Virülans ve Aeromonas enfeksiyon Caenorhabditis elegans modelindeki patogenezinde değerlendirilmesi

Özet

Burada, C. elegansenfeksiyonunda Aeromonas çalışmaya üç farklı deneyler tanıtmak. Bu uygun yöntemler kullanarak, arasında ve Aeromonas türleri içinde toksisitesi değerlendirmek kolaydır.

Özet

İnsan patojen Aeromonas klinik olarak gastroenterit, yara enfeksiyonları, septisemi ve idrar yolu enfeksiyonu neden olduğu gösterilmiştir. En insan hastalıkları bakteri dört türleri ile ilişkili olduğu bildirilmiştir: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniive Aeromonas caviae. Model organizma Caenorhabditis elegans mükemmel enfeksiyon modeli hangi Aeromonasbakteriyel patogenezi okumaya sağlar bacterivore olduğunu. Burada, hayatta kalma, sıvı toksisite ve kas nekrozu deneyleri gibi bir C. elegans modeli kullanarak Aeromonas enfeksiyon çalışmaya üç farklı deneyler tanıtmak. Aeromonas virülans belirleyen üç yöntem sonuçları tutarlı edildi. A. dhakensis klinik enfeksiyonlar neden 4 büyük Aeromonas türler arasında en zehirli olduğu gösterilmiştir. Bu yöntemler arasında ve Aeromonas türleri içinde toksisitesi değerlendirmek ve Aeromonas enfeksiyon patogenezi bilgimizi katkıda bulunmak için uygun bir yol olarak gösterilmektedir.

Giriş

İnsan patojen Aeromonas, klinik olarak gastroenterit, yara enfeksiyonları, septisemi ve idrar yolu enfeksiyonları^1,2neden olduğu gösterilmiştir. En ilişkili insan hastalıkları dört bakteriyel türler ile ilişkili olduğu bildirilmiştir: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniive Aeromonas caviae ^{2,3 , 4 , 5}. Aeromonas bulaşıcı hastalıklar arasında yumuşak doku enfeksiyonları ciddi morbidite ve mortalite insanlarda neden olabilir. Not, kas nekrozu yumuşak doku enfeksiyonu⁶en ağır şeklidir. Gözlem hayatta kalma ve Caenorhabditis elegans kas nekrozu enfeksiyon sonra Aeromonastoksisite spekülasyon kullanılacak uygun bir yöntemdir.

Bilim adamları zaten bakteriyel enfeksiyonlar çalışmaya çok sayıda model organizmalar geliştirdik. Önceki çalışmalarda, fareler, zebrafishes ve Nematodlar patogenez ve virülans Aeromonas^6,7,8çalışmaya hayvan modelleri olarak kullanılmıştır. Her hayvan modeli vardır onun ' avantajları ve uygulamaları. Model organizma, Caenorhabditis elegans, bacterivorous Yuvarlak solucanlar hangi alımı bakteri foodnaturally değil. C. elegansevrimi boyunca bakteriyel enfeksiyona karşı karmaşık bir doğuştan gelen bağışıklık sistemi geliştirmiştir. Bakteriyel enfeksiyon stres altında C. elegans Aeromonas^6,7,9 ve diğer patojenleri bakteriyel patogenezi okumaya bir mükemmel enfeksiyon model olmak kanıtlanmıştır mantar¹⁰ ve enterohaemorrhagic Escherichia coli O157: H7¹¹gibi. Ancak, hala C. elegans Aeromonasvirülans eğitimi için bir model olarak kullanarak metodoloji üzerinde duruluyor hiçbir yayın yoktur.

Burada, Aeromonas enfeksiyon C. elegans hayvan bir model olarak kullanarak eğitim için üç farklı deneyler tanıtmak: hayatta kalma, sıvı toksisite ve kas nekrozu deneyleri. Bu yöntemler arasında ve Aeromonas türleri içinde toksisitesi değerlendirmek ve Aeromonaspatogenezinde anlayış geliştirmek için uygun bir yoldur.

Protokol

1. kültür orta hazırlanması

Not: Bkz. Tablo 1 için çözüm hazırlık.

1. M9 orta¹²hazırlamak için KH₂PO₄1.5 g, 5.66 g Na₂HPO₄ve NaCl 2.5 g 500 mL deiyonize su içinde çözülür. Otoklav 20 dakika süreyle 121 ° C'de oda sıcaklığına soğutmalı kadar bekleyin ve sonra 0.5 mL 1 M MgSO₄ ilk kullanımdan önce ekleyin.
2. Nematot büyüme orta (NGM)¹²hazırlamak için 3 g NaCl, 2.5 g bakteriyel pepton ve 1 litre deiyonize su 20 g agar geçiyoruz. Otoklav 20 dakika süreyle 121 ° C'de soğutmalı su banyosu içinde 55 ° c kadar bekleyin ve sonra 1 mL 1 M CaCl₂, 1 M MgSO₄1 mL, 1 mL etanol içinde %5 kolesterol ve fosfat tampon 25 mL ekleyin. Girdap iyice karıştırın.
3. Yaklaşık 5 mL NGM içine her 6 cm Petri kabına dökün. Yüzeyde kabarcık üretimini plaka kaçının. Tabaklar, oda sıcaklığında 1 gece ve 4 ° C'de kaydetmek için paketi için bırakın Kullanmadan önce oda sıcaklığına getir.
4. Zenginleştirilmiş NGM (ENOA) hazırlamak için 3 g NaCl, 5 g bakteriyel pepton, 1 gr maya özü ve 1 litre deiyonize su 30 g agar geçiyoruz. Otoklav 20 dakika süreyle 121 ° C'de soğutmalı su banyosu içinde 55 ° c kadar bekleyin ve 1 mL 1 M CaCl₂, 1 M MgSO₄1 mL, 1 mL etanol içinde %5 kolesterol ve fosfat tampon 25 mL ekleyin. Girdap iyice karıştırın.
5. Yaklaşık 10 mL ENOA içine her 9 cm Petri kabına dökün. Yüzeyde kabarcık üretimini plaka kaçının. Tabaklar, oda sıcaklığında 1 gece ve 4 ° C'de kaydetmek için paketi için bırakın Kullanmadan önce oda sıcaklığına getirmek.
6. S orta¹²hazırlamak, 40 mL S bazal, 0.4 mL 1 M Potasyum sitrat karıştırmak için 0.4 mL izleme çözümü, 1 M CaCl₂, 1 M MgSO₄0.12 mL, %5 kolesterol etanol içinde 40 µL 0.12 mL ve 1 mL 8 mm FudR kullanmadan önce metal.

2. C. elegans^6,9,12 eşitlenmesi

1. Yaklaşık 2000 solucanlar yetişkin gravid sahne 10 mL 15 mL tüp içinde steril deiyonize su ile yıkayın. Bakteri 3 x, solucanlar tüpün dibinde tutmak dışarı yıkamak.
2. Örnek için solucanlar çekmek için 500 x g , 1 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırın ve solucanlar 3,5 mL deiyonize su tutun.
3. 1 mL NaOCl (10-%15) ve 0.5 mL 5 M KOH tüp içine ekleyin. Mix eşit sallayarak için < solucan cesetleri koşullar için 6 dakika.
4. Yumurta solucanlara salınır sonra lizis durdurmak için 10 mL deiyonize su ekleyin. Yumurta çekin ve süpernatant mümkün olduğu kadar kaldırmak için 1200 x g , 1 dk santrifüj. 15 mL M9 orta en az 3 x ile yıkayın.
   Not: adım 1.1 M9 orta bileşimi için bkz.
5. Yumurta 1 mL M9 ortamda tutmak. 3.5 cm çanak için bir gece (yaklaşık 12-18 h) 20 ° C'de kuluçka yumurta taşıma.
   Not: kuluçka sonra ilk larva (L1) sahne adlandırılan larva solucan için yumurtalar çatlar.
6. Pipet L1 Worms M9 orta 10 µL dışarı. Solucan sayar ve L1 konsantrasyonu M9 ortamda solucanlar hesaplayın.
7. Tohum en az 10.000 Escherichia coli OP50 ile yayılmış 9 cm ENOA plaka üzerinde bir damlalıklı ile L1 sahne solucanlar inkübe.
   1. Bu adımda, formanın 0.5 mL gecede E. coli OP50 9 cm ENOA plaka üzerinde Luria-Bertani (LB) et suyu ile kültürlü. 16-18 h için 37 ° C'de plaka kuluçkaya
      Not: kirlenmesini önlemek için Yayilim adım laminar akış mahallede yapılmalıdır.
   2. L1 solucanlar tohum önce oda sıcaklığına kadar serin. Tohum en az 10.000 L1 sahne solucanlar ENOA plaka E. coli OP50 ile inkübe.
8. 20 ° c kadar 4^th larva (L4) sahne alanı'na büyürler veya 44 h için solucanlar kuluçkaya.
   Not: Adım 1.3 ENOA orta bileşimi için bkz. Bir solucan L4 aşamada vücut yan ortasında yarım ay şeklinde beyaz bir nokta vardır.
9. Aşağıdaki deneyleri sahne solucanlar eşitlenmiş L4 kullanın. Vahşi C. elegans hayatta kalma tahlil Aeromonas dhakensis ile ve C. elegans sıvı toksisite tahlil Aeromonas dhakensisile N2 solucanlar türünü kullanın. RW1596 solucanlar (myo-3(st386); kullanın stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) C. elegans kas nekrozu tahlil Aeromonas dhakensisile.

3. C. elegans hayatta kalma tahlil Aeromonas^6,9

1. E. coli OP50 ile yayılan ENOA L1 solucanlar tohum günde, bir koloni dört Aeromonas suşları veya E. coli OP50 ve kültürü ile 2 mL LB suyu sırasıyla 37 ° C'de 16 h için Seç.
   Not: Kirlenmesini önlemek için bu adımı laminar akış mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor. Burada, aşağıdaki bakteri suşları kullanılmıştır: E. coli OP50, C. elegans normal gıda kaynağıdır. A. dhakensis AAK1, ilk tam sıralı patojenik klinik A. dhakensis yalıtmak. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 ve A. caviae A2-9307121 Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi'nden dinlerinden klinik yalıtır vardır.
2. OD₆₀₀ absorbans bakteriyel suyu ölçmek ve bakteriyel suyu OD₆₀₀ ayarlamak 2.0 LB suyu ile =.
3. Spot ve bakteriyel suyu 30 µL her 6 cm NGM plaka yayıldı. Oda sıcaklığında plakaları gecede kültür.
   Not: NGM orta bileşimi için 1.2 adıma bakın.
4. Gününde, L1 solucanlar L4 sahne alanı'na büyümek rasgele almak ve 50 solucanlar bir NGM plaka her dört Aeromonas suşları veya E. coli OP50 ile aktarın.
5. Tahlil tamamlanana kadar 20 ° C'de NGM plakaları kuluçkaya.
6. Tüm yaşayan solucanlar bakteri ve numaralarını canlı, ölü sayısı ve sensör solucanlar yeni hazırlanan bir NGM plakalı son solucan ölene kadar her gün aktarın.
   Not: Solucanlar olsanız steril solucanlar bir taze hazırlanmış NGM plakasına enfeksiyon, bakımı için her gün transfer (örneğinglp-4, ya da FudR ile).
7. Günlük veri hesaplama temel hayatta kalma eğriler çizmek.

4. C. elegans sıvı toksisite tahlil Aeromonas⁷ ile

Not: Kirlenmesini önlemek için laminar akış mahallede gerçekleştirilen adımlar.

1. L1 solucanlar E. coli OP50 ile yayıldı ENOA plaka üzerinde tohum sonra seçtiklerimiz bir koloni dört Aeromonas suşları ve E. coli OP50 ve kültürü ile 5 mL LB suyu her 16 h için 37 ° C'de.
   Not: protokol, aşağıdaki bakteri suşları kullanılmıştır: E. coli OP50, C. elegans normal gıda kaynağıdır. A. dhakensis AAK1, ilk tam sıralı patojenik klinik A. dhakensis yalıtmak. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 ve A. caviae A2-9307121 Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi'nden dinlerinden klinik yalıtır vardır.
2. OD₆₀₀ absorbans bakteri suyu ölçmek.
3. Bakteriyel suyu 3500 x g LB suyu kaldırmak 15 dakika, santrifüj kapasitesi. Bakteri resuspend ve bakteriyel suyu OD₆₀₀ ayarlamak 3.0 ile S orta =. Bakteriyel suyu 195 µL S ortamda bir 96-şey plaka en az 8 wells için ekleyin.
   Not: Adım 1.6 S orta bileşimi için bkz.
4. L4 solucanlar M9 orta kullanarak ENOA plaka E. coli OP5 ile kapalı yıkayın. Bir konsantrasyon µL başına 5 solucanlar solucan çözüm ayarlamak ve solucan çözüm 5 µL 96-şey plaka her şey için ekleyin. Yaklaşık 25 solucanlar iyi ücret olduğundan emin olun.
5. Bir shaker 200 devirde 25 ° C'de 96-şey tabağa kuluçkaya
6. 24, 48 ve 72 h. aşağıdaki formül ile her şey hayatta kalma oranları hesaplamak sonra canlı solucanlar ve ölü solucanlar saymak: (canlı solucanlar/toplam solucanlar) × %100.
7. Bir dağılım çizim grafik günlük veri hesaplama ile çizin.

5. C. elegans kas nekrozu tahlil Aeromonas⁶

Not: Kirlenmesini önlemek için aşağıdaki adımları bir laminar akış mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.

1. L1 solucanlar yayılmış ENOA E. coli OP50 ile üzerinde seribaşı gününde bir koloni dört Aeromonas suşları ve E. coli OP50 ve kültürü ile 2 mL LB suyu her 16 h için 37 ° C'de seç.
   Not: Burada, aşağıdaki bakteri suşları kullanılmıştır: E. coli OP50, C. elegans normal gıda kaynağıdır. A. dhakensis AAK1, ilk tam sıralı patojenik klinik A. dhakensis yalıtmak. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 ve A. caviae A2-9307121 Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi'nden dinlerinden klinik yalıtır vardır.
2. OD₆₀₀ absorbans bakteri suyu ölçmek ve bakteri suyu OD₆₀₀ ayarlamak 2.0 LB suyu ile =. Spot ve 6 cm NGM plakaları bakteriyel suyu 30 µL yayıldı. Oda sıcaklığında plakaları gecede kültür.
3. Gününde L1 solucanlar L4 sahneye, transfer 50 solucanlar her NGM plaka her dört Aeromonas suşları veya E. coli OP50 ile büyümek. 20 ° C'de NGM plakaları kuluçkaya Solucanlar her 24 h bakteri ile yeni hazırlanan NGM plakalar aktarın.
4. Kas görüntüleri floresan mikroskop kullanarak alın.
   1. Rastgele bir % 2 özel jel üzerine 10 solucanın M9 orta bir slayttaki seçin. 2 µL % 1 Sodyum azid özel M9 ortamda az 5 dk için resim çekmeden önce kullanarak solucanlar felç.
   2. Bir kapak notu yerleştirin ve floresan protein (GFP) filtre bir yeşil üzerinde floresan mikroskop kullanarak şarj kuplajlı cihaz fotoğraf makinesi ile kas çekim. 24 Kas çekim, 48 ve 72 h L4 sahne sonrası.
5. Görüntü analizi ve şekil hazırlık bir görüntü işleme yazılımı ile yapmak.
   Not: Puanları ve kas hasarı düzeyleri tanımları için ölçütleri listelenen aşağıdaki gibi Şekil 3' te, gösterilmektedir: 3 puan için eksik kas lifleri; 2 puan parçalanmış veya kırık kas lifleri için; 1 puan bükülmüş kas lifleri için; sağlıklı kas lifleri için 0 puan.

6. istatistiksel analizler

1. Tüm deneyler bağımsız olarak en az üç kez gerçekleştirin.
2. C. elegans hayatta kalma deneyleri değerlendirmek için Kaplan-Meier yöntemini kullanın ve hayatta kalma farklılıklar analiz günlük-rank testi kullanabilirsiniz. İstatistiksel anlamlılık 0,05 ayarla.
3. Öğrenci t-test için iki farklı grup C. elegans sıvı toksisite deneyleri istatistiksel sonuçlarını çözümlemek için kullanın. Bir bağımsız değişken için üç veya daha fazla değer arasında farklılıklar analiz tek yönlü ANOVA testi kullanın. İstatistiksel anlamlılık 0,05 ayarla.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokolleri takip ederek, toksisite üzerinden dört Aeromonas suşları arasında ayırt etmek kolaydır. C. elegans hayatta kalma tahlil Şekil 1' de gösterilen. Hayatta kalma oranları düşük ile yüksek sırada gösterilen Aeromonas türleri ile enfekte C. elegans vardı: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila ve A. dhakensis. Çeşitlilik açısından toksisite arasında ve

Tartışmalar

C. elegans olduğunu bacterivorous Yuvarlak solucanlar bu doğal gıda alımı bakteri ve bakteri için karmaşık bir doğuştan gelen bağışıklık onun evrim sürecinde geliştirmiştir. İki önemli organları korumak ve bağışıklığı destekleyici epidermis ve bağırsak^9,13vardır. Epidermis ve C. elegans kas bantları memeliler ve insanlar⁶' yumuşak doku yapıları benzer. Bu özellikleri nedeniyle, C. e...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shaker incubator	YIH DER	LM-570R	Bacteria incubation
K2HPO4	J.T.Baker	MP021519455	Culture medium preparation
KH2PO4	J.T.Baker	3246-05	Culture medium preparation
Na2HPO4	J.T.Baker	MP021914405	Culture medium preparation
NaCl	SIGMA	31434	Culture medium preparation
MgSO4	SIGMA	M7506	Culture medium preparation
agar	Difco	214530	Culture medium preparation
CaCl2	SIGMA	C1016	Culture medium preparation
cholesterol	SIGMA	C8503	Culture medium preparation
ethanol	SIGMA	32205	Culture medium preparation
KOH	SIGMA	P5958	Culture medium preparation
6 cm Petri plate	ALPHA PLUS	46	agar plate preparation
96-well plate	FALCON	353072	liquid assay
bacterial peptone	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Culture medium preparation
yeast extract	SIGMA	92144	Culture medium preparation
citric acid•H2O	SIGMA	C1909	Culture medium preparation
tri-potassium citrate•H2O	SIGMA	104956	Culture medium preparation
FudR	SIGMA	1271008	Culture medium preparation
disodium EDTA	SIGMA	E1644	Culture medium preparation
FeSO4•7 H2O	SIGMA	215422	Culture medium preparation
MnCl2•4 H2O	SIGMA	221279	Culture medium preparation
ZnSO4•7 H2O	SIGMA	204986	Culture medium preparation
CuSO4•5 H2O	SIGMA	C8027	Culture medium preparation
tryptone	SIGMA	16922	Culture medium preparation
Microscope system	Nikon	Eclipase Ti inverted	microscope imaging
Scientific CCD Camera	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	microscope imaging