Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas Infektion in einem Caenorhabditis Elegans -Modell

Zusammenfassung

Hier stellen wir drei verschiedene Experimente zur Aeromonas Infektion in C. Eleganszu studieren. Mit diesen praktischen Methoden, ist es leicht, die Toxizität unter und innerhalb der Aeromonas Arten zu bewerten.

Zusammenfassung

Der menschliche Krankheitserreger Aeromonas nachweislich klinisch Gastroenteritis, Wundinfektionen, Sepsis und Infektionen der Harnwege verursachen. Die meisten menschliche Krankheiten gemeldet wurden, vier Arten von Bakterien zugeordnet werden: Aeromonas Dhakensis, Aeromonas Hydrophila, Aeromonas Veroniiund Aeromonas Caviae. Der Modellorganismus Caenorhabditis Elegans ist eine Bacterivore, die eine ausgezeichnete Infektionsmodell durch, um die bakterielle Pathogenese der Aeromonaslernen bietet. Hier stellen wir drei verschiedene Experimente zur Aeromonas Infektion mit C. Elegans -Modell, einschließlich überleben, flüssige Toxizität und Muskel Nekrose Assays zu studieren. Die Ergebnisse der drei Methoden, die Bestimmung der Virulenz der Aeromonas entsprachen. A. Dhakensis zeigte sich der giftigsten unter den 4 wichtigsten Aeromonas Arten klinische Infektionen verursachen werden. Diese Methoden erweisen sich als eine bequeme Möglichkeit zum Bewerten der Toxizität unter und innerhalb der Arten Aeromonas und dazu beitragen, unser Verständnis der Pathogenese der Aeromonas Infektion.

Einleitung

Der menschliche Krankheitserreger Aeromonas, nachweislich klinisch Gastroenteritis, Wundinfektionen, Sepsis und Harnwege Infektionen^1,2verursachen. Die meisten menschlichen Erkrankungen gemeldet wurden, vier bakteriellen Spezies zugeordnet werden: Aeromonas Dhakensis, Aeromonas Hydrophila, Aeromonas Veroniiund Aeromonas Caviae ^{2,3 , 4 , 5}. unter den Infektionskrankheiten Aeromonas , Weichgewebe Infektionen können schwerer Morbidität und Mortalität beim Menschen auslösen. Muskel Nekrose ist hervorzuheben die schwerste Form von Weichgewebe-Infektion-⁶. Beobachtung des Überlebens und Muskel Nekrose von Caenorhabditis Elegans nach der Infektion ist eine bequeme Methode, um die Toxizität von Aeromonasspekulieren.

Wissenschaftler haben bereits zahlreiche Modellorganismen um bakterielle Infektionen zu studieren entwickelt. In früheren Studien wurden Mäuse, Zebrafishes und Nematoden Tiermodelle zur Untersuchung der Pathogenese und Virulenz von Aeromonas^6,7,8. Jedes Tier-Modell hat seine "Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten. Der Modellorganismus Caenorhabditis Elegansist eine Bacterivorous-Nematode welche Aufnahme-Bakterien als Foodnaturally. C. Eleganshat eine komplizierte angeborene Immunsystem gegen bakterielle Infektion im Laufe seiner Evolution entwickelt. Unter dem Druck der bakteriellen Infektion hat C. Elegans erwiesen eine ausgezeichnete Infektionsmodell, die bakterielle Pathogenese von Aeromonas^6,7,9 und anderen Krankheitserregern zu studieren wie Pilz¹⁰ und enterohämorrhagische Escherichia coli O157: H7¹¹. Allerdings gibt es noch keine Publikation, die auf die Methodik im Umgang mit C. Elegans als Modell für das Studium der Virulenz der Aeromonaskonzentriert.

Hier stellen wir drei verschiedene Experimente zur Untersuchung der Aeromonas Infektion mit C. Elegans als Tiermodell: Assays für überleben, flüssige Toxizität und Muskel Nekrose. Diese Methoden sind eine bequeme Möglichkeit, die Toxizität unter und innerhalb der Arten Aeromonas bewerten und verbessern das Verständnis der Pathogenese der Aeromonas.

Protokoll

1. Vorbereitung des Kulturmediums

Hinweis: Siehe Tabelle 1 für die Vorbereitung der Lösung.

1. Um M9 Medium¹²vorzubereiten, lösen Sie 1,5 g KH₂PO₄, 5,66 g Na₂HPO₄und 2,5 g NaCl in 500 mL entionisiertem Wasser auf. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. warten, bis auf Raumtemperatur abgekühlt und dann hinzufügen 0,5 mL 1 M MgSO₄ vor dem ersten Gebrauch.
2. Lösen sich um Nematoden Wachstum Medium (NGM)¹²vorzubereiten, 3 g NaCl, bakterielle Pepton 2,5 g und 20 g Agar in 1 L deionisiertes Wasser. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. warten, bis zu 55 ° C im Wasserbad abgekühlt und dann fügen Sie 1 mL 1 M CaCl₂, 1 mL 1 M MgSO₄, 1 mL 5 % Cholesterin in Ethanol und 25 mL Phosphatpuffer. Wirbel um gut zu mischen.
3. Gießen Sie etwa 5 mL NGM in je 6 cm Petrischale. Blase-Produktion auf der Oberfläche der Platte zu vermeiden. Lassen Sie Platten bei Raumtemperatur für 1 Nacht und Paket, sparen bei 4 ° C. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen.
4. Um angereichertes NGM (ENGM) vorzubereiten, lösen Sie bakterielle Pepton 5 g, 3 g NaCl, 1 g Hefeextrakt und 30 g Agar in 1 L deionisiertes Wasser. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. warten, bis zu 55 ° C im Wasserbad abgekühlt, und fügen Sie 1 mL 1 M CaCl₂, 1 mL 1 M MgSO₄, 1 mL 5 % Cholesterin in Ethanol und 25 mL Phosphatpuffer. Wirbel um gut zu mischen.
5. Gießen Sie etwa 10 mL ENGM in je 9 cm Petrischale. Blase-Produktion auf der Oberfläche der Platte zu vermeiden. Lassen Sie Platten bei Raumtemperatur für 1 Nacht und Paket, sparen bei 4 ° C. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen.
6. S mittlerer¹²vorbereiten, mischen Sie 40 mL S Basal, 0,4 mL 1 M Kalium Citrat, Metalle 0,4 mL Trace Lösung, 0,12 mL 1 M CaCl₂, 0,12 mL 1 M MgSO₄, 40 µL 5 % Cholesterin in Ethanol und 1 mL 8 mM FudR vor Gebrauch.

(2) Synchronisierung von C. Elegans^6,9,12

1. Waschen Sie etwa 2.000 Würmer in der trächtigen Erwachsenen-Bühne mit 10 mL sterile deionisiertes Wasser in einer 15 mL Tube. Waschen Sie die Bakterien 3 x, die Würmer an der Unterseite des Rohres zu halten.
2. Zentrifugieren der Probe 1 min. bei 500 X g nach unten die Würmer ziehen. Entfernen Sie den Überstand zu, und halten Sie die Würmer in 3,5 mL entionisiertem Wasser.
3. Fügen Sie 1 mL NaOCl (10 – 15 %) und 0,5 mL 5 M KOH in die Röhre. Mischung gleichmäßig durch Schütteln für < 6 min um die Wurm-Körper zu lösen.
4. Nachdem die Eier von den Würmern freigesetzt werden, fügen Sie 10 mL entionisiertem Wasser um die Zerstörung zu stoppen. Zentrifuge für 1 min bei 1.200 X g herunterziehen der Eier und den überstand so weit wie möglich zu entfernen. Waschen Sie mit mittlerer mindestens 3 X 15 mL M9.
   Hinweis: Siehe Schritt 1.1 für die Zusammensetzung der M9 Medium.
5. Halten Sie die Eier in 1 mL M9 Medium. Eier in eine 3,5 cm Schale für die Inkubation bei 20 ° C für eine Nacht (ca. 12 – 18 h) zu transportieren.
   Hinweis: Nach der Inkubation schlüpfen die Eier um Larven Wurm, die als erste Stufe der Larve (L1) genannt wird.
6. Pipette, 10 µL L1 Würmer in M9 Medium. Die Wurm-Anzahl und berechnen Sie die Konzentration der L1 in M9 Medium Würmer.
7. Samen höchstens 10.000 inkubiert L1 Stadium Würmer mit einem Pipettieren auf einem 9 cm ENGM Teller mit Escherichia coli OP50 zu verbreiten.
   1. In diesem Schritt kultiviert Ausbreitung 0,5 mL über Nacht E. Coli OP50 mit Luria-Bertani (LB) Brühe auf dem Teller 9 cm ENGM. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 16 – 18 h
      Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, sollte die Verbreitung Schritt in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
   2. Vor der Aussaat L1 Würmer auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Samen höchstens 10.000 inkubiert L1 Stadium Würmer auf dem ENGM Teller mit E. Coli OP50.
8. Inkubieren Sie die Würmer bei 20 ° C für 44 h oder bis sie auf die 4^th (L4) Larvenstadium wachsen.
   Hinweis: Siehe Punkt 1.3 für die Zusammensetzung des Mediums ENGM. Ein Wurm ist einen weißen Punkt in Halbmond-Form in der Mitte der Körperseite in der L4-Stadium.
9. Verwenden Sie die synchronisierten L4 Stadium in den folgenden Tests Würmer. Verwendung Wildtyp N2 Würmer in C. Elegans überleben Assay mit Aeromonas Dhakensis und C. Elegans flüssige Toxizität Assay mit Aeromonas Dhakensis. Verwenden Sie RW1596 Würmer (myo-3(st386); stEx30 [Myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) in C. Elegans Muskel Nekrose Assays mit Aeromonas Dhakensis.

3. C. Elegans überleben Assay mit Aeromonas^6,9

1. Am Tag der Aussaat L1 Würmer auf die Ausbringung mit E. Coli OP50 ENGM wählen Sie eine einzelne Kolonie von jeder der vier Stämme von Aeromonas oder E. Coli OP50 und Kultur mit 2 mL LB Brühe bzw. bei 37 ° C 16 h.
   Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, sollte dieser Schritt in einem Laminar-Flow-Abzug durchgeführt werden. Hier die folgenden Bakterienstämme wurden verwendet: E. Coli OP50, die normalen Nahrungsquelle von C. Elegans. A. Dhakensis AAK1, der ersten vollständig sequenziert pathogenen klinische A. Dhakensis isolieren. A. Hydrophila A2-066, A. Veronii A2-007 und A. Caviae A2-9307121 sind repräsentativ klinischen Isolaten von National Cheng Kung University Hospital.
2. Messen die OD₆₀₀ Extinktion der bakteriellen Brühe und passen Sie die bakterielle Brühe auf OD₆₀₀ = 2,0 mit LB Brühe.
3. Vor Ort und 30 µL bakterielle Brühe jeder 6 cm NGM Platte zu verbreiten. Die Platten bei Raumtemperatur über Nacht Kultur.
   Hinweis: Siehe Schritt 1.2 für die Zusammensetzung der NGM Medium.
4. Am Tag wachsen die L1-Würmer auf die L4-Bühne, nach dem Zufallsprinzip wählen und auf eine NGM-Platte mit jedem der vier Stämme von Aeromonas oder E. Coli OP50 50 Würmer übertragen.
5. Inkubieren Sie die NGM-Platten bei 20 ° C, bis der Test abgeschlossen ist.
6. Übertragen Sie die lebenden Würmer auf einen neu vorzubereitenden NGM Teller mit Sensor Würmer, Bakterien und Count die Anzahl der Leben, tot, jeden Tag, bis der letzte Wurm tot ist.
   Hinweis: Übertragen Würmer auf einen frisch zubereiteten NGM Teller jeden Tag für die Aufrechterhaltung der Infektion, auch wenn sterile Würmer verwenden (z.B.Glp-4, oder mit FudR).
7. Basierend auf den täglichen Datenberechnung Überleben-Kurven Plotten.

4. C. Elegans flüssige Toxizität Assay mit Aeromonas⁷

Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, sollten Schritte in einem Laminar-Flow-Abzug durchgeführt werden.

1. Am Tag nach der Aussaat die L1-Würmer auf dem ENGM Teller verteilen mit E. Coli OP50, wählen Sie eine einzelne Kolonie von jeder der vier Stämme von Aeromonas und E. Coli OP50 und Kultur mit 5 mL LB Brühe bei 37 ° C 16 h.
   Hinweis: In das Protokoll die folgenden Bakterienstämme wurden verwendet: E. Coli OP50, die normalen Nahrungsquelle von C. Elegans. A. Dhakensis AAK1, der ersten vollständig sequenziert pathogenen klinische A. Dhakensis isolieren. A. Hydrophila A2-066, A. Veronii A2-007 und A. Caviae A2-9307121 sind repräsentativ klinischen Isolaten von National Cheng Kung University Hospital.
2. Messen Sie die OD₆₀₀ Extinktion der Bakterien-Brühe.
3. Zentrifugieren Sie die bakterielle Brühe bei 3.500 X g für 15 min, die LB-Brühe zu entfernen. Die Bakterien aufzuwirbeln und passen Sie die bakterielle Brühe auf OD₆₀₀ = 3,0 S Medium. Mindestens 8 Brunnen einer 96-Well-Platte 195 µL bakterielle Brühe in S Medium hinzufügen.
   Hinweis: Siehe Schritt 1.6 für die Zusammensetzung des S Medium.
4. Die L4-Würmer auf dem ENGM Teller mit E. Coli OP5 mit M9 Medium abwaschen. Passen Sie die Wurm-Lösung zu einer Konzentration von 5 Würmer pro Mikroliter und geben Sie 5 µL der Wurm Lösung in jede der 96-Well-Platte. Sicherstellen Sie, dass es etwa 25 Würmer pro Bohrloch gibt.
5. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte auf einen Shaker bei 200 u/min bei 25 ° c
6. Die Anzahl der Leben Würmer und toten Würmer nach 24, 48 und 72 h die Überlebensraten von jedem Bohrloch mit folgender Formel berechnen: (Live Würmer/Total Würmer) × 100 %.
7. Zeichnen Sie ein Scatter Plot Diagramm mit der täglichen Datenberechnung.

5. C. Elegans Muskel Nekrose Assay mit Aeromonas⁶

Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, sollten diese Schritte in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.

1. Am Tag sind die L1-Würmer auf den ENGM verbreiten mit E. Coli OP50 ausgesät, wählen Sie eine einzelne Kolonie von jeder der vier Stämme von Aeromonas und E. Coli OP50 und Kultur mit 2 mL LB Brühe bei 37 ° C 16 h.
   Hinweis: Hier die folgenden Bakterienstämme wurden verwendet: E. Coli OP50, die normalen Nahrungsquelle von C. Elegans. A. Dhakensis AAK1, der ersten vollständig sequenziert pathogenen klinische A. Dhakensis isolieren. A. Hydrophila A2-066, A. Veronii A2-007 und A. Caviae A2-9307121 sind repräsentativ klinischen Isolaten von National Cheng Kung University Hospital.
2. Messen die OD₆₀₀ Extinktion der Bakterien Brühe und passen Sie die Bakterien Brühe auf OD₆₀₀ = 2,0 mit LB Brühe. Vor Ort und 30 µL bakterielle Brühe auf 6 cm NGM Platten zu verbreiten. Die Platten bei Raumtemperatur über Nacht Kultur.
3. Am Tag wachsen die L1-Würmer auf die L4-Bühne, Transfer 50 Würmer auf jede NGM-Platte mit jedem der vier Stämme von Aeromonas oder E. Coli OP50. Die NGM-Platten bei 20 ° c inkubieren Übertragen Sie Würmer alle 24 h neu vorzubereitenden NGM-Platten mit Bakterien.
4. Muskel-Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop zu nehmen.
   1. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie 10 Würmer auf eine 2 % Agarose-Gel in M9 Medium auf einer Folie aus. Die Würmer mit 2 µL 1 % Natriumazid in M9 Medium auf Agarose für weniger als 5 min vor der Einnahme von Bildern zu lähmen.
   2. Legen Sie ein Deckglas und Aufnahmen mit einem grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Filtern auf dem Fluoreszenz-Mikroskop mit – Coupled Ladegerät Kamera Muskel. Die Muskel-Aufnahmen bei 24, 48 und 72 h nach der L4-Bühne.
5. Führen Sie Bild-Analyse und Abbildung Vorbereitung mit Bildverarbeitungs-Software.
   Hinweis: Die Definitionen der Partituren und die Muskel-Schadenshöhe sind in Abbildung 3, für die aufgeführten Kriterien wie folgt dargestellt: 3 Punkte für fehlende Muskelfasern; 2 Punkte für gerissene oder gebrochene Muskelfasern; 1 Punkt für gebogene Muskelfasern; 0 Punkte für gesunden Muskelfasern.

6. statistische Analysen

1. Durchführen Sie selbstständig alle Experimente mindestens drei Mal.
2. Verwenden Sie die Kaplan-Meier-Methode, um die C. Elegans überleben Assays zu beurteilen, und verwenden Sie die Log-Rank-Test überleben Unterschiede zu analysieren. Statistischen Signifikanz auf 0,05 festgelegt.
3. Verwenden Sie Studenten t-Test, um die statistischen Ergebnisse von C. Elegans flüssige Toxizität Assays für die beiden unterschiedlichen Gruppen zu analysieren. One-Way ANOVA-Test bei der Analyse der Unterschiede zwischen den drei oder mehrere Werte für eine unabhängige Variable zu verwenden. Statistischen Signifikanz auf 0,05 festgelegt.

Ergebnisse

Folgen Sie den oben beschriebenen Protokolle, ist es leicht zu unterscheiden, die Toxizitäten von den vier Aeromonas Strapazen. Die überleben-Assay von C. Elegans ist in Abbildung 1dargestellt. Die Überlebensraten von C. Elegans mit Aeromonas Arten, im Auftrag von hoch zu niedrig angezeigt infiziert waren: A. Caviae, A. Veronii, A. Hydrophila und A. Dhakensis. Zwar gibt es Vielfalt in Bezug auf Toxizit?...

Diskussion

C. Elegans ist das natürlich eine Bacterivorous Nematode Zufuhr Bakterien als Nahrung und hat eine komplizierte angeborene Immunität gegen Bakterien während seiner evolutionären Prozess entwickelt. Zwei der wichtigsten Organe Erhaltung und Unterstützung der Immunität sind die Epidermis und Darm^9,13. Die Epidermis und Bands des Muskels von C. Elegans ähneln die Weichgewebe Strukturen in Säugetieren und beim Menschen⁶

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shaker incubator	YIH DER	LM-570R	Bacteria incubation
K2HPO4	J.T.Baker	MP021519455	Culture medium preparation
KH2PO4	J.T.Baker	3246-05	Culture medium preparation
Na2HPO4	J.T.Baker	MP021914405	Culture medium preparation
NaCl	SIGMA	31434	Culture medium preparation
MgSO4	SIGMA	M7506	Culture medium preparation
agar	Difco	214530	Culture medium preparation
CaCl2	SIGMA	C1016	Culture medium preparation
cholesterol	SIGMA	C8503	Culture medium preparation
ethanol	SIGMA	32205	Culture medium preparation
KOH	SIGMA	P5958	Culture medium preparation
6 cm Petri plate	ALPHA PLUS	46	agar plate preparation
96-well plate	FALCON	353072	liquid assay
bacterial peptone	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Culture medium preparation
yeast extract	SIGMA	92144	Culture medium preparation
citric acid•H2O	SIGMA	C1909	Culture medium preparation
tri-potassium citrate•H2O	SIGMA	104956	Culture medium preparation
FudR	SIGMA	1271008	Culture medium preparation
disodium EDTA	SIGMA	E1644	Culture medium preparation
FeSO4•7 H2O	SIGMA	215422	Culture medium preparation
MnCl2•4 H2O	SIGMA	221279	Culture medium preparation
ZnSO4•7 H2O	SIGMA	204986	Culture medium preparation
CuSO4•5 H2O	SIGMA	C8027	Culture medium preparation
tryptone	SIGMA	16922	Culture medium preparation
Microscope system	Nikon	Eclipase Ti inverted	microscope imaging
Scientific CCD Camera	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	microscope imaging