꼬마 선 충 모델에서 Aeromonas 감염의 병 인 및 독성 평가

요약

C. 선 충감염 Aeromonas 공부 하 세 다른 실험을 소개 합니다. 이러한 편리한 방법을 사용 하 여, 그것 중 고 Aeromonas 종 내에서 독성을 평가 하기 쉽습니다.

초록

인간 병원 체 Aeromonas 임상적으로 위장염, 상처 감염, 패 혈 증, 및 요로 감염 원인 표시 되었습니다. 대부분의 인간의 질병 4 종의 박테리아와 관련 된 것으로 보고 되었습니다: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii및 Aeromonas caviae. 모델 생물 꼬마 선 충 은 Aeromonas의 세균 병 인을 공부 하는 우수한 감염 모델을 제공 하는 bacterivore 이다. 여기, 생존, 액체 독성, 그리고 근육 괴 사 분석을 포함 하 여 선 충 C. 모델을 사용 하 여 Aeromonas 감염 연구 3 다양 한 실험을 소개 합니다. Aeromonas 의 독성을 결정 하는 세 가지 방법의 결과 일치 했다. A. dhakensis 는 4 주요 Aeromonas 종 임상 감염을 일으키는 가운데 가장 독성이 있을 표시 했다. 이러한 메서드 및 Aeromonas 종 내에서 독성을 평가 하 고 Aeromonas 감염의 병 인에 대 한 우리의 이해에 기여 하는 편리한 방법이 되도록 표시 됩니다.

서문

인간 병원 체, Aeromonas, 임상적으로 위장염, 상처 감염, 패 혈 증, 및 요로 감염^1,2에 표시 되었습니다. 가장 관련 된 인간의 질병 관련 4 개의 세균성 종 된 것으로 보고 되었습니다: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii및 Aeromonas caviae ^{2,3 , 4 , 5}. Aeromonas 전염병 중 소프트-조직 감염에에서 발생할 수 있습니다 심각한 병 적 상태와 사망률 인 간에. 메모의 근육 괴 사 연 조직 감염⁶의 가장 심한 형태입니다. 생존의 관찰 및 감염 후 꼬마 선 충 의 근육 괴 사 Aeromonas의 독성을 추측 하는 편리한 방법입니다.

과학자는 이미 수많은 모형 유기 체 공부 세균 감염을 개발 했다. 이전 학문에서는, 쥐, zebrafishes, 및 nematodes 사용 되었다 동물 모델로 pathogenesis Aeromonas^6,,78의 독성을 공부 하 고. 모든 동물 모델의 ' 장점 및 응용 프로그램. 모델 유기 체, 꼬마 선 충, foodnaturally bacterivorous 선 충 류는 섭취 박테리아 이다. C. 선 충의 진화의 과정을 통해 세균 감염에 대 한 복잡 한 타고 난 면역 체계를 개발 했다. 세균 감염의 스트레스, 선 충 C. Aeromonas^6,,79 와 다른 병원 체의 세균 병 인을 공부 하는 우수한 감염 모델 입증 되었습니다. 같은 균 류¹⁰ 및 enterohaemorrhagic 대장균 O157:H7¹¹. 그러나, 여전히 모델 C. 선 충 을 사용 하 여 Aeromonas독성 연구 방법론에 초점을 맞춘 없습니다 게시가입니다.

여기, 우리가 공부 Aeromonas 감염 동물 모델로 서 C. 선 충 을 사용 하 여 3 개의 다른 실험 소개: 생존, 액체 독성, 그리고 근육 괴에 대 한 분석. 이 메서드는 중 고 Aeromonas 종 내에서 독성을 평가 하 고 Aeromonas의 pathogenesis의 이해를 개선 하는 편리한 방법을.

프로토콜

1입니다. 문화 매체의 준비

참고: 솔루션 준비에 대 한 표 1을 참조 하십시오.

1. M9 중간¹²준비, KH₂포₄1.5 g, 나₂HPO₄, 5.66 g 및 이온된 물 500 mL에 NaCl의 2.5 g을 분해. 20 분을 위한 121 ° C에 고압 실내 온도에 냉각 될 때까지 기다립니다 고 1 M MgSO₄ 처음 사용 하기 전에 0.5 mL를 추가 합니다.
2. 선 충 류 성장 매체 (NGM)¹²를 준비 하려면 3g NaCl, 2.5 g 세균성 펩, 및 이온을 제거 된 물 1 리터에 20 g 한 천 분해. 20 분을 위한 121 ° C에 고압 물 욕조에 55 ° C에 냉각 될 때까지 기다립니다 고 1 M CaCl₂의 1 mL, 1 mL의 1 M MgSO₄, 5% 에탄올, 콜레스테롤의 1 mL 및 인산 염 버퍼의 25 mL를 추가 합니다. 잘 섞어 소용돌이 친다.
3. 약 5 mL NGM 각 6 cm 배양 접시에 부 어. 접시의 표면에 거품 생산을 하지 마십시오. 1 박 및 4 ° c.에 저장 하려면 패키지 실내 온도에 격판덮개를 두고 사용 하기 전에 실내 온도에 돌려.
4. 풍부한 NGM (ENGM)를 준비 하려면 3g NaCl, 5 g 세균성 펩, 1 g 효 모 추출 물, 및 이온을 제거 된 물 1 리터에 30 g 한 천 분해. 20 분을 위한 121 ° C에 고압 물 목욕에서 55 ° C에 냉각 될 때까지 기다립니다 고 1 M CaCl₂의 1 mL, 1 mL의 1 M MgSO₄, 5% 에탄올, 콜레스테롤의 1 mL 및 인산 염 버퍼의 25 mL를 추가 합니다. 잘 섞어 소용돌이 친다.
5. 약 10 mL ENGM 각 9 cm 배양 접시에 부 어. 접시의 표면에 거품 생산을 하지 마십시오. 1 박 및 4 ° c.에 저장 하려면 패키지 실내 온도에 격판덮개를 두고 사용 하기 전에 실내 온도에 가져와.
6. S 중간¹²준비, 40 mL S 기저, 0.4 mL 1 M 칼륨 구 연산 염 혼합, 0.4 mL 추적 솔루션, 1 M CaCl₂, 0.12 mL의 1 M MgSO₄, 에탄올에 5% 콜레스테롤 40 µ L의 0.12 mL 및 사용 하기 전에 8 m m FudR의 1 mL 금속.

2. C. 선 충^6,,912 의 동기화

1. 15 mL 튜브에 살 균 이온된 수 10 mL와 함께 벗 성인 무대에서 약 2000 벌레를 씻어. 박테리아 3 x, 튜브의 아래쪽에는 벌레를 유지 충분히 세척 한다.
2. 풀 벌레 다운 500 x g 에서 1 분 샘플 원심 상쾌한, 제거 하 고 3.5 mL 이온을 제거 된 물에는 벌레를 유지.
3. 1 mL NaOCl (10-15%) 및 0.5 mL 5 M 코 튜브에 추가 합니다. 동안 흔들어 하 여 균등 하 게 혼합 < 6 분 웜 시체를 lyse.
4. 후 계란 벌레에서 출시 되는 세포를 막으려고 10 mL 이온된 물을 추가 합니다. 풀 다운 계란을 제거 가능한 상쾌한 1200 x g 에서 1 분 동안 원심 분리기. 씻어 15 mL M9 중간 적어도 3 배.
   참고: 단계 1.1 M9 매체의 구성에 대 한 참조.
5. 1 mL M9 매체에 계란을 유지. 1 박 (약 12-18 h) 20 ° C에 외피에 대 한 3.5 c m 접시에 계란을 전송 합니다.
   참고:는 부 화 후 계란 벌레 유 충 애벌레 (L1) 초단으로 불리는 해치 것입니다.
6. M9 매체에서 L1 벌레의 10 µ L 밖으로 플라스틱. 벌레의 수를 계산 하 고 L1의 농도 웜 M9 매체에 계산.
7. 씨앗 최대 10000 incubated L1 무대 벌레를 피펫으로와 대장균 OP50 확산 9 cm ENGM 접시에.
   1. 이 단계에서는 확산 0.5 mL 하룻밤 Luria Bertani (파운드) 9 cm ENGM 접시에 국물과 함께 대장균 OP50 경작. 16-18 h 37 ° C에서 접시를 품 어
      참고: 오염을 방지 하려면 확산 단계는 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다.
   2. L1 벌레를 뿌리기 전에 실내 온도에 냉각 하십시오. 씨앗 최대 10000 incubated L1 단계 웜 대장균 OP50와 ENGM에.
8. 44 h 또는 4^번째 애벌레 (L4) 단계로 성장 때까지 20 ° C에서 벌레를 품 어.
   참고: 1.3 ENGM 매체의 구성에 대 한 단계를 참조 하십시오. 벌레 L4 단계에서 반달 모양 몸 측면의 중앙에 흰 점이 있다.
9. 사용 하 여 동기화 된 L4 단계 다음 분석 실험에서 벌레. N2 Aeromonas dhakensis 와 선 충 C. 생존 분석 결과에 선 충 C. 액체 독성 분석 결과 Aeromonas dhakensis벌레는 야생 타입을 사용 합니다. RW1596 웜 (myo-3(st386); 를 사용 하 여 stEx30 [묘-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) Aeromonas dhakensis와 선 충 C. 근육 괴 사 분석 결과에.

3. 선 충 C. 생존 분석 결과 Aeromonas^6,9

1. L1 웜 확산 대장균 OP50와 ENGM에 시드 날, 각 4 개의 Aeromonas 긴장 또는 대장균 OP50 및 16 h 37 ° C에서 각각 2 mL 파운드 국물과 함께 문화 단일 식민지를 선택 하십시오.
   참고: 오염을 방지 하려면이 단계는 층 류 후드에서 수행 되어야 한다. 여기서 다음 세균성 긴장 사용 했다: 대장균 OP50, C. 선 충의 정상적인 음식 소스. A. dhakensis , AAK1는 첫 번째 완전 시퀀싱 병원 임상 A. dhakensis 분리. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007, 그리고 A. caviae A2-9307121 국립 쳉 쿵 대학 병원에서 대표적으로 임상 분리 있습니다.
2. 세균성 국물의 OD₆₀₀ 흡 광도 측정 하 고 OD₆₀₀ 세균 국물 조정 = 파운드 국물과 함께 2.0.
3. 자리 하 고 확산 30 µ L 세균성 국물의 각 6 cm NGM 접시. 하룻밤 실 온에서 격판덮개 문화.
   참고: NGM 매체의 구성에 대 한 1.2 단계를 참조 하십시오.
4. L1 웜 L4 단계에 성장 하는 날에 무작위로 선택 하 고 각 4 Aeromonas 긴장의 E. 콜라이 OP50 NGM 접시 50 웜 전송.
5. 분석 결과 완료 될 때까지 20 ° C에서 NGM 접시를 품 어.
6. 매일 때까지 마지막 벌레는 죽은 박테리아 및 수의 숫자, 죽은, 라이브 센서 웜 새로 준비 NGM 접시에 모든 살아있는 벌레를 전송 합니다.
   참고: 전송 웜 신선한 준비 NGM 접시에 감염, 유지 관리를 위해 매일 살 균 벌레를 사용 하는 경우에 (예를 들어glp-4, 또는 FudR).
7. 매일 데이터 계산에 따라 생존 곡선을 플롯.

4. 선 충 C. 액체 독성 분석 결과 Aeromonas⁷

참고: 오염 방지 하려면 단계 층 흐름 후드에서 수행 되어야 합니다.

1. L1 웜 확산 대장균 OP50 ENGM 플레이트에 시드 후 하루 4 Aeromonas 변종 대장균 OP50과의 문화 5 mL를 각각의 단일 식민지 파운드 국물 각 16 h 37 ° C에서 선택 합니다.
   참고: 프로토콜을 다음 박테리아 긴장 사용 했다: 대장균 OP50, C. 선 충의 정상적인 음식 소스. A. dhakensis , AAK1는 첫 번째 완전 시퀀싱 병원 임상 A. dhakensis 분리. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007, 그리고 A. caviae A2-9307121 국립 쳉 쿵 대학 병원에서 대표적으로 임상 분리 있습니다.
2. 박테리아 국물의 OD₆₀₀ 흡 광도 측정 한다.
3. 3500 x g 파운드 국물 제거 하려면 15 분 동안에 세균성 국물 원심 박테리아를 resuspend 하 고 OD₆₀₀ 세균 국물 조정 = 3.0 S 매체. S 매체에 96 잘 접시의 적어도 8 우물 195 µ L 세균성 국물을 추가 합니다.
   참고: 1.6 S 매체의 구성에 대 한 단계를 참조 하십시오.
4. M9 매체를 사용 하 여 대장균 OP5와 ENGM 접시에 L4 벌레를 씻어. µ L 당 5 벌레의 농도에 웜 솔루션을 조정 하 고 웜 솔루션의 5 µ L 96 잘 접시의 각 음을 추가. 잘 당 약 25 벌레 인지 확인 합니다.
5. 25 ° c.에서 200 rpm에서 통에 96 잘 접시를 품 어
6. 다음 수식 사용 하 여 각의 생존 율을 계산 하는 24, 48, 및 72 h. 후 라이브 웜 및 죽은 벌레의 수를 계산: (라이브 웜/총 벌레) × 100%.
7. 매일 데이터 계산 분산형 플롯 그래프를 그립니다.

5. 선 충 C. 근육 괴 사 분석 결과 Aeromonas⁶

참고: 오염을 방지 하려면 다음이 단계는 층 류 두건에서 수행 되어야 합니다.

1. L1 웜 대장균 OP50와 ENGM 확산에 시드는 하루에 4 개의 Aeromonas 긴장 및 대장균 OP50 및 문화 국물과 함께 2 mL 파운드 각 16 h 37 ° C에서의 각각의 단일 식민지를 선택 하십시오.
   참고: 여기, 다음 박테리아 변종이 사용 되었다: 대장균 OP50, C. 선 충의 정상적인 음식 소스. A. dhakensis , AAK1는 첫 번째 완전 시퀀싱 병원 임상 A. dhakensis 분리. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007, 그리고 A. caviae A2-9307121 국립 쳉 쿵 대학 병원에서 대표적으로 임상 분리 있습니다.
2. 박테리아 국물의 OD₆₀₀ 흡 광도 측정 하 고 OD₆₀₀ 박테리아 국물 조정 = 파운드 국물과 함께 2.0. 자리 고 30 µ L 세균성 국물 6 cm NGM 접시에의 확산. 하룻밤 실 온에서 격판덮개 문화.
3. 하루에 L1 웜 4 Aeromonas 긴장의 E. 콜라이 OP50 각 각 NGM 접시에 전송 50 웜 L4 단계에 성장. 20 ° c.에 NGM 번호판을 품 어 박테리아와 새로 준비 NGM 판 웜 모든 24 h를 전송 합니다.
4. 형광 현미경을 사용 하 여 근육 이미지를 가져가 라.
   1. 임의로 슬라이드에 M9 매체에 2 %agarose 젤에 10 벌레를 선택 합니다. 벌레를 사용 하 여 1% 나트륨 아 지 드의 2 µ L agarose에 M9 중간에 5 분 미만 대 한 이미지를 복용 하기 전에 마비
   2. 커버 슬립을 배치 하 고 전 하 결합 소자 카메라로 형광 현미경에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터를 사용 하 여 근육 이미지를 캡처하십시오. 24, 48, 및 72 h 포스트는 L4 단계에서 근육 이미지를 캡처하십시오.
5. 이미지 프로세싱 소프트웨어와 이미지 분석 및 그림 준비를 수행 합니다.
   참고: 정의 점수와 근육 손상 레벨의 그림 3을 기준은 다음과 같이 나열 됩니다에 표시 됩니다: 3 포인트 누락 된 근육 섬유; 파열 또는 깨진 근육 섬유;에 대 한 2 점 구부러진된 근육 섬유;에 대 한 1 포인트 건강 한 근육 섬유에 대 한 0 점입니다.

6. 통계 분석

1. 수행 하지 모든 실험 최소 세 번 독립적으로 합니다.
2. 카 플 란-마이어 메서드를 사용 하 여 선 충 C. 생존 분석, 평가 하 고 생존 차이 분석 로그-순위 테스트를 사용 합니다. 0.05에서 통계적 의미를 설정 합니다.
3. 스튜던트 t-검정을 사용 하 여 두 개의 서로 다른 그룹에 대 한 선 충 C. 액체 독성 분석 실험의 통계 결과 분석. 한 독립 변수가 3 개 이상의 값 간의 차이 분석에서 일방통행 ANOVA 테스트를 사용 합니다. 0.05에서 통계적 의미를 설정 합니다.

결과

위에서 설명한 프로토콜에 따라, 4 개의 Aeromonas 긴장에서 독성 구분 하기 쉽습니다. C. 선 충 의 생존 분석 결과 그림 1에 표시 됩니다. C. 선 충 감염 Aeromonas 종, 낮은 높은 순서로 표시 된의 생존 율 했다: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila 그리고 A. dhakensis. 독성 및 Aeromonas 종 내 면에서 다양성은, C. 선 충...

토론

C. 선 충 은 bacterivorous 선 충 류는 자연스럽 게 음식 섭취 박테리아의 진화 과정 동안 박테리아에 복잡 한 타고 난 면제를 개발 했다. 유지 하 고 면역을 지 원하는 주요 장기의 2 개는 표 피와 내장^9,13. 표 피와 근육 C. 선 충 의 포유류와 인간⁶소프트-조직 구조를 유사합니다. 이러한 특성 때문에 C. 선 충 은 Aeromonas<...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shaker incubator	YIH DER	LM-570R	Bacteria incubation
K2HPO4	J.T.Baker	MP021519455	Culture medium preparation
KH2PO4	J.T.Baker	3246-05	Culture medium preparation
Na2HPO4	J.T.Baker	MP021914405	Culture medium preparation
NaCl	SIGMA	31434	Culture medium preparation
MgSO4	SIGMA	M7506	Culture medium preparation
agar	Difco	214530	Culture medium preparation
CaCl2	SIGMA	C1016	Culture medium preparation
cholesterol	SIGMA	C8503	Culture medium preparation
ethanol	SIGMA	32205	Culture medium preparation
KOH	SIGMA	P5958	Culture medium preparation
6 cm Petri plate	ALPHA PLUS	46	agar plate preparation
96-well plate	FALCON	353072	liquid assay
bacterial peptone	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Culture medium preparation
yeast extract	SIGMA	92144	Culture medium preparation
citric acid•H2O	SIGMA	C1909	Culture medium preparation
tri-potassium citrate•H2O	SIGMA	104956	Culture medium preparation
FudR	SIGMA	1271008	Culture medium preparation
disodium EDTA	SIGMA	E1644	Culture medium preparation
FeSO4•7 H2O	SIGMA	215422	Culture medium preparation
MnCl2•4 H2O	SIGMA	221279	Culture medium preparation
ZnSO4•7 H2O	SIGMA	204986	Culture medium preparation
CuSO4•5 H2O	SIGMA	C8027	Culture medium preparation
tryptone	SIGMA	16922	Culture medium preparation
Microscope system	Nikon	Eclipase Ti inverted	microscope imaging
Scientific CCD Camera	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	microscope imaging