Avaliando virulência e patogênese da infecção por Aeromonas em um modelo de Caenorhabditis elegans

Resumo

Aqui, apresentamos três experimentos diferentes para estudar Aeromonas infecção em c. elegans. Usando estes métodos convenientes, é fácil avaliar a toxicidade entre e dentro de espécies de Aeromonas .

Resumo

O patógeno humano Aeromonas tem demonstrado clinicamente para causar gastroenterite, infecções de ferida, septicemia e infecções do trato urinário. Doenças humanas mais foram relatadas para ser associado com quatro espécies de bactérias: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniie Aeromonas caviae. O organismo modelo Caenorhabditis elegans é um bacterivore que fornece um modelo de infecção excelente por que estudar a patogênese bacteriana de Aeromonas. Aqui, apresentamos três experimentos diferentes para estudar Aeromonas infecção usando um modelo de c. elegans , incluindo ensaios de necrose muscular, toxicidade líquida e sobrevivência. Os resultados dos três métodos de determinar a virulência de Aeromonas foram consistentes. A. dhakensis foi mostrado para ser o mais tóxico entre as 4 espécies de Aeromonas principais causando infecções clínicas. Esses métodos são mostrados para ser uma maneira conveniente para avaliar a toxicidade entre e dentro de espécies de Aeromonas e contribuir para a nossa compreensão da patogênese da infecção por Aeromonas .

Introdução

O patógeno humano, Aeromonas, tem demonstrado clinicamente causar gastroenterite, infecções de ferida, septicemia e infecções de aparelho urinário^1,2. Doenças humanas mais associadas foram relatadas para ser associado com quatro espécies bacterianas: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniie Aeromonas caviae ^{2,3 , 4 , 5}. entre as doenças infecciosas Aeromonas , infecções de tecidos moles podem causar grave morbidade e mortalidade em seres humanos. De nota, necrose muscular é a forma mais grave da infecção de tecidos moles⁶. Observação da sobrevivência e necrose muscular de Caenorhabditis elegans após a infecção são um método conveniente especular a toxicidade de Aeromonas.

Cientistas já desenvolveram numerosos organismos modelo para estudar a infecções bacterianas. Em estudos anteriores, nematoides, zebrafishes e ratos foram usados como modelos animais para estudar a patogênese e a virulência de Aeromonas^6,7,8. Cada modelo animal tem suas ' vantagens e aplicações. O organismo modelo, Caenorhabditis elegans, é um nematódeo bacterivorous bactérias que aportes como foodnaturally. C. elegansdesenvolveu um complexo sistema imune inato contra infecção bacteriana ao longo de sua evolução. Sob o estresse da infecção bacteriana, c. elegans tem provado para ser um modelo de infecção excelente para estudar a patogênese bacteriana de Aeromonas^6,7,9 e outros patógenos como o fungo¹⁰ e enterohemorrágicas Escherichia coli O157: H7¹¹. No entanto, não há ainda nenhuma publicação que enfoca a metodologia em usando o c. elegans como modelo para o estudo da virulência de Aeromonas.

Aqui, apresentamos três experimentos diferentes para estudar Aeromonas infecção usando c. elegans como modelo animal: ensaios para a sobrevivência, toxicidade líquida e necrose muscular. Esses métodos são uma maneira conveniente para avaliar a toxicidade entre e dentro de espécies de Aeromonas e melhorar a compreensão da patogênese de Aeromonas.

Protocolo

1. preparação do meio de cultura

Nota: Consulte a tabela 1 para preparação da solução.

1. Para preparar o M9 médio¹², dissolva 1,5 g de KH₂PO₄, 5,66 g de Na₂HPO₄e 2,5 g de NaCl em 500 mL de água desionizada. Autoclave a 121 ° C por 20 min. espere até a temperatura de refrigeração e em seguida, adicionar 0,5 mL de 1 M MgSO₄ antes da primeira utilização.
2. Para preparar o nematódeo crescimento médio (NGM)¹², dissolva 3 g de NaCl, peptona bacteriana 2,5 g e ágar 20 g em 1 L de água desionizada. Autoclave a 121 ° C por 20 min. espere até a 55 ° C, em banho de água de refrigeração e em seguida, adicione 1 mL de 1 M CaCl₂, 1ml de 1m MgSO₄, 1ml de colesterol de 5% em etanol e 25 mL de tampão fosfato. Redemoinho para misturar bem.
3. Despeje cerca de 5 mL NGM em cada placa de Petri de 6cm. Evite a produção de bolhas na superfície da placa. Deixar as placas em temperatura ambiente por 1 noite e pacote para salvar a 4 ° C. Trazer de volta à temperatura ambiente antes do uso.
4. Para preparar NGM enriquecido (ENGM), dissolva 3 g NaCl, bacteriana peptona 5g, extrato de levedura 1 g e 30 g ágar-ágar em 1L de água desionizada. Autoclave a 121 ° C por 20 min. espere até a 55 ° C, em banho de água de refrigeração e adicionar 1 mL de 1 M CaCl₂, 1ml de 1m MgSO₄, 1ml de colesterol de 5% em etanol e 25 mL de tampão fosfato. Redemoinho para misturar bem.
5. Despeje cerca de 10 mL ENGM em cada placa de Petri de 9 cm. Evite a produção de bolhas na superfície da placa. Deixar as placas em temperatura ambiente por 1 noite e pacote para salvar a 4 ° C. Trazer a temperatura ambiente antes do uso.
6. Para preparar o S médio¹², misture o citrato de potássio 40 mL S Basal, 0,4 mL 1m, rastreamento de 0,4 mL metais solução, 0,12 mL de 1 M CaCl₂, 0,12 mL de 1m MgSO₄, 40 µ l de colesterol de 5% em etanol e 1 mL de 8mm FudR antes do uso.

2. sincronização de c. elegans^6,9,12

1. Lavagem de cerca de 2.000 vermes no estágio adulto gravid com 10 mL de água desionizada estéril em um tubo de 15 mL. Lave as bactérias 3 x, mantendo as minhocas no fundo do tubo.
2. Centrifugar a amostra para 1 min a 500 x g a puxar para baixo os vermes. Remover o sobrenadante e manter os vermes em 3,5 mL de água desionizada.
3. Adicione 1 mL de NaOCl (10 – 15%) e 0,5 mL 5 M KOH dentro do tubo. Mistura uniformente agitando para < 6 min para lisar os corpos de verme.
4. Depois que os ovos são liberados do vermes, adicione 10 mL de água desionizada para parar a Lise. Centrífuga para 1 min a 1.200 x g para puxar para baixo os ovos e retire o máximo possível de sobrenadante. Lavar com 15 mL M9 médio pelo menos 3x.
   Nota: Consulte a etapa 1.1 para a composição do meio de M9.
5. Manter os ovos em média 1 mL M9. Transporte de ovos para um prato de 3,5 cm para incubação a 20 ° C por uma noite (cerca de 12 a 18 h).
   Nota: Após a incubação, os ovos eclodirão para verme larva que é chamado como primeira fase de larva (L1).
6. Pipetar para fora 10 µ l de vermes L1 M9 médio. Contar o número de verme e calcular que a concentração de L1 worms na M9 médio.
7. Sementes no máximo 10.000 incubadas vermes de fase L1 com uma pipeta num prato de ENGM 9cm espalhar com Escherichia coli OP50.
   1. Nesta etapa, propagação de 0,5 mL durante a noite culto OP50 de Escherichia coli com caldo Luria-Bertani (LB) na placa ENGM de 9 cm. Incubar a placa a 37 ° C para 16 – 18 h
      Nota: Para evitar a contaminação, a etapa de propagação deve ser executada em uma capa de fluxo laminar.
   2. Arrefecer à temperatura ambiente antes da semeadura L1 vermes. Sementes no máximo 10.000 incubadas vermes de fase L1 na placa com e. coli OP50 ENGM.
8. Incube os vermes a 20 ° C por 44 h ou até que eles crescem para a fase de larva (L4) 4^th .
   Nota: Consulte a etapa 1.3 para a composição do meio ENGM. Uma minhoca tem um ponto branco em forma de meia lua no meio do lado do corpo, na fase de L4.
9. Use o L4 sincronizado palco vermes em ensaios a seguir. Use o tipo selvagem que N2 vermes no ensaio de sobrevivência de c. elegans com Aeromonas dhakensis e o ensaio de toxicidade líquido c. elegans com Aeromonas dhakensis. Usar RW1596 vermes (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) no ensaio de necrose muscular de c. elegans com Aeromonas dhakensis.

3. ensaio de sobrevivência c. elegans com Aeromonas^6,9

1. No dia da propagação de worms de L1 no ENGM espalhando com Escherichia coli OP50, escolha uma única colônia de cada uma das quatro cepas de Aeromonas ou Escherichia coli OP50 e cultura com caldo LB 2 mL respectivamente em 37 ° C, durante 16 h.
   Nota: Para evitar contaminação, esta etapa deve ser executada em uma capa de fluxo laminar. Aqui, as seguintes estirpes bacterianas foram usadas: OP50 de Escherichia coli , a fonte de alimentação normal de C. elegans. A. dhakensis AAK1, o primeiro totalmente sequenciado patogénicos clínica dhakensis a. isolar. A. hydrophila A2-9307121 da . caviae , a. veronii A2-007 e A2-066 são isolados clínicos representativa do Nacional Cheng Kung University Hospital.
2. Medir a absorvância de₆₀₀ OD do caldo bacteriano e ajustar o caldo bacteriano para OD₆₀₀ = 2.0 com caldo LB.
3. Local e espalhar 30 µ l de caldo bacteriano cada placa NGM de 6 cm. Cultura as placas à temperatura ambiente durante a noite.
   Nota: Consulte a etapa 1.2 para a composição do meio NGM.
4. No dia que os vermes L1 crescem para a fase de L4, aleatoriamente escolher e transferir 50 vermes para uma placa NGM com cada uma das quatro cepas de Aeromonas ou Escherichia coli OP50.
5. Incube as placas NGM a 20 ° C até que esteja terminado o ensaio.
6. Transferi todos os vermes vivos para uma placa NGM recém preparada com bactérias e contar os números da vivem, morto, e sensor worms todos os dias até o último worm está morto.
   Nota: Transferir vermes em uma chapa de NGM preparada fresca todos os dias para a manutenção da infecção, mesmo se usando minhocas estéril (por exemploBPL-4, ou com FudR).
7. Traça as curvas de sobrevivência baseadas o cálculo diário de dados.

4. ensaio de toxicidade líquido c. elegans com Aeromonas⁷

Nota: Para evitar contaminação, as etapas devem ser executadas em uma capa de fluxo laminar.

1. O dia após a semeadura os vermes de L1 na placa ENGM espalhar com Escherichia coli OP50, escolher uma única colônia de cada uma das quatro cepas de Aeromonas e e. coli OP50 e cultura com 5 mL caldo LB cada a 37 ° C durante 16 h.
   Nota: No protocolo, as seguintes estirpes de bactérias foram usadas: OP50 de Escherichia coli , a fonte de alimentação normal de C. elegans. A. dhakensis AAK1, o primeiro totalmente sequenciado patogénicos clínica dhakensis a. isolar. A. hydrophila A2-9307121 da . caviae , a. veronii A2-007 e A2-066 são isolados clínicos representativa do Nacional Cheng Kung University Hospital.
2. Medir a absorvância de₆₀₀ OD do caldo de bactérias.
3. Centrifugue o caldo bacteriano em 3.500 x g durante 15 min remover o caldo LB. Resuspenda as bactérias e ajustar o caldo bacteriano para OD₆₀₀ = 3.0 com média de S. Adicione 195 µ l de caldo bacteriano no meio de S para pelo menos 8 poços de uma placa de 96 poços.
   Nota: Consulte a etapa 1.6 para a composição do meio de S.
4. Lave os vermes L4 na placa ENGM com Escherichia coli OP5 usando M9 médio. Ajustar a solução worm a uma concentração de 5 vermes por µ l e adicionar 5 µ l da solução de verme a cada poço da placa de 96 poços. Certifique-se de que existem aproximadamente 25 vermes por bem.
5. Incubar a placa de 96 poços, um agitador a 200 rpm a 25 ° C.
6. Contar o número de vermes vivos e vermes mortos após 24, 48 e 72 h. calcular as taxas de sobrevivência de cada poço com a seguinte fórmula: (vermes vermes ao vivo/Total) × 100%.
7. Desenhe um gráfico de plotagem de dispersão com o cálculo de dados diários.

5. ensaio de necrose muscular c. elegans com Aeromonas⁶

Nota: Para evitar contaminação, estas etapas devem ser executadas em uma capa de fluxo laminar.

1. No dia que os vermes L1 são semeados sobre o ENGM espalhar com Escherichia coli OP50, escolha uma única colônia de cada uma das quatro cepas de Aeromonas e e. coli OP50 e cultura com 2ml LB caldo cada a 37 ° C durante 16 h.
   Nota: Aqui, utilizaram-se os seguintes estirpes de bactérias: Escherichia coli OP50, a fonte de alimentação normal de C. elegans. A. dhakensis AAK1, o primeiro totalmente sequenciado patogénicos clínica dhakensis a. isolar. A. hydrophila A2-9307121 da . caviae , a. veronii A2-007 e A2-066 são isolados clínicos representativa do Nacional Cheng Kung University Hospital.
2. Medir a absorvância de₆₀₀ OD do caldo de bactérias e ajustar o caldo de bactérias para OD₆₀₀ = 2.0 com caldo LB. Local e espalhar 30 µ l de caldo bacteriano em placas de 6 cm NGM. Cultura as placas à temperatura ambiente durante a noite.
3. No dia os vermes L1 crescem para a fase de L4, transferência 50 vermes para cada placa NGM com cada uma das quatro cepas de Aeromonas ou Escherichia coli OP50. Incubar as placas NGM a 20 ° C. Transferência de vermes cada 24h para placas NGM recentemente preparadas com bactérias.
4. Com imagens de músculo usando um microscópio de fluorescência.
   1. Escolha aleatoriamente 10 minhocas em um gel de agarose 2% médio e M9 em um slide. Paralise os vermes usando 2 µ l de azida de sódio 1% médio e M9 em agarose para menos de 5 min antes de tomar imagens.
   2. Coloque uma lamínula e capturar as imagens de músculo usando um verde proteína fluorescente (GFP) filtrar em um microscópio fluorescente com a câmera do dispositivo de carga acoplada. Capturar as imagens de músculo em 24, 48 e 72 h pós fase de L4.
5. Realizar análise e figura preparação de imagem com uma software de processamento de imagem.
   Nota: As definições das pontuações e os níveis de dano do músculo são mostradas na Figura 3, para o qual os critérios são listados a seguir: 3 pontos por falta fibras musculares; 2 pontos para fibras de músculo rompidos ou quebrados; 1 ponto para dobrado fibras musculares; 0 pontos para fibras de músculo saudáveis.

6. estatísticas análises

1. Todos os experimentos, independentemente realize um mínimo de três vezes.
2. Use o método de Kaplan-Meier para avaliar os ensaios de sobrevivência de c. elegans e use o teste log-rank ao analisar as diferenças de sobrevivência. Conjunto de significância estatística em 0,05.
3. Use o teste t de Student para analisar os resultados estatísticos dos ensaios de toxicidade líquido elegans do c. para os dois grupos diferentes. Use o teste de ANOVA One-Way em analisar as diferenças entre três ou mais valores para uma variável independente. Conjunto de significância estatística em 0,05.

Resultados

Seguindo os protocolos descritos acima, é fácil diferenciar entre as toxicidades das quatro cepas de Aeromonas . O ensaio de sobrevivência de c. elegans é mostrado na Figura 1. Foram as taxas de sobrevivência de c. elegans infectados com espécies de Aeromonas , mostrados na ordem de cima para baixo: a. caviae, a. veronii, a. hydrophila e a. dhakensis. Embora haja diversidade em termos de toxicidade e...

Discussão

C. elegans é um nematódeo bacterivorous que naturalmente bactérias aportes como alimento e desenvolveu uma complicado imunidade inata às bactérias durante o seu processo evolutivo. Dois dos principais órgãos manter e apoiar a imunidade são a epiderme e o intestino^9,13. A epiderme e bandas do músculo de c. elegans assemelham-se as estruturas de tecidos moles em mamíferos e humanos⁶. Por causa destas característi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shaker incubator	YIH DER	LM-570R	Bacteria incubation
K2HPO4	J.T.Baker	MP021519455	Culture medium preparation
KH2PO4	J.T.Baker	3246-05	Culture medium preparation
Na2HPO4	J.T.Baker	MP021914405	Culture medium preparation
NaCl	SIGMA	31434	Culture medium preparation
MgSO4	SIGMA	M7506	Culture medium preparation
agar	Difco	214530	Culture medium preparation
CaCl2	SIGMA	C1016	Culture medium preparation
cholesterol	SIGMA	C8503	Culture medium preparation
ethanol	SIGMA	32205	Culture medium preparation
KOH	SIGMA	P5958	Culture medium preparation
6 cm Petri plate	ALPHA PLUS	46	agar plate preparation
96-well plate	FALCON	353072	liquid assay
bacterial peptone	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Culture medium preparation
yeast extract	SIGMA	92144	Culture medium preparation
citric acid•H2O	SIGMA	C1909	Culture medium preparation
tri-potassium citrate•H2O	SIGMA	104956	Culture medium preparation
FudR	SIGMA	1271008	Culture medium preparation
disodium EDTA	SIGMA	E1644	Culture medium preparation
FeSO4•7 H2O	SIGMA	215422	Culture medium preparation
MnCl2•4 H2O	SIGMA	221279	Culture medium preparation
ZnSO4•7 H2O	SIGMA	204986	Culture medium preparation
CuSO4•5 H2O	SIGMA	C8027	Culture medium preparation
tryptone	SIGMA	16922	Culture medium preparation
Microscope system	Nikon	Eclipase Ti inverted	microscope imaging
Scientific CCD Camera	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	microscope imaging