Evaluación de la virulencia y patogenia de la infección por Aeromonas en un modelo elegans de Caenorhabditis

Resumen

Aquí, presentamos tres diferentes experimentos para estudiar la infección por Aeromonas en C. elegans. Usando estos métodos convenientes, es fácil evaluar la toxicidad entre y dentro de las especies de Aeromonas .

Resumen

El patógeno humano Aeromonas se ha demostrado clínicamente para causar gastroenteritis, infecciones de heridas, septicemia y las infecciones del tracto urinario. Enfermedades más humanas se han divulgado para ser asociado de cuatro especies de bacterias: Aeromonas caviae, Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophilay Aeromonas veronii. El organismo modelo Caenorhabditis elegans es un bacterivore que proporciona un modelo de infección excelente por que estudiar la patogénesis bacteriana de Aeromonas. Aquí, presentamos tres diferentes experimentos para estudiar la infección por Aeromonas utilizando un modelo de C. elegans , incluyendo supervivencia, toxicidad líquida y ensayos de necrosis muscular. Los resultados de los tres métodos de determinación de la virulencia de Aeromonas eran constantes. A. dhakensis fue demostrado para ser el más tóxico entre las 4 principales especies de Aeromonas causando infecciones clínicas. Estos métodos aparecen para ser una forma conveniente para evaluar la toxicidad entre y dentro de las especies de Aeromonas y contribuir a la comprensión de la patogenia de la infección por Aeromonas .

Introducción

El patógeno humano, Aeromonas, se ha demostrado clínicamente para causar gastroenteritis, infecciones de heridas, septicemia y las infecciones de vías urinarias^1,2. Más enfermedades humanas asociadas se han divulgado para ser asociado a cuatro especies bacterianas: Aeromonas caviae , Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophilay Aeromonas veronii ^{2,3 , 4 , 5}. entre las enfermedades infecciosas Aeromonas , infecciones de tejidos blandos pueden causar morbilidad grave y mortalidad en los seres humanos. De nota, la necrosis del músculo es la forma más severa de infección de tejidos blandos⁶. Observación de la supervivencia y la necrosis del músculo de elegans de Caenorhabditis después de la infección es un método conveniente especular la toxicidad de Aeromonas.

Los científicos ya han desarrollado numerosos organismos modelo para estudiar las infecciones bacterianas. En estudios previos, ratones, zebrafishes y nemátodos se utilizaron como modelos animales para estudiar la patogénesis y virulencia de Aeromonas^6,7,8. Cada animal tiene su ' ventajas y aplicaciones. El organismo modelo Caenorhabditis elegans, es un nematodo de bacterivorous que las bacterias de las tomas como foodnaturally. C. elegansha desarrollado un complicado sistema inmune innato contra la infección bacteriana en el transcurso de su evolución. Bajo el estrés de una infección bacteriana, C. elegans ha demostrado para ser un modelo de infección excelente para el estudio de la patogenia bacteriana de Aeromonas^6,7,9 y otros patógenos como hongo¹⁰ y enterohemorrágica Escherichia coli O157: H7¹¹. Sin embargo, todavía hay ninguna publicación que se centra en la metodología en el uso de C. elegans como modelo para el estudio de la virulencia de Aeromonas.

Aquí, presentamos tres diferentes experimentos para estudiar la infección por Aeromonas con C. elegans como modelo animal: Análisis de supervivencia, líquida toxicidad y necrosis muscular. Estos métodos son una manera conveniente para evaluar la toxicidad entre y dentro de las especies de Aeromonas y mejorar la comprensión de la patogenesia de Aeromonas.

Protocolo

1. preparación de medio de cultivo

Nota: Ver tabla 1 para la preparación de la solución.

1. Para preparar el medio M9¹², disolver 1.5 g de KH₂PO₄, 5,66 g de Na₂HPO₄y 2.5 g de NaCl en 500 mL de agua desionizada. Autoclave a 121 ° C durante 20 min esperar hasta que haya enfriado a temperatura ambiente y añadir 0,5 mL de 1 M MgSO₄ antes del primer uso.
2. Para preparar el crecimiento de nematodos medio (NGM)¹², disolver 3 g de NaCl, 2.5 g peptona bacteriana y agar 20 g en 1 L de agua desionizada. Autoclave a 121 ° C durante 20 min esperar hasta que se enfríe a 55 ° C en un baño de agua y luego añadir 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de colesterol 5% en etanol y 25 mL de tampón fosfato. Agite para mezclar bien.
3. Vierta unos 5 mL de NGM en cada plato de Petri de 6 cm. Evitar la producción de burbujas en la superficie de la placa. Dejar las placas a temperatura ambiente durante 1 noche y paquete para guardar a 4 ° C. Llevar a temperatura ambiente antes de usar.
4. Para preparar enriquecido NGM (ENGM), disolver 3 g de NaCl, peptona bacteriana 5 g, 1 g extracto de levadura y agar de 30 g en 1 L de agua desionizada. Autoclave a 121 ° C durante 20 minutos a esperar hasta que se enfríe a 55 ° C en un baño de agua y agregar 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de colesterol 5% en etanol y 25 mL de tampón fosfato. Agite para mezclar bien.
5. Vierta aproximadamente 10 mL ENGM en cada plato de Petri de 9 cm. Evitar la producción de burbujas en la superficie de la placa. Dejar las placas a temperatura ambiente durante 1 noche y paquete para guardar a 4 ° C. Llevar a temperatura ambiente antes de usar.
6. Para preparar medio S¹², mezcla de citrato de potasio de 40 mL S Basal, 0,4 mL de 1 M, rastro de 0,4 mL metales solución 0,12 mL de 1 M CaCl₂, 0,12 mL de 1 M MgSO₄, 40 μl de colesterol 5% en etanol y 1 mL de 8 mM FudR antes de usar.

2. sincronización de C. elegans^6,9,12

1. Lave unos 2.000 lombrices en la etapa adulta grávida con 10 mL de agua desionizada estéril en un tubo de 15 mL. Lavar las bacterias 3 x mantener los gusanos en la parte inferior del tubo.
2. Centrifugar la muestra durante 1 minuto a 500 x g para tirar abajo los gusanos. Quite el sobrenadante y mantener los gusanos en 3,5 mL de agua desionizada.
3. Añadir 1 mL de NaOCl (10 – 15%) y 0.5 mL 5 M de KOH en el tubo. Mezcla uniformemente agitando para < 6 min a lyse los cuerpos del gusano.
4. Después se liberan los huevos de los gusanos, agregar 10 mL de agua desionizada para evitar la lisis. Centrifugar por 1 min a 1.200 x g tire hacia abajo de los huevos y retirar el sobrenadante tanto como sea posible. Lavar con 15 mL M9 media por lo menos 3 x.
   Nota: Véase el paso 1.1 para la composición del medio M9.
5. Mantener los huevos en medio M9 de 1 mL. Transporte de huevos en un plato de 3,5 cm para la incubación a 20 ° C por una noche (de 12 a 18 h).
   Nota: Después de la incubación, los huevos eclosionan para gusano de la larva que se llama como la primera etapa de la larva (L1).
6. Pipetear a 10 μl de gusanos L1 en medio M9. Contar el número de gusanos y calcular que la concentración de L1 gusanos en medio M9.
7. Semilla a más de 10.000 incubaron gusanos de fase L1 con una pipeta en una placa de 9 cm ENGM con Escherichia coli OP50.
   1. En este paso, propagación 0,5 mL cultivados durante la noche OP50 de e. coli con caldo de Luria-Bertani (LB) en la placa de 9 cm ENGM. Incubar la placa a 37 ° C durante 16-18 h.
      Nota: Para evitar la contaminación, el paso que se separa debe realizarse en una campana de flujo laminar.
   2. Enfriar a temperatura ambiente antes de sembrar lombrices de L1. Semilla a más de 10.000 incubaron gusanos de fase L1 de la placa de la ENGM con e. coli OP50.
8. Incubar los gusanos a 20 ° C durante 44 h o hasta que crecen a la etapa de larva (L4) 4 de^mayo .
   Nota: Consulte el paso 1.3 para la composición del medio ENGM. Un gusano tiene un punto blanco en forma de media luna en la mitad del lado del cuerpo en la etapa de L4.
9. Utilice el L4 sincronizado escenario gusanos en los siguientes ensayos. En el ensayo de supervivencia de C. elegans con Aeromonas dhakensis y el ensayo de toxicidad líquida de C. elegans con Aeromonas dhakensisgusanos uso salvaje tipo N2. Usar gusanos de RW1596 (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) en el ensayo de necrosis de músculo de C. elegans con Aeromonas dhakensis.

3. Análisis de supervivencia de C. elegans con Aeromonas^6,9

1. En el día de la siembra de lombrices de la L1 en la ENGM separarse con e. coli OP50, escoge una sola Colonia de cada una de las cuatro cepas de Aeromonas o e. coli OP50 cultura con 2 mL de caldo de libras respectivamente, a 37 ° C por 16 h.
   Nota: Para evitar la contaminación, este paso debe realizarse en una campana de flujo laminar. Aquí, se utilizaron las siguientes cepas bacterianas: Escherichia coli OP50, la alimentación normal de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, el primer completamente secuenciado patógenos clínicos dhakensis a. aislar. A. hydrophila A2-066, A2-007 a. veronii y a. caviae A2-9307121 son aislados clínicos representativo del National Cheng Kung University Hospital.
2. Medir la absorbancia de₆₀₀ OD de caldo bacteriano y ajustar el caldo bacteriano OD₆₀₀ = 2.0 con caldo LB.
3. Punto y extensión 30 μl de caldo bacteriano de cada placa NGM de 6 cm. La cultura las placas a temperatura ambiente durante la noche.
   Nota: Consulte el paso 1.2 para la composición del medio NGM.
4. En el día que los gusanos L1 crecen hasta la etapa de L4, aleatoriamente escoger y transferir 50 gusanos en una placa de NGM con cada una de las cuatro cepas de Aeromonas o e. coli OP50.
5. Incubar las placas NGM a 20 ° C hasta que termine el ensayo.
6. Transferir todos los gusanos de vida a una placa NGM recién preparada con bacterias y cuenta los números de viven, muerta, y sensor gusanos todos los días hasta el último gusano está muerto.
   Nota: Transferencia de gusanos a una placa NGM preparado fresco todos los días para el mantenimiento de la infección, aunque utilizando gusanos estériles (p. ej.glp-4, o con FudR).
7. Trazar las curvas de supervivencia basadas en el cálculo de datos diario.

4. ensayo de toxicidad líquida de C. elegans con Aeromonas⁷

Nota: Para evitar la contaminación, pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar.

1. El día después de la siembra de las lombrices de la L1 en la placa de la ENGM con e. coli OP50, escoge una sola Colonia de cada una de las cuatro cepas de Aeromonas y e. coli OP50, cultura con 5 mL de LB caldo cada a 37 ° C por 16 h.
   Nota: En el protocolo, se utilizaron las siguientes cepas de bacterias: e. coli OP50, la alimentación normal de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, el primer completamente secuenciado patógenos clínicos dhakensis a. aislar. A. hydrophila A2-066, A2-007 a. veronii y a. caviae A2-9307121 son aislados clínicos representativo del National Cheng Kung University Hospital.
2. Medir la absorbancia de₆₀₀ OD del caldo de las bacterias.
3. Centrifugar el caldo bacteriano a 3.500 x g durante 15 min quitar el caldo LB. Resuspender las bacterias y ajustar el caldo bacteriano OD₆₀₀ = 3.0 con medio S. Añadir 195 μl de caldo bacteriano en medio S a por lo menos 8 pocillos de una placa de 96 pocillos.
   Nota: Consulte el paso 1.6 para la composición del medio de S.
4. Lave los gusanos L4 en la placa ENGM con e. coli OP5 con medio M9. Ajustar la solución de gusano a una concentración de 5 gusanos por μl y añadir 5 μl de la solución de gusano a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Asegúrese de que hay aproximadamente 25 lombrices por pozo.
5. Incubar la placa de 96 pocillos en un agitador a 200 rpm a 25 ° C.
6. Contar el número de gusanos vivos y gusanos muertos después de 24, 48 y 72 h. calculan las tasas de supervivencia de cada pocillo con la siguiente fórmula: (Total gusanos vivos gusanos) × 100%.
7. Dibujar un gráfico de diagrama de dispersión con el cálculo diario de datos.

5. ensayo de Necrosis de músculo de C. elegans con Aeromonas⁶

Nota: Para evitar la contaminación, estos pasos deben realizarse en campana de flujo laminar.

1. En el día que los gusanos L1 se siembran en la ENGM extendido con e. coli OP50, escoge una sola Colonia de cada una de las cuatro cepas de Aeromonas y e. coli OP50 cultura con 2 mL LB caldo cada a 37 ° C por 16 h.
   Nota: Aquí, se utilizaron las siguientes cepas de bacterias: e. coli OP50, la alimentación normal de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, el primer completamente secuenciado patógenos clínicos dhakensis a. aislar. A. hydrophila A2-066, A2-007 a. veronii y a. caviae A2-9307121 son aislados clínicos representativo del National Cheng Kung University Hospital.
2. Medir la absorbancia de₆₀₀ OD del caldo de bacterias y ajustar el caldo de las bacterias a OD₆₀₀ = 2.0 con caldo LB. Punto y 30 μl de caldo bacteriano en las placas de NGM de 6 cm de extensión. La cultura las placas a temperatura ambiente durante la noche.
3. En el día los gusanos L1 crecen hasta la etapa de L4, transferencia 50 gusanos en cada placa de NGM con cada una de las cuatro cepas de Aeromonas o OP50 de e. coli . Incubar las placas NGM a 20 ° C. Transferencia de gusanos cada 24 h para placas NGM recién preparadas con bacterias.
4. Tomar imágenes músculo utilizando un microscopio de fluorescencia.
   1. Seleccionar al azar 10 gusanos en un gel de agarosa al 2% en medio M9 en un portaobjetos. Paraliza los gusanos con 2 μl de azida de sodio al 1% en medio M9 en agarosa para menos de 5 minutos antes de tomar imágenes.
   2. Coloque un cubreobjetos y capturar las imágenes de músculo con un verde filtro de proteínas fluorescentes (GFP) en un microscopio de fluorescencia con cámara de dispositivo de carga acoplada. Capturar las imágenes de músculo a las 24, 48 y 72 h post la etapa L4.
5. Realizar análisis y figura la preparación de imagen con un software de procesamiento de imágenes.
   Nota: Las definiciones de las puntuaciones y los niveles de daño muscular se muestran en la figura 3, para que los criterios son las siguientes: 3 puntos por falta de las fibras musculares; 2 puntos para las fibras de músculo rotas o quebradas; 1 punto para el doblado de las fibras musculares; 0 puntos para las fibras de músculo sanas.

6. estadísticos análisis

1. Realizar todos los experimentos un mínimo de tres veces de forma independiente.
2. Utilice el método de Kaplan-Meier para evaluar los ensayos de supervivencia de C. elegans y usar el test de log-rank en el análisis de las diferencias de supervivencia. Establecer significancia estadística al 0.05.
3. Utilizar la prueba t de Student para analizar los resultados estadísticos de los ensayos de toxicidad líquida de C. elegans a los dos grupos diferentes. Utilice la prueba ANOVA unidireccional en el análisis de las diferencias entre tres o más valores de una variable independiente. Establecer significancia estadística al 0.05.

Resultados

Siguiendo los protocolos descritos anteriormente, es fácil diferenciar la toxicidad de las cuatro cepas de Aeromonas . El ensayo de supervivencia de C. elegans se muestra en la figura 1. Las tasas de supervivencia de C. elegans infectados con especies de Aeromonas , se muestra en la orden de alta a la baja fueron: a. caviae, a. veronii y a. hydrophila y a. dhakensis. Aunque existe diversidad en cuanto a l...

Discusión

C. elegans es un nematodo de bacterivorous que naturalmente las bacterias de las tomas como alimento y ha desarrollado una inmunidad innata complicado a las bacterias durante su proceso evolutivo. Dos de los principales órganos mantener y apoyar la inmunidad son la epidermis y el intestino^9,13. La epidermis y bandas de músculo de C. elegans se asemejan a las estructuras de tejido blando en los mamíferos y los seres humanos^6<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shaker incubator	YIH DER	LM-570R	Bacteria incubation
K2HPO4	J.T.Baker	MP021519455	Culture medium preparation
KH2PO4	J.T.Baker	3246-05	Culture medium preparation
Na2HPO4	J.T.Baker	MP021914405	Culture medium preparation
NaCl	SIGMA	31434	Culture medium preparation
MgSO4	SIGMA	M7506	Culture medium preparation
agar	Difco	214530	Culture medium preparation
CaCl2	SIGMA	C1016	Culture medium preparation
cholesterol	SIGMA	C8503	Culture medium preparation
ethanol	SIGMA	32205	Culture medium preparation
KOH	SIGMA	P5958	Culture medium preparation
6 cm Petri plate	ALPHA PLUS	46	agar plate preparation
96-well plate	FALCON	353072	liquid assay
bacterial peptone	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Culture medium preparation
yeast extract	SIGMA	92144	Culture medium preparation
citric acid•H2O	SIGMA	C1909	Culture medium preparation
tri-potassium citrate•H2O	SIGMA	104956	Culture medium preparation
FudR	SIGMA	1271008	Culture medium preparation
disodium EDTA	SIGMA	E1644	Culture medium preparation
FeSO4•7 H2O	SIGMA	215422	Culture medium preparation
MnCl2•4 H2O	SIGMA	221279	Culture medium preparation
ZnSO4•7 H2O	SIGMA	204986	Culture medium preparation
CuSO4•5 H2O	SIGMA	C8027	Culture medium preparation
tryptone	SIGMA	16922	Culture medium preparation
Microscope system	Nikon	Eclipase Ti inverted	microscope imaging
Scientific CCD Camera	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	microscope imaging