SA-β-갈락토시다아제 계 선별 분석법

요약

세포 노화는 만성 연령 과 관련된 병리 발달의 핵심 요소입니다. 노화 세포를 표적으로 하는 치료제의 식별은 건강한 노화를 연장하기 위한 약속을 보여줍니다. 여기서, 우리는 단일 세포에서 의 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성의 측정에 기초하여 senotherapeutics의 식별을 위해 스크리블하는 새로운 분석방법을 제시한다.

초록

세포 노화는 건강한 수명에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려진 노화의 특징 중 하나입니다. 세포 배양에서 특히 노화 세포를 죽일 수있는 약물, senolytics라고, 생체 내에서 노화 세포 부담을 감소시키고 건강을 연장 할 수 있습니다. Senolytics의 여러 클래스는 현재까지 HSP90 억제제를 포함 하 여 확인 되었습니다., Bcl-2 가족 억제제, piperlongumine, FOXO4 억제 펩 티 드와 다 사 티 닙/케르세틴의 조합. 증가된 리소좀 pH에서 SA-β-Gal의 검출은 노화 세포의 검출을 위한 최고의 특징 마커 중 하나이다. 노화 관련 β-갈락토시다아제(SA-β-Gal) 활성의 살아있는 세포 측정은 호흐트트 염료를 인터컬레이팅하는 DNA를 이용하여 총 세포 수의 측정과 조합하여 형광 기질 C₁₂FDG를 이용한 가능성을 열어준다. 노화 세포 (senolytics)를 죽이거나 SA-β-Gal 및 노화 세포의 다른 표현형을 억제하여 전반적인 SA-β-Gal 활성을 감소시키는 세포 치료 약물에 대한 스크린 (senomorphics). 높은 함량의 형광 이미지 수집 및 분석 플랫폼을 사용하면 SA-β-Gal, 세포 형태 및 세포 수에 미치는 영향에 대한 약물 라이브러리의 신속하고 높은 처리량 스크리닝이 가능합니다.

서문

세포 노화는 레너드 헤이플릭과 폴 무어헤드에 의해 처음으로 기술되었으며, 이들은 정상 세포가 배양1에서 증식하는 능력이 제한적이라는 것을 보여주었다. 노화 세포는 영양소의 존재에도 불구하고 증식하지 못하고, 성장 인자 및 접촉 억제의부족, 그러나 신진 대사 활성 남아 2. 이러한 현상은 복제 노쇠로 알려져 있으며 주로 인간 세포 3에서 텔로미어 단축에기인했다. 추가 연구는 세포가 또한 종양 발생 스트레스 (종양 유전자 유도 노쇠, OIS), DNA 손상, 세포 독성 약물, 또는 조사 (스트레스 유도 노쇠, SIS)와 같은 다른 자극에 대한 응답으로 노화를 겪도록 유도 될 수 있음을 보여 주었다^{4 , 5개 , 6}. 텔로미어 침식을 포함한 DNA 손상에 반응하여 세포는 노화를 시작하거나 통제되지 않은 세포 성장을 시작하거나 손상을 복구 할 수없는 경우 세포 사멸을 겪습니다. 이 경우, 세포 노화는 종양 억제 방식으로 작용하므로 유익한 것으로보인다 2. 대조적으로, 노화는 DNA 손상을 포함하여 세포 손상의 축적 때문에 노화와 함께 증가합니다. 노화 세포는 사이토카인, 금속 단백질 및 성장 인자를 분비 할 수 있기 때문에 노화 관련 분비 표현형 (SASP)이라고 불립니다.이 노화 의존적 증가는 세포 노화 및 SASP의 노화 에 의존적 증가하여 조직 항상성 감소에 기여하고 그 후 노화. 또한, 이러한 노화 에 따른 노화 부담증가는 대사성 질환, 스트레스 감수성, 프로게리아 증후군및 장애인 치유 7,^8을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 부분적으로는 수많은 노화관련 죽상동맥경화증, 골관절염, 근육변성, 궤양 형성, 및 알츠하이머병 9,^10,11,12,13. 노화 세포를 제거하는 것은 조직 기능 장애를 방지하거나 지연시키고 건강 기간을 연장하는 데 도움이 될 수 있습니다^14. 이는 형질전환 마우스 모델^{14,15,16뿐만} 아니라 약물 스크리닝 노력과 생물정보학 분석을 통해 발견된 세포용해 약물 및 약물 조합을 이용하여 나타났다. 경로는 노화 세포에서 특히 유도^{17,18,19,20,21,22.} 노화 세포 부담을 보다 효과적으로 줄일 수 있는 보다 최적의 세포 치료제를 식별하는 것은 건강한 노화를 위한 치료 접근법개발의 중요한 다음 단계입니다.

노화 세포는 배양 및 생체 내에서 특징적인 자형기능 및 분자 특징을 보여줍니다. 이 노화 마커는 이 세포에 있는 분자 변경의 원인 또는 노쇠 유도 또는 부산물 일 수 있었습니다. 그러나, 단 하나 마커는 노화 세포에서 구체적으로 찾아내지 않습니다. 현재, 노화 관련 β-갈락토시다아제(SA-β-Gal) 검출은 시험관내 및 생체 내 노화를 측정하는 가장 잘 특성화되고 확립된 단일 세포 기반 방법 중 하나이다. SA-β-Gal은 pH 4에서 최적의 효소 활성을 가진 리소좀 하이드로라제입니다. 노화 세포가 리소좀 활성이 증가하기 때문에 pH 6에서 의 활성을 측정하는 것이 가능하다^23,24. 살아있는 세포의 경우, 증가된 리소좀 pH는 백액olar H +-ATPase억제제 바필로마이신 A1 또는 내인대 산성화 억제제 클로로퀸^25,26을가진 리소좀 알칼리화에 의해 수득된다. 5-도데카노일아미노플루세신 디β-D-갈라코피라노사이드(C₁₂FDG)는 12개의 탄소 지질학적 모에티(25)로 인해 세포 내의 갈라진 생성물을 유지함에 따라 살아있는 세포에서 기질로서 사용된다. 중요한 것은, SA-β-Gal 활동 자체는 노화 세포에서 확인된 어떤 통로와도 직접 연결되지 않으며 노화를 유도하기 위하여 필요하지 않습니다. 이 분석으로, 노화 세포는 더 오래된 개별에게서 피부 생검과 같은 이기종 세포 인구 및 노화 조직에서조차 확인될 수 있습니다. 또한 여러 유기체 및 조건에서 노화 세포 검출을 위한 신뢰할 수 있는 마커로서 세포 노화와^노화(23) 사이의 상관관계를 보여주기 위해 사용되어^{왔다(27,28,29, 30}. 여기서, 높은 처리량 SA-β-Gal 스크리닝 분석기 는 1차마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 이용하여 1차 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 이용하여 형광기 판기 C 12FG를 기초로 하여 강력하고 산화적 스트레스 유도 된 세포 노화를 설명하며 그 장점과 단점을 설명한다. 논의됩니다. 이 분석법은 다른 세포 모형으로 행해질 수 있더라도, Ercc1-결핍, DNA 수선 손상MEFs의 사용은 산화 긴장의 조건 하에서 노화의 더 급속한 유도를 허용합니다. 마우스에서, DNA 수리 endonuclease ERCC1-XPF의 감소된 표현은 손상된 DNA 복구를 일으키는 원인이 되고, 내인성 DNA 손상의 가속한 축적, 상승된 ROS, 미토콘드리아 역기능, 증가된 노화 세포 부담, 줄기 세포 기능의 손실 및 조기 노화, 자연 노화와 유사^31,32. 유사하게, Ercc1-결핍MEFs는 배양^17에서더 빠르게 노화를 겪는다. 노화 MEF 분석의 중요한 특징은 각 우물은 노화 세포와 비 노화 세포의 혼합물을 가지고 있다는 것입니다, 노화 세포 특정 효과의 명확한 데모를 허용. 그러나, 우리는 노화를 유도하기 위하여 1 차적인 세포에 있는 산화 긴장의 사용이 더 생리적이라고 믿더라도, 이 분석은 또한 노화가 etoposide 또는 조사 같이 DNA 손상 에이전트로 유도되는 세포주로 이용될 수 있습니다.

프로토콜

동물 사용은 스크립스 플로리다 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.

1. 노화 뮤린 배아 섬유 아세포 (MEF)의 생성 – 12-15 일

1. 앞서^33일설명한 바와 같이 배아일 13일(E13)에서 임신한 암컷 마우스로부터 야생형 및 Ercc1--MEFs를 분리한다.
   참고 : 모든 다음 단계는 무균 조건하에서 멸균 기구를 사용하여 조직 배양 후드에서 수행됩니다.
2. 눈 위에 배아 머리를 절제.
3. 붉은 조직 (심장과 간)을 제거하고 필요한 경우 지질 형질 티핑에 사용하십시오.
4. Dulbecco의 수정 된 독수리의 매체 (DMEM)와 햄의 F10의 1:1 혼합물의 500 mL를 10 % 태아 소 혈청, 1 x 비필수 아미노산, 페니실린 및 스트렙 토미신을 성장 매체로 준비하고 각 사용 전에 약 15 분 동안 37 °C까지 따뜻하게하십시오. 4 °C에서 성장 매체를 저장합니다.
5. 배아의 나머지 부분을 0.25% 트립신/EDTA로 10분 동안 배양합니다.
6. 배아를 1mm 조각으로 잘라 내고 조직을 여러 번 위아래로 피펫합니다.
7. 10 cm 직경 세포 배양 판 당 하나의 배아의 성장 배지 및 판 조직 10 mL를 추가합니다 (통로 0).
8. 37 °C, 3% O2, 5% CO2에서 세포를 배양한다.
   참고: MEF 세포만이 이러한 조건하에서 코팅되지 않은 조직 배양판에 부착됩니다.
9. 첨부되지 않은 조직 및 세포 단편을 제거하기 위해 0구절에서 매일 배지를 변경합니다.
   참고 : 배아의 크기와 격리의 품질에 따라 세포는 일반적으로 2 ~ 3 일 후에 동주에 도달합니다.
10. 트립시니화
    1. 생육액을 조심스럽게 제거하고 10 mL의 10 mL로 세포를 2회 세척하였다.
    2. 0.025% 트립신/EDTA 용액 2mL를 10cm 직경의 플레이트의 세포에 넣고 37°C에서 2-3분 동안 배양합니다.
    3. 현미경으로 세포를 검사하여 세포가 표면에서 분리되어 있는지 확인하십시오.
    4. 동일한 양의 성장 배지를 추가하여 트립신 소화를 종료합니다.
    5. 세포를 원유관과 원심분리기 세포로 3분 동안 200 x g으로 옮기고 상한체를 버린다.
    6. 신선한 성장 매체에서 조심스럽게 세포를 다시 일시 중단하고 세포를 계산하고 투영 된 세포 밀도에서 새로운 플레이트에 씨앗을 뿌십시오.
11. 비노화 서브 재배의 경우 결합 세포를 1:4로 분할하고 3% O2, 37°C에서 다른 통로를 연장하여 더 많은 세포를 수율화한다(passage 1).
    참고: 이 시점에서 세포는 배양에서 유지되거나 액체 질소에서 나중에 사용하기 위해 저장될 수 있으며, 각각 약 1백만 개의 세포를 포함하는 저온 제거제에서 사용됩니다. 이 단계는 또한 단일 동물 분석에서 오는 가변성을 줄이기 위해 다른 동물로부터 세포의 혼합 배치를 생성할 수 있는 가능성을 제공한다.
12. 세포 노화를 유도하기 위해, 종자 분할 결합 세포는 1:4의 비율로 대강1로부터20% O2, 37°C, 5% CO2에서 3일 동안 배양하는 단계; 이러한 배양 조건은 산소에 대한 대기입니다.
    참고 : 주변 산소 농도하에서 세포와 배반포의 재배는 DNA 손상 복구가 손상 될 때 특히 세포 노화의 마커를 상승 시킬 수 있습니다^34,35,36.
13. 이 절차를 2개 더 반복합니다.
14. 세포 노화를 모니터링하기 위해, 고급 쿨터 세포 카운터 시스템을 사용하여 각 트립시니화 단계 동안 세포 직경과 세포 부피의 점진적 증가를 측정합니다.
15. 방정식을 사용하여 인구 두 배(PD)를 결정하여 세포 증식 감소를 평가합니다.
    PDT = (t₂-t 1)/3.32 x (log n₂ – log n₁₎
    참고: 인구 두 배로 시간은 노화가 없는 세포에 대해서만 사용되었습니다.
16. 초기 통로 야생형 또는Ercc1--MEF 세포를 3% O2, 37°C, 5% CO2에서 유지시킨 비노화 대조군 세포로 사용하였다.

2. 노화 관련 β-Gal 스크리닝 분석 – 2-3일

1. 테스트할 모든 약물의 DMSO에 10mMM 스톡 솔루션을 준비하고 -80°C에서 aliquots를 저장합니다. 이 약물의 활동을 줄일 수 있습니다 으로 재고 솔루션을 동결 해동 하지 마십시오.
   참고: 여기서, HSP90 억제제 17DMAG은 노화세포(17)를 특이적으로 사멸시킬수 있는 세포용해약물로 사용하였다.
2. 실험 당일, aliquot를 해동시키고, 신선한 배양 배지에서 약물을 희석시키고, 성장 배지에서 최종 농도를 산출하기 위해 1:1 비율로 컨디셔닝된 배지를 함유하는 세포에 첨가한다.
3. 직렬 희석 및 약물 조합에 96웰 사전 희석 플레이트를 사용하십시오.
   참고: MEF 세포의 경우, DMSO 농도가 2%를 초과해서는 안 되며, 사용된 DMSO 농도가 가장 높은 대조군 세포를 각 실행에 포함시켜야 한다는 것을 경험적으로 결정하였다.
4. 종자 5 x 10³ 노화 세포 또는 3 x 10³ 잘 96 웰 플레이트에서 잘 6 시간 성장 배지의 100 μL에서 치료 및 20 % O_2,37 ° C, 5 % CO2에서 배양.
   참고 : 세포는 치료 전에 약 80 %의 융합이어야합니다.
5. 형광 신호 크로스 토크 및 배경을 최소화하기 위해 검은 벽 / 명확한 바닥 조직 배양, 처리 96 웰 플레이트를 사용합니다.
   참고 : 그러나, 투명 플레이트도 성공적으로 테스트되었습니다.
6. MEF 세포에 약물 희석을 추가하고 20% O_2,37 °C, 5% CO2 조건 하에서 24 시간 에서 48 시간 동안 배양하십시오.
7. 노화 세포를 3% O2,37°C, 5% CO2 조건 이하로 유지하십시오.
8. 리소좀 알칼리화를 위해, 10 mM 바필로마이신 A1 용액을 준비하고, 알리쿼트를 하고 -20°C에서 냉동보관한다.
9. SA-β-Gal 활성의 형광 분석을 위해 2mMC₁₂FDG 스톡 솔루션을 준비하고 -20°C에 보관하고 빛으로부터 보호합니다.
10. 작업 용액의 경우, 실험 당일 성장 배지에 100 μM C₁₂FDG를 준비한다.
    참고 : C₁₂FDG와 관련된 모든 (인큐베이션) 단계는 어둠 속에서 수행해야합니다.
11. 약물 용액을 제거하고 1x PBS의 100 μL로 세포를 1 회 세척하십시오.
12. 100 nM 바필로마이신 A1 용액의 90 μL로 세포를 20% O2, 37°C, 5% CO2에서 1시간 동안 신선한 세포배양배지에 제조하여 리소좀 알칼리화를 유도한다.
13. 배양 배지(최종 농도 10 μM)에 10μL의 10μL을 100 μM C₁₂FDG 작업 용액을 추가합니다.
14. 2 시간 동안 세포를 배양하십시오.
15. 배양액에 100 μg/mL Hoechst 33342 염료(최종 농도 2 μg/mL)의 2 μL을 넣고 20분 동안 배양합니다.
16. 배지를 제거하고 신선한 성장 배지 100 μL을 추가합니다.

3. 정량적 고함량 형광 이미지 분석

1. 고함량 형광 이미지 수집 및 분석 플랫폼을 사용하여 Hoechst 및 C12FDG 형광(예: 각각 DAPI 및 FITC 채널 사전 설정)의 캡처에 적합한 두 채널에서 세포의 형광 이미지를 수집합니다.
   참고: 수집 프로토콜은 분석과 관련된 여러 변수의 정의가 필요합니다. 수집 프로토콜의 목적은 다운스트림 정량 분석을 위해 충분한 수의 세포의 적절한 수의 인포커스 형광 이미지를 캡처하는 것입니다.
2. 각 채널을 선택하고 하나 이상의 선택적 기준을 조정하여 각 채널의 관심 있는 기능으로 적합한 것을 정의하여 적절한 분석 프로토콜을 개발합니다.
   1. 핵의 경우, 형태학, 크기 및 신호를 포함한 여러 기준에 기초하여 세포 소기관의 식별을 허용하는 세분화 사전 세트 (예를 들어, 핵 분할, 소포 세분화, 세포절 세분화)를 사용하십시오. 강도. 이러한 기준을 조정하여 핵 파편과 파편을 배제하면서 신호를 가질 수 있지만, 예를 들어 핵이 되기에는 너무 크거나 너무 작습니다.
   2. C₁₂FDG로부터 형광이고 세포내 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성의 양을 나타내는 FITC 채널에서 신호를 확인한다.
      참고: 노화 세포는 비노화 세포보다 더 높은 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성을 갖는다; 그러나, C₁₂FDG 형광은 비이산 및 연속적일 것이며, C₁₂FDG 양성 및 C₁₂FDG 음성 세포로 간주되는 것 사이의 임계값의 확립을 필요로 한다.
   3. 시판되는 분석 소프트웨어를 사용하여 핵(추정 셀)을 둘러싼 정의된 영역이 임계값 C₁₂FDG 이상으로 적어도 한 번 중첩된 인스턴스 수를 생성합니다.
      참고: 분석 소프트웨어는 대상 연결을 사용하여 개수를 자동으로 생성합니다. 이것은 노화, C₁₂FDG 양성 세포의 분석의 실용적인 정의입니다.
3. 웰당 3-5개의 필드로 삼중의 모든 샘플을 분석하고 그에 따라 계산되는 평균 값 및 표준 편차를 분석합니다.
4. 다음 수식을 사용하여 노화 세포의 백분율을 계산합니다.
   노화 세포 (%) = x 100

4. 분석 검증 매개 변수

1. 모든 시료의 경우 변형내 및 분석 간 계수(%CV)를 다음 수식을 사용하여 계산했습니다.
   인트라 분석 CV (n = 한 실험에서 측정 된 10 회 반복) = x 100 (%)
   분석 간 CV (n = 5 개의 독립적 인 실험) = x 100 (%)
2. 스크리닝 목적을 위해, 20% O2, 37°C, 5% CO2(세포치료제에 대한 양성 대조군) 및 치료되지않은 200nM 라파마이신으로 처리된 세포로부터 분석의 품질을 평가하기 위한 Z' 값, 통계적 파라미터를 결정한다. 노화 세포 (음성 대조군).
   참고: Z'값은 장 외^37에따라 계산되었습니다. 0.5와 1 사이의 Z'값은 분석이 약물 스크리닝에 사용될 수 있음을 나타낸다.

결과

SA-β-Gal 활성은 복제고갈, 유전자 독성 및 산화 스트레스로부터 다양한 방법으로 노화하도록 유도되는 세포에서 종양유전자 활성화^23,25,38에검출될 수 있다. Ercc1-결핍마우스 배아 섬유아세포세포를 이용한 현재 모델에서, 노르목성 성장 조건(20% O2)은 몇 개의 대행을 위해 이들을 경작한 후 세포 ?...

토론

SA-β-Gal은 Dimri et al.에 의해 원래 발견된 세포 노화에 대한 잘 정의된 바이오마커입니다. (1995) 노화성 인간 섬유아세포가 증식 세포에 비해 pH 6^23에서 분석되었을 때 SA-β-Gal의 활성이 증가한다는 것을 보여준다. 한편, SA-β-Gal에 대한 생체외 및 생체내 분석기는 상이한 세포 유형 및 조직^25,39,40에대해 확?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013-CV	medium
Ham's F10	Gibco	12390-035	medium
fetal bovine serum	Tissue Culture Biologics	101	serum
1x non-essential amino acids	Corning	25-025-Cl	amino-acids
bafilomycin A1	Sigma	B1793	lysosomal inhibitor
C12FDG	Setareh Biotech	7188	b-Gal substrate
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	DNA intercalation agent
17DMAG	Selleck Chemical LLC	50843	HSP90 inhibitor
InCell6000 Cell Imaging System	GE Healthcare		High Content Imaging System