SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Zusammenfassung

Zelluläre Seneszenz ist der Schlüsselfaktor bei der Entwicklung chronischer altersbedingter Pathologien. Die Identifizierung von Therapeutika, die auf seneszente Zellen abzielen, verspricht, eine gesunde Alterung zu verlängern. Hier präsentieren wir einen neuartigen Test zur Identifizierung von Senotherapeutika auf der Grundlage der Messung der seneszenzassoziierten Galactosidase-Aktivität in Einzelzellen.

Zusammenfassung

Zellseneszenz ist eines der Kennzeichen des Alterns bekannt, um eine gesunde Lebensdauer negativ beeinflussen. Medikamente, die in der Lage sind, seneszente Zellen speziell in der Zellkultur zu töten, als Sennolytika bezeichnet, können die seneszente Zellbelastung in vivo reduzieren und die Gesundheitsspanne verlängern. Mehrere Klassen von Senolytika wurden bisher identifiziert, einschließlich HSP90-Inhibitoren, Bcl-2-Familieninhibitoren, Piperlongumin, einem FOXO4-hemmenden Peptid und der Kombination von Dasatinib/Quercetin. Der Nachweis von SA-A-Gal bei einem erhöhten lysosomalen pH-Wert ist einer der am besten charakterisierten Marker für den Nachweis von seneszenten Zellen. Live-Zellmessungen der seneszenzassoziierten Aktivität von Seneszenz-assoziierten B-Galactosidase (SA---Gal) mit dem fluoreszierenden Substrat C₁₂FDG in Kombination mit der Bestimmung der Gesamtzellzahl mittels eines DNA-interkalierenden Hoechst-Farbstoffs eröffnet Bildschirm auf senotherapeutische Medikamente, die entweder die gesamte SA-A-Gal-Aktivität durch Tötung von seneszenten Zellen (Senestik) reduzieren oder sA--Gal und andere Phänotypen von seneszenten Zellen (Senosozien) unterdrücken. Die Verwendung einer fluoreszierenden Bildaufnahme- und Analyseplattform mit hohem Gehalt ermöglicht das schnelle Screening von Medikamentenbibliotheken mit hohem Durchsatz auf Effekte auf SA--Gal, Zellmorphologie und Zellzahl.

Einleitung

Die Zellseneszenz wurde zum ersten Mal von Leonard Hayflick und Paul Moorhead beschrieben, die zeigten, dass normale Zellen eine begrenzte Fähigkeit hatten, sich in Kultur¹zu vermehren. Seneszenzzellen vermehren sich trotz des Vorhandenseins von Nährstoffen, Wachstumsfaktoren und mangelnder Kontakthemmung nicht, bleiben aber metabolisch aktiv². Dieses Phänomen ist als replizierende Seneszenz bekannt und wurde hauptsächlich auf die Telomerverkürzung zurückgeführt, zumindest in menschlichen Zellen³. Weitere Studien haben gezeigt, dass Zellen auch als Reaktion auf andere Reize, wie onkogenen Stress (Onkogeninduzierte Seneszenz, OIS), DNA-Schäden, zytotoxische Medikamente oder Bestrahlung (stressinduzierte Seneszenz, SIS) induziert werden können. ^{, 5 , 6}. Als Reaktion auf DNA-Schäden, einschließlich Telomererosion, seneszen die Zellen entweder, beginnen unkontrolliertes Zellwachstum oder erleiden Apoptose, wenn der Schaden nicht repariert werden kann. In diesem Fall scheint die Zellseneszenz vorteilhaft zu sein, da sie tumorsuppressiv wirkt². Im Gegensatz dazu wird die Seneszenz mit dem Altern aufgrund der Anhäufung von Zellschäden einschließlich DNA-Schäden erhöht. Da seneszente Zellen Zytokine, Metalloproteinasen und Wachstumsfaktoren, die als seneszenzassoziierter sekretomlischer Phänotyp (SASP) bezeichnet werden, sezernieren können, trägt diese altersabhängige Zunahme der zellulären Seneszenz und SASP zu einer verminderten Gewebehomöostase und später altern. Auch ist diese altersabhängige Erhöhung der Seneszenzbelastung bekannt, um Stoffwechselerkrankungen, Stressempfindlichkeit, Progerie-Syndrome und beeinträchtigte Heilung^7,8 zu induzieren und ist zum Teil verantwortlich für die zahlreichen altersbedingten Krankheiten wie Arteriosklerose, Arthrose, Muskeldegeneration, Geschwürbildung und Alzheimer-Krankheit^{9,10,11,12,13}. Die Beseitigung seneszierender Zellen kann helfen, Gewebefunktionsstörungen zu verhindern oder zu verzögern und die Gesundheitsspanne¹⁴zu verlängern. Dies wurde in transgenen Mausmodellen^14,15,16 sowie durch die Verwendung von senolytischen Medikamenten und Arzneimittelkombinationen gezeigt, die sowohl durch Arzneimittelscreenings als auch durch bioinformatische Analyse von Wege, die speziell in seneszierenden Zellen induziert werden^{17,18,19,20,21,22}. Die Identifizierung optimaler senotherapeutischer Medikamente, die in der Lage sind, die seneszente Zellbelastung effektiver zu reduzieren, ist ein wichtiger nächster Schritt bei der Entwicklung von therapeutischen Ansätzen für ein gesundes Altern.

Seneszenzzellen weisen charakteristische phänotypische und molekulare Merkmale auf, sowohl in der Kultur als auch in vivo. Diese Seneszenzmarker können entweder die Ursache oder das Ergebnis der Seneszenzinduktion oder ein Nebenprodukt molekularer Veränderungen in diesen Zellen sein. Es wird jedoch kein einzelner Marker speziell in seneszierenden Zellen gefunden. Derzeit ist der Seneszenz-assoziierte Nachweis von Seneszenz-assoziierten '-Galactosidase (SA---Gal) eine der am besten charakterisierten und etablierten einzelzellbasierten Methoden zur Messung der Seneszenz in vitro und in vivo. SA-A-Gal ist eine lysosomale Hydrolase mit einer optimalen enzymatischen Aktivität bei pH 4. Die Messung der Aktivität am pH 6 ist möglich, da seneszentiver Zellen eine erhöhte lysosomale Aktivität zeigen^23,24. Bei lebenden Zellen wird eine erhöhte lysosomale pH-Wert-Taste durch lysosomale Alkalinisierung mit dem Vacuolar H⁺-ATPase-Inhibitor Bafilomycin A1 oder dem endosomalen Versauerungsinhibitor Chloroquin^25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Di--D-Galactopyranosid (C₁₂FDG) wird als Substrat in lebenden Zellen verwendet, da es das geballte Produkt in den Zellen aufgrund seiner 12 Kohlenstoff lipophilen Moiety²⁵behält. Wichtig ist, dass die SA---Gal-Aktivität selbst nicht direkt mit einem in seneszenten Zellen identifizierten Pfad verbunden ist und nicht notwendig ist, um Seneszenz zu induzieren. Mit diesem Test können seneszente Zellen auch in den heterogenen Zellpopulationen und alternden Geweben identifiziert werden, wie Hautbiopsien von älteren Menschen. Es wurde auch verwendet, um eine Korrelation zwischen Zellseneszenz und Alterung²³ zu zeigen, da es ein zuverlässiger Marker für seneszente Zelldetektion in mehreren Organismen und Bedingungen^{ist 27,28,29, 30}. Hier wird ein sA--Gal-Screening-Assay mit hohem Durchsatz auf Basis des fluoreszierenden Substrats C₁₂FDG mit primären embryonalen Fibroblasten (MEFs) mit robust oxidativer Stressinduzierter Zellseneszenz beschrieben und seine Vor- und Nachteile werden diskutiert. Obwohl dieser Test mit verschiedenen Zelltypen durchgeführt werden kann, ermöglicht die Verwendung von Ercc1-mangelhaften, DNA-Reparatur beeinträchtigten MEFs eine schnellere Induktion der Seneszenz unter Bedingungen von oxidativem Stress. Bei Mäusen verursacht eine reduzierte Expression der DNA-Reparatur-Endonuklease ERCC1-XPF eine beeinträchtigte DNA-Reparatur, beschleunigte Anhäufung von endogenen DNA-Schäden, erhöhte ROS, mitochondriale Dysfunktion, erhöhte seneszente Zellbelastung, Verlust der Stammzellfunktion und vorzeitige Alterung, ähnlich wie natürliche Alterung^31,32. In ähnlicher Weise werden Ercc1-mangelhafte MEFs in Kultur¹⁷schneller sensithenz. Ein wichtiges Merkmal des seneszenten MEF-Assays ist, dass jeder Brunnen eine Mischung aus seneszenten und nicht-seneszenten Zellen hat, was eine klare Demonstration von seneszenten zellspezifischen Wirkungen ermöglicht. Obwohl wir glauben, dass die Verwendung von oxidativem Stress in Primärzellen, um Seneszenz zu induzieren, eher physiologisch ist, kann dieser Assay auch mit Zelllinien verwendet werden, bei denen Seneszenz mit DNA-schädlichen Mitteln wie Etoposid oder Bestrahlung induziert wird.

Protokoll

Die Verwendung von Tieren wurde vom Scripps Florida Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Erzeugung von seneszierendem murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) – 12-15 Tage

1. Isolieren Sie wilden Typ und Ercc1^-/- MEFs von trächtigen weiblichen Mäusen am embryonalen Tag 13 (E13) wie zuvor beschrieben³³.
   HINWEIS: Alle folgenden Schritte werden in einer Gewebekulturhaube unter aseptischen Bedingungen und mit sterilen Instrumenten durchgeführt.
2. Resect den Embryokopf über den Augen.
3. Entfernen Sie das rote Gewebe (Herz und Leber) und verwenden Sie es für die Genotypisierung, falls erforderlich.
4. Bereiten Sie 500 ml einer 1:1-Mischung aus Dulbecco es Modified Eagle es Medium (DMEM) und Ham es F10 mit 10% fetalem Rinderserum, 1x nicht essentiellen Aminosäuren, Penicillin und Streptomycin als Wachstumsmedium vor und erwärmen Sie es vor jedem Gebrauch bis zu 37 °C. Wachstumsmedium bei 4 °C lagern.
5. Den Rest des Embryos mit 0,25% Trypsin/EDTA für 10 min inkubieren.
6. Den Embryo in 1 mm Stücke zerkleinern und das Gewebe mehrmals nach oben und unten pipette.
7. Fügen Sie 10 ml Wachstumsmedium und Plattengewebe eines Embryos pro 10 cm Durchmesser Zellkulturplatte (Passage 0) hinzu.
8. Kultivieren Sie Zellen bei 37°C, 3% O2 , 5% CO2 .
   HINWEIS: Unter diesen Bedingungen befestigen sich nur MEF-Zellen an nicht beschichteten Gewebekulturplatten.
9. Ändern Sie das Medium jeden Tag in Durchgang 0, um nicht angeschlossenes Gewebe und Zellfragmente zu entfernen.
   HINWEIS: Abhängig von der Größe des Embryos und der Qualität der Isolierung erreichen die Zellen in der Regel nach 2 bis 3 Tagen die Konfluenz.
10. Trypsinisierung
    1. Entfernen Sie das Wachstumsmedium vorsichtig und waschen Sie Zellen mit 10 ml 1x PBS zweimal.
    2. 2 ml einer 0,025% Trypsin/EDTA-Lösung in Platten mit 10 cm Durchmesser hinzufügen und bei 37 °C für 2-3 min inkubieren.
    3. Stellen Sie sicher, dass zellenlos von der Oberfläche gelöst sind, indem Sie die Zellen unter dem Mikroskop untersuchen.
    4. Beenden Sie die Trypsin-Verdauung, indem Sie die gleiche Menge an Wachstumsmedium hinzufügen.
    5. Übertragen Sie die Zellen bei 200 x g für 3 min in ein konisches Rohr und Zentrifugenzellen und entsorgen Sie den Überstand.
    6. Zellen sorgfältig in frischem Wachstumsmedium aussetzen, Zellen zählen und in neuen Platten bei der projizierten Zelldichte aussaieren.
11. Für nicht-seneszierende Subkultivierung spalten konfluente Zellen 1:4 und erstrecken sich für einen weiteren Durchgang bei 3%_O2, 37 °C, um mehr Zellen zu ergeben (Durchgang 1).
    HINWEIS: An dieser Stelle können die Zellen entweder in Kultur gehalten oder für die spätere Verwendung in flüssigem Stickstoff gespeichert werden, in Kryovials mit jeweils etwa 1 Million Zellen. Dieser Schritt bietet auch die Möglichkeit, eine gemischte Charge von Zellen von verschiedenen Tieren zu erzeugen, um die Variabilität zu reduzieren, die aus der Einzeltieranalyse stammt.
12. Um die Zellseneszenz zu induzieren, spaltet der Samen die konfluenten Zellen ausDurchgang 1 im Verhältnis 1:4 und inkubiert sie bei 20% O2, 37 °C, 5% CO2 für 3 Tage; diese Kulturbedingungen sind atmosphärisch für Sauerstoff.
    HINWEIS: Die Kultivierung von Zellen und Blastozysten unter DenerUmgebungssauerstoffkonzentrationen kann Marker der zellulären Seneszenz erhöhen, insbesondere wenn die Reparatur von DNA-Schäden beeinträchtigt ist^34,35,36.
13. Wiederholen Sie diesen Vorgang für 2 weitere Passagen.
14. Um die zelluläre Seneszenz zu überwachen, messen Sie die allmähliche Zunahme des Zelldurchmessers und des Zellvolumens während jedes Trypsinisierungsschritts mit einem fortschrittlichen Coulter-Zellzählersystem.
15. Bewerten Sie die Verringerung der Zellproliferation durch Bestimmung der Populationsverdoppelung (PD) mit der Gleichung
    PDT = (t₂-t₁)/3,32 x (log n₂ – log n₁)
    HINWEIS: Die Verdoppelungszeit der Bevölkerung wurde nur für nicht-seneszierende Zellen verwendet.
16. Verwenden Sie frühe Durchgangwildtyp oder Ercc1^-/- MEF-Zellen, die bei 3% O2, 37 °C, 5% CO2 als nicht-seneszente Kontrollzellen gehalten wurden.

2. Senescent assoziierter Screening-Test – 2-3 Tage

1. Bereiten Sie 10 mM Lagerlösungen in DMSO aller zu testenden Medikamente vor und lagern Sie Aliquots bei -80 °C. Einfrieren-Tau-Aktienlösungen, da dies die Aktivität von Medikamenten verringern kann.
   HINWEIS: Hier wurde der HSP90-Hemmer 17DMAG als senolytisches Medikament eingesetzt, das in der Lage ist, seneszente Zellen gezielt abzutöten¹⁷.
2. Tauen Sie am Tag des Experiments das Aliquot, verdünnen Sie die Medikamente in einem frischen Kulturmedium und fügen Sie den Zellen, die konditioniertes Medium enthalten, im Verhältnis 1:1 hinzu, um die Endkonzentration im Wachstumsmedium zu ergeben.
3. Verwenden Sie 96-Well-Vorverdünnungsplatten für serielle Verdünnungen und Arzneimittelkombinationen.
   HINWEIS: Bei MEF-Zellen wurde empirisch festgestellt, dass die DMSO-Konzentrationen 2 % nicht überschreiten sollten und Kontrollzellen, die mit den höchsten DMSO-Konzentrationen behandelt wurden, sollten in jeden Durchlauf einbezogen werden.
4. Samen 5 x 10³ Seneszenzzellen oder 3 x 10³ nicht-seneszente Zellen pro Brunnen in 96 Brunnenplatten mindestens 6 h vor der Behandlung in 100 l Wachstumsmedium und inkubieren bei 20% O2 , 37 °C, 5% CO2 .
   HINWEIS: Zellen sollten vor der Behandlung etwa 80 % konfluent sein.
5. Verwenden Sie schwarze Wand /klare Bodengewebekultur, behandelt 96 Brunnenplatten, um fluoreszierende Signal-Crosstalk und Hintergrund zu minimieren.
   HINWEIS: Klare Platten wurden jedoch auch erfolgreich getestet.
6. Fügen Sie den MEF-Zellen Arzneimittelverdünnungen hinzu und brüten Sie 24 h bis 48 h unter 20%_O2, 37 °C, 5% CO2-Bedingungen.
7. Halten Sie nicht-seneszenzfreieZellen unter 3% O2 , 37 °C, 5% CO2-Bedingungen.
8. Für die lysosomale Alkalinisierung eine 10 mM Bafilomycin A1 Lösung vorbereiten, aliquotisieren und bei -20 °C einfrieren lassen.
9. Für die Fluoreszenzanalyse der SA-A-Gal-Aktivität eine 2 mM C₁₂FDG-Lagerlösung vorbereiten, bei -20 °C lagern und vor Licht schützen.
10. Für die Arbeitslösung am Experimenttag 100 m C₁₂FDG im Wachstumsmedium vorbereiten.
    HINWEIS: Alle (Inkubations-)Schritte mit C₁₂FDG sollten im Dunkeln durchgeführt werden.
11. Entfernen Sie die Arzneimittellösung und waschen Sie die Zellen 1 Mal mit 100 l 1x PBS.
12. Induzieren Sie die lysosomale Alkalinisierung durch Vorbehandlung von Zellen mit 90 l einer 100 nM Bafilomycin A1-Lösung, die in einem Frischzellkulturmedium für 1 Stunde bei 20%_O2, 37 °C, 5% CO2 hergestellt wird.
13. Fügen Sie dem Kulturmedium 10 l von 100 'M C₁₂FDG-Arbeitslösung hinzu (Endkonzentration 10 'M).
14. Inkubieren Sie Zellen für 2 h.
15. Fügen Sie der Kultur 2 l eines Hoechst 33342 Farbstoffs (Endkonzentration 2 g/ml) hinzu und brüten 20 min.
16. Entfernen Sie die Medien, und fügen Sie 100 L frisches Wachstumsmedium hinzu.

3. Quantitative fluoreszierende Bildanalyse mit hohem Gehalt

1. Verwenden Sie eine fluoreszierende Bildaufnahme- und Analyseplattform mit hohem Anteil, um fluoreszierende Bilder der Zellen in den beiden Kanälen zu erfassen, die für die Erfassung von Hoechst- und C12FDG-Fluoreszenz (z. B. DAPI- bzw. FITC-Kanalvoreinstellungen) geeignet sind.
   HINWEIS: Erfassungsprotokolle erfordern die Definition mehrerer Variablen, die für den Test spezifisch sind. Ziel eines Erfassungsprotokolls ist es, eine ausreichende Anzahl von in-Fokus-Fluoreszenzbildern einer ausreichenden Anzahl von Zellen für die nachgelagerte quantitative Analyse zu erfassen.
2. Entwickeln Sie ein geeignetes Analyseprotokoll, indem Sie jeden Kanal auswählen und durch Anpassen eines oder mehrerer selektiver Kriterien definieren, was für jeden Kanal als interessanter Merkmal gilt.
   1. Verwenden Sie für den Kern so Segmentierungsvorsätze (z. B. Kernsegmentierung, Vesikelsegmentierung, Zytoplasmasegmentierung), die die Identifizierung von Zellorganellen auf der Grundlage mehrerer Kriterien wie Morphologie, Größe und Signal ermöglichen. intensität. Passen Sie diese Kriterien so an, dass Kerne eingeschlossen werden, während nukleare Fragmente und Trümmer ausgeschlossen werden, die zwar ein Signal haben, aber beispielsweise zu groß oder zu klein sind, um Kerne zu sein.
   2. Überprüfen Sie das Signal im FITC-Kanal, das fluoreszenz aus cleaved C₁₂FDG ist und die Menge der seneszenzassoziierten Aktivität in den Zellen darstellt.
      ANMERKUNG: Seneszenzzellen haben eine höhere seneszenzassoziierte Aktivität von 'Galactosidase als nicht-seneszierende Zellen; C₁₂FDG-Fluoreszenz wird jedoch nicht diskret und kontinuierlich sein, was die Festlegung eines Schwellenwerts zwischen dem, was als C₁₂FDG-positiv angesehen wird, und einer C₁₂FDG-negativen Zelle erforderlich macht.
   3. Erzeugen Sie mit kommerziell erhältlicher Analysesoftware eine Anzahl von Instanzen, in denen sich eine definierte Region um den Kern (eine mutmaßliche Zelle) mindestens einmal mit einem überschwelligen C₁₂FDG überlappt hat.
      HINWEIS: Die Analysesoftware generiert automatisch eine Zählung mithilfe der Zielverknüpfung. Dies ist die praktische Definition einer seneszenten, C₁₂FDG-positiven Zelle.
3. Analysieren Sie alle Stichproben in dreifacher Ausfertigung mit 3-5 Feldern pro Brunnen und Mittelwerten und Standardabweichungen werden entsprechend berechnet.
4. Berechnen Sie den Prozentsatz der seneszierenden Zellen mit der folgenden Formel:
   Seneszierende Zellen (%) = x 100

4. Assay-Validierungsparameter

1. Für alle Stichproben wurden der Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizient (%CVs) nach folgender Formel berechnet:
   Intra-Assay CV (n = 10 Wiederholungen in einem Experiment gemessen) = x 100 (%)
   Inter-Assay CV (n = 5 unabhängige Experimente) = x 100 (%)
2. Bestimmen Sie zu Screening-Zwecken den Z-Wert, einen statistischen Parameter zur Bewertung der Qualität eines Assays, aus Zellen, diemit 200 nM Rapamycin für 24 h bei 20% O2, 37 °C, 5% CO2 (eine positive Kontrolle für senotherapeutische Arzneimittel) und unbehandelt behandelt wurden. seneszierenden Zellen (negative Kontrolle).
   HINWEIS: Der Wert des Z wurde nach Zhang et al.³⁷berechnet. Z'-Werte zwischen 0,5 und 1 deuten darauf hin, dass ein Assay für das Drogenscreening verwendet werden kann.

Ergebnisse

Die SA---Gal-Aktivität kann in Zellen nachgewiesen werden, die durch verschiedene Arten von replizierter Erschöpfung, genotoxischem und oxidativem Stress bis hin zur Onkogenaktivierung^23,25,38zur Senesz induziert werden. Im aktuellen Modell mit Ercc1-mangelhaften mausembryonalen Fibroblastenzellen reichtennormoxische Wachstumsbedingungen (20% O2 ) aus, um die Zellseneszenz n...

Diskussion

SA-A-Gal ist ein klar definierter Biomarker für zelluläre Seneszenz, der ursprünglich von Dimri et al. entdeckt wurde. (1995) zeigt, dass seneszente menschliche Fibroblasten eine erhöhte Aktivität von SA-A-Gal haben, wenn sie bei pH 6²³ im Vergleich zu sich ausbreitenden Zellen gemessen werden. Inzwischen wurden In-vitro- und In-vivo-Assay für SA-A-Gal für verschiedene Zelltypen und Gewebe^25,39,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013-CV	medium
Ham's F10	Gibco	12390-035	medium
fetal bovine serum	Tissue Culture Biologics	101	serum
1x non-essential amino acids	Corning	25-025-Cl	amino-acids
bafilomycin A1	Sigma	B1793	lysosomal inhibitor
C12FDG	Setareh Biotech	7188	b-Gal substrate
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	DNA intercalation agent
17DMAG	Selleck Chemical LLC	50843	HSP90 inhibitor
InCell6000 Cell Imaging System	GE Healthcare		High Content Imaging System