la detección de células senescentes. Mediciones de células vivas de la actividad de la senescencia asociada a la galactosidasa (SA--Gal) utilizando el sustrato fluorescente C12FDG en combinación con la determinación del número celular total utilizando un tinte Hoechst intercalado de ADN abre la posibilidad de detectar medicamentos senoterapéuticos que reducen la actividad general de la SA-A-Gal matando a células senescentes (senolíticas) o suprimiendo SA--Gal y otros fenotipos de células senescentes (senomórficas). El uso de una plataforma de adquisición y análisis de imágenes fluorescentes de alto contenido permite la detección rápida y de alto rendimiento de las bibliotecas de medicamentos en busca de efectos en SA-A-Gal, morfología celular y número de célula.

Introducción

La senescencia celular fue descrita por primera vez por Leonard Hayflick y Paul Moorhead,quienes mostraron que las células normales tenían una capacidad limitada para proliferar en el cultivo 1. Las células senescentes no proliferan a pesar de la presencia de nutrientes, factores de crecimiento y falta de inhibición del contacto, pero permanecen metabólicamente activas2. Este fenómeno se conoce como senescencia replicativa y se atribuyó principalmenteal acortamiento de los telómeros, al menos en las células humanas 3. Otros estudios han demostrado que las células también pueden ser inducidas para someterse a senescencia en respuesta a otros estímulos, como el estrés oncogénico (senescencia inducida por oncógeno, OIS), daño al ADN, fármacos citotóxicos o irradiación (senescencia inducida por estrés, SIS)4 , 5 , 6. En respuesta a daños en el ADN, incluida la erosión de los telómeros, las células se ensacian, inician el crecimiento celular incontrolado o se someten a apoptosis si el daño no puede ser reparado. En este caso, la senescencia celular parece ser beneficiosa ya que actúa de manera supresora tumoral2. Por el contrario, la senescencia aumenta con el envejecimiento debido a la acumulación de daño celular, incluyendo daño al ADN. Dado que las células senescentes pueden secretar citoquinas, metaloproteinasas y factores de crecimiento, denominaron fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), este aumento dependiente de la edad en la senescencia celular y SASP contribuye a disminuir la homeostasis tisular y posteriormente envejecimiento. Además, este aumento dependiente de la edad en la carga de senescencia es conocido por inducir enfermedades metabólicas, sensibilidad al estrés, síndromes de progeria, y deterioro de la curación7,8 y es, en parte, responsable de los numerosos relacionados con la edad enfermedades, como aterosclerosis, osteoartritis, degeneración muscular, formación de úlceras, y enfermedad de Alzheimer9,10,11,12,13. La eliminación de las células senescentes puede ayudar a prevenir o retrasar la disfunción tisular y extender la vida saludable14. Esto se ha demostrado en los modelos de ratón transgénico14,15,16, así como mediante el uso de fármacos senolíticos y combinaciones de fármacos que se descubrieron a través de esfuerzos de detección de drogas y análisis bioinformáticos de vías inducidas específicamente en células senescentes17,18,19,20,21,22. Identificar fármacos senoterapéuticos más óptimos, capaces de reducir más eficazmente la carga celular senescente, es un paso importante en el desarrollo de enfoques terapéuticos para el envejecimiento saludable.

Las células senescentes muestran características fenotípicas y moleculares características, tanto en cultivo como in vivo. Estos marcadores de senescencia podrían ser la causa o el resultado de la inducción de la senescencia o un subproducto de los cambios moleculares en estas células. Sin embargo, no se encuentra un solo marcador específicamente en las células senescentes. En la actualidad, la detección de la galactosidasa asociada a la senescencia (SA-Gal) es uno de los métodos basados en células únicas mejor caracterizados y establecidos para medir la senescencia in vitro e in vivo. Es una hidrolasa lisosomal con una actividad enzimática óptima a pH 4. Medir su actividad a pH 6 es posible porque las células senescentes muestran un aumento de la actividad lisosomal23,24. Para las células vivas, el aumento del pH lisosomal se obtiene mediante alcalinización lisosomal con el inhibidor vacuolar H+-ATPase Bafilomicina A1 o el inhibidor de la acidificación endosomal cloroquina25,26. 5-DodecanoylaminofluoresceinDi-o-D-galactopyraside (C12FDG) se utiliza como sustrato en células vivas ya que retiene el producto de linaza en las células debido a su 12 mitades lipofílicas de carbono25. Es importante destacar que la actividad de SA-A-Gal en sí misma no está directamente relacionada con ninguna vía identificada en las células senescentes y no es necesaria para inducir la senescencia. Con este ensayo, las células senescentes se pueden identificar incluso en las poblaciones de células heterogéneas y tejidos envejecidos, como biopsias de piel de individuos mayores. También se ha utilizado para mostrar una correlación entre la senescencia celular y el envejecimiento23 ya que es un marcador fiable para la detección de células senescentes en varios organismos y condiciones27,28,29, 30. En este caso, se describe un ensayo de cribado de alto rendimiento sA-a-Gal basado en el sustrato fluorescente C12FDG utilizando fibroblastos embrionarios de ratón primario (MEF) con senescencia celular inducida por estrés oxidativo robusto y sus ventajas y desventajas se discuten. Aunque este ensayo se puede realizar con diferentes tipos de células, el uso de Ercc1-insuficiente, DETERIORO de la reparación del ADN MEFs permite una inducción más rápida de la senescencia en condiciones de estrés oxidativo. En ratones, la reducción de la expresión de la endonucleasa de reparación del ADN ERCC1-XPF causa deterioro de la reparación del ADN, acumulación acelerada de daño endógeno del ADN, ROS elevado, disfunción mitocondrial, aumento de la carga celular senescente, pérdida de la función de las células madre y envejecimiento prematuro, similar al envejecimiento natural31,32. Del mismo modo, los MEF con deficiencia de Ercc1sufren senescencia más rápidamente en el cultivo17. Una característica importante del ensayo MEF senescente es que cada pozo tiene una mezcla de células senescentes y no senescentes, lo que permite la demostración clara de efectos específicos de células senescentes. Sin embargo, aunque creemos que el uso del estrés oxidativo en las células primarias para inducir la senescencia es más fisiológico, este ensayo también se puede utilizar con líneas celulares donde la senescencia se induce con agentes dañinos para el ADN como la etoposido o la irradiación.

Protocolo

El uso de animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Scripps Florida.

1. Generación de fibroblasto embrionario murino senescente (MEF) – 12-15 días

  1. Aislar el tipo silvestre y Ercc1-/- MEF de ratones hembra embarazadas en el día embrionario 13 (E13) como se describió anteriormente33.
    NOTA: Todos los pasos siguientes se llevan a cabo en una campana de cultivo de tejido en condiciones asépticas y utilizando instrumentos estériles.
  2. Reseque la cabeza del embrión por encima de los ojos.
  3. Retire el tejido rojo (corazón e hígado) y utilícelos para el genotipado si es necesario.
  4. Preparar 500 ml de una mezcla 1:1 de Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) y F10 de Jamón con 10% de suero bovino fetal, 1x aminoácidos no esenciales, penicilina y estreptomicina como medio de crecimiento y calentarlo hasta 37 oC durante unos 15 minutos antes de cada uso. Conservar el medio de crecimiento a 4oC.
  5. Incubar el resto del embrión con 0,25% de trippsina/EDTA durante 10 min.
  6. Picar el embrión en trozos de 1 mm y pipetear el tejido varias veces.
  7. Añadir 10 ml de medio de crecimiento y tejidos de placa de un embrión por placa de cultivo celular de 10 cm de diámetro (paso 0).
  8. Cultivar células a 37oC, 3% O2, 5% CO2.
    NOTA: Sólo las células MEF se unen a placas de cultivo de tejido no recubierto en estas condiciones.
  9. Cambie el medio todos los días en el pasaje 0 para eliminar los fragmentos de tejido y células no unidos.
    NOTA: Dependiendo del tamaño del embrión y la calidad del aislamiento, la célula generalmente alcanza la confluencia después de 2 a 3 días.
  10. Tripinización
    1. Retire cuidadosamente el medio de crecimiento y lave las células con 10 ml de 1pbS dos veces.
    2. Añadir 2 ml de una solución de trippsina/EDTA al 0,025% a las células en placas de 10 cm de diámetro e incubar a 37 oC durante 2-3 min.
    3. Asegúrese de que las células estén separadas de la superficie inspeccionando las células bajo el microscopio.
    4. Terminar la digestión de la trippsina añadiendo la misma cantidad de medio de crecimiento.
    5. Transfiera las células a un tubo cónico y células centrífugas a 200 x g durante 3 min y deseche el sobrenadante.
    6. Resuspenda las células cuidadosamente en un nuevo medio de crecimiento, cuente las células y sórtelas en placas nuevas a la densidad celular proyectada.
  11. Para el subcultivo no senescente divida las células confluentes 1:4 y se extienda para otro pasaje a 3% O2,37 oC para producir más celdas (paso 1).
    NOTA: En este punto, las células pueden mantenerse en cultivo o almacenarse para su uso posterior en nitrógeno líquido, en crioviales que contienen aproximadamente 1 millón de células cada una. Este paso también ofrece la posibilidad de generar un lote mixto de células de diferentes animales para reducir la variabilidad proveniente del análisis de un solo animal.
  12. Para inducir la senescencia celular, las células confluentes divididas por semillas delpaso 1 en una proporción de 1:4 y las incuban a 20% O 2, 37 oC, 5% CO2 durante 3 días; estas condiciones de cultivo son atmosféricas para el oxígeno.
    NOTA: El cultivo de células y blastocistos bajo concentraciones de oxígeno ambiente puede elevar los marcadores de senescencia celular específicamente cuando la reparación del daño del ADN se ve afectada34,35,36.
  13. Repita este procedimiento para 2 pasajes más.
  14. Para monitorear la senescencia celular, mida el aumento gradual en el diámetro celular y el volumen celular durante cada paso de trippsinización usando un sistema avanzado de contador de células Coulter.
  15. Evaluar la reducción de la proliferación celular mediante la determinación de la duplicación de la población (PD) utilizando la ecuación
    PDT (t2-t1)/3.32 x (log n2 – log n1)
    NOTA: El tiempo de duplicación de la población solo se utilizó para las celdas que no son de senescente.
  16. Utilice las células MEF de paso temprano o Ercc1-/- que se mantuvieron en 3% O2, 37 oC, 5% CO2 como células de control no senescentes.

2. Ensayo de cribado asociado al Senescento - 2-3 días

  1. Preparar soluciones de stock de 10 mM en DMSO de todos los medicamentos a probar y almacenar alícuotas a -80 oC. No congele las soluciones de stock de descongelación, ya que esto puede disminuir la actividad de los medicamentos.
    NOTA: Aquí, el inhibidor HSP90 17DMAG fue utilizado como un fármaco senolítico capaz de matar específicamente las células senescentes17.
  2. El día del experimento descongelar la alícuota, diluir los fármacos en un medio de cultivo fresco y añadir a las células que contienen medio acondicionado en una proporción de 1:1 para producir la concentración final en el medio de crecimiento.
  3. Utilice placas de predilución de 96 pocillos para diluciones en serie y combinaciones de medicamentos.
    NOTA: Para las células MEF, se determinó empíricamente que las concentraciones de DMSO no deben exceder el 2% y las células de control tratadas con las concentraciones más altas de DMSO utilizadas deben incluirse en cada carrera.
  4. Semillas 5 x 103 células senescentes o 3 x 103 células no-senescentes por pozo en 96 placas de pozo al menos 6 h antes del tratamiento en 100 oL de medio de crecimiento e incubar a 20% O2, 37 oC, 5% CO2.
    NOTA: Las células deben ser aproximadamente 80% confluentes antes deltratamiento.
  5. Utilice el cultivo de tejido de pared negro/fondo transparente, placas de pozo tratadas 96 para minimizar la interferencia de señal fluorescente y el fondo.
    NOTA: Sin embargo, las placas transparentes también se han probado con éxito.
  6. Añadir diluciones de fármacos a las células MEF e incubar durante 24 h a 48 h bajo 20% O2, 37 oC, 5% condiciones de CO2.
  7. Mantenga las células no senescentes por debajo de 3% O2, 37 oC, 5% CO2 condiciones.
  8. Para la alcalinización lisosomal, prepare una solución de 10 mM de bafilomicina A1, alícuota y mantener congelada a -20 oC.
  9. Para el análisis de la fluorescencia de la actividad de SA-A-Gal, prepare una solución de stock de 2 mM C12FDG, almacene a -20 oC y proteja de la luz.
  10. Para la solución de trabajo, prepare 100 M C12FDG en medio de crecimiento el día del experimento.
    NOTA: Todos los pasos (incubación) que impliquen C12FDG deben realizarse en la oscuridad.
  11. Retire la solución farmacológica y lave las células 1 vez con 100 sde 1x PBS.
  12. Inducir la alcalinización lisosomal mediante el pretratamiento de células con 90 ml de una solución de 100 nM de bafilomicina A1 preparada en medio de cultivo celular fresco durante 1 hora a 20% O2, 37 oC, 5% CO2.
  13. Añadir 10 sl de solución de trabajo de 100 M C12FDG al medio de cultivo (concentración final 10 m).
  14. Incubar células durante 2 h.
  15. Añadir 2 l de un tinte Hoechst 33342 de 100 g/ml (concentración final 2 g/ml) al cultivo e incubar durante 20 min.
  16. Retire los medios y agregue 100 s de medio de crecimiento fresco.

3. Análisis cuantitativo de imágenes fluorescentes de alto contenido

  1. Utilice una plataforma de adquisición y análisis de imágenes fluorescentes de alto contenido para adquirir imágenes fluorescentes de las células en los dos canales adecuados para la captura de fluorescencia Hoechst y C12FDG (por ejemplo, preajustes de canal DAPI y FITC, respectivamente).
    NOTA: Los protocolos de adquisición requieren la definición de varias variables específicas del ensayo. El propósito de un protocolo de adquisición es capturar un número adecuado de imágenes fluorescentes en foco de un número suficiente de células para el análisis cuantitativo posterior.
  2. Desarrollar un protocolo de análisis adecuado seleccionando cada canal y definiendo, ajustando uno o más criterios selectivos, lo que califica como una característica de interés en cada canal.
    1. Para el núcleo, utilice así preajustes de segmentación (por ejemplo, segmentación nuclear, segmentación vesícula, segmentación del citoplasma) que permitan la identificación de orgánulos celulares sobre la base de múltiples criterios, incluyendo morfología, tamaño y señal Intensidad. Ajuste estos criterios para incluir núcleos y, al mismo tiempo, excluir fragmentos nucleares y desechos que puedan tener una señal, pero que son, por ejemplo, demasiado grandes o demasiado pequeños para ser núcleos.
    2. Compruebe la señal en el canal FITC que es fluorescencia de C12FDG lanzada y representa la cantidad de actividad de galactosidasa asociada a la senescencia en las células.
      NOTA: Las células senescentes tienen una actividad de galactosidasa asociada a la senescencia más alta que las células no senescentes; sin embargo, la fluorescencia C12FDG no será discreta y continua, lo que requiere el establecimiento de un umbral entre lo que se considera una Célula C12FDG positiva y una C12FDG negativa.
    3. Utilizando software analítico disponible comercialmente, genere un recuento de casos en los que una región definida que rodea el núcleo (una celda presuntiva) se haya solapado al menos una vez con un C12FDG por encima del umbral.
      NOTA: El software analítico genera automáticamente un recuento mediante la vinculación de destino. Esta es la definición práctica del ensayo de una célula senescente, C12FDG positiva.
  3. Analice todas las muestras en triplicado con 3-5 campos por pozo y valores medios y desviaciones estándar que se calculan en consecuencia.
  4. Calcule el porcentaje de celdas senescentes utilizando la siguiente fórmula:
    Células senescentes figure-protocol-10410 (%) x x 100

4. Parámetros de validación del ensayo

  1. Para todas las muestras, el coeficiente de variaciones intra e interensayo (%CV) se calculó utilizando la siguiente fórmula:
    CV de análisis intra-ensayo (n a 10 figure-protocol-10735 repeticiones medidas en un experimento) x 100 (%)
    CV entre ensayos (n 5 experimentos figure-protocol-10889 independientes) x 100 (%)
  2. A efectos de cribado, determinar el valor Z', un parámetro estadístico para evaluar la calidad de un ensayo, a partir de células tratadas con 200 nM rapamicina durante 24 h a 20% O2, 37 oC, 5% CO2 (un control positivo para medicamentos senoterapéuticos) y no tratada células senescentes (control negativo).
    NOTA: El valor Z se calculó de acuerdo con Zhang et al.37. Los valores de Z' entre 0,5 y 1 indican que se puede utilizar un ensayo para la detección de drogas.

Resultados

La actividad de La ga-ga se puede detectar en células que son inducidas a la senescencia por diversas maneras desde el agotamiento replicativo, el estrés genotóxico y oxidativo, hasta la activación del oncogene23,25,38. En el modelo actual utilizando Células fibroblastas embrionarias de ratón Ercc1-deficientes, las condiciones de crecimiento normoxico (20% O2) fueron suf...

Discusión

Es un biomarcador bien definido para la senescencia celular descubierto originalmente por Dimri et al. (1995) mostrando que los fibroblastos humanos senescentes han aumentado la actividad de SA-a-Gal cuando se analizan a pH 623 en comparación con las células que proliferan. Mientras tanto, se han establecido ensayos in vitro e in vivo para SA-a-Gal para diferentes tipos de células y tejidos25,39,40<...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por NIH Grants AG043376 (Proyecto 2 y Núcleo A, PDR; Proyecto 1 y Core B, LJN) y AG056278 (Proyecto 3 y Núcleo A, PDR; y Proyecto 2, LJN) y una subvención de la Fundación Glenn (LJN).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM Corning10-013-CVmedium
Ham's F10Gibco12390-035medium
fetal bovine serumTissue Culture Biologics101serum
1x non-essential amino acidsCorning25-025-Clamino-acids
bafilomycin A1 SigmaB1793lysosomal inhibitor
C12FDGSetareh Biotech7188b-Gal substrate
Hoechst 33342 Life TechnologiesH1399DNA intercalation agent
17DMAGSelleck Chemical LLC50843HSP90 inhibitor
InCell6000 Cell Imaging SystemGE HealthcareHigh Content Imaging System

Referencias

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