Évaluer la Virulence et la pathogenèse de l’Infection à Aeromonas dans un modèle de Caenorhabditis elegans

Résumé

Ici, nous présentons trois expériences différentes afin d’étudier les infection à Aeromonas chez c. elegans. En utilisant ces méthodes pratiques, il est facile d’évaluer la toxicité entre et au sein des espèces d’Aeromonas .

Résumé

L’agent pathogène humain Aeromonas a été cliniquement démontré provoque des gastro-entérites, infections de plaies, septicémie et infections des voies urinaires. Maladies plus humaines ont été signalés à être associés à quatre espèces de bactéries : Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniiet Aeromonas caviae. L’organisme modèle Caenorhabditis elegans est une communauté qui fournit un modèle d’infection excellent par pour l’étude de la pathogénie bactérienne d’Aeromonas. Ici, nous présentons trois expériences différentes afin d’étudier les infection à Aeromonas en utilisant un modèle de c. elegans , y compris la survie, la toxicité liquide et dosages de nécrose musculaire. Les résultats des trois méthodes de détermination de la virulence de Aeromonas concordaient. A. dhakensis s’est avéré être le plus toxique parmi les 4 principales espèces d’Aeromonas provoquant des infections cliniques. Ces méthodes semblent être un moyen pratique d’évaluer la toxicité entre et au sein des espèces d’Aeromonas et contribuer à notre compréhension de la pathogenèse de l’infection à Aeromonas .

Introduction

L’agent pathogène humain, Aeromonas, a été démontré cliniquement provoque des gastro-entérites, infections de plaies, septicémie et voies urinaires infections^1,2. Plus des maladies humaines associées ont été signalés à être associés à quatre espèces bactériennes : Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniiet Aeromonas caviae ^{2,3 , 4 , 5}. parmi les maladies infectieuses Aeromonas , infections des tissus mous peuvent entraîner une morbidité et mortalité chez l’homme. Noter, nécrose musculaire est la forme la plus sévère d’infection des tissus mous⁶. Observation de la survie et la nécrose musculaire Caenorhabditis elegans après que infection est une méthode pratique permettant de spéculer la toxicité d’Aeromonas.

Les scientifiques ont déjà développé de nombreux organismes modèles pour l’étude des infections bactériennes. Dans des études précédentes, souris, zebrafishes et les nématodes ont servi des modèles animaux pour l’étude de la pathogénie et la virulence de Aeromonas^6,7,8. Chaque modèle animal a ses « avantages et applications. L’organisme modèle, Caenorhabditis elegans, est un nématode scuticociliés quelles bactéries apports comme foodnaturally. C. elegansa mis au point un système compliqué d’immunitaire inné contre les infections bactériennes au cours de son évolution. Sous le stress d’une infection bactérienne, c. elegans s’est avéré pour être un modèle d’infection excellent pour l’étude de la pathogénie bactérienne de Aeromonas^6,7,9 et d’autres agents pathogènes comme le champignon¹⁰ et entérohémorragique Escherichia coli O157 : H7¹¹. Cependant, il n’y a encore aucune publication qui met l’accent sur la méthodologie en utilisant le c. elegans comme modèle pour l’étude de la virulence de Aeromonas.

Ici, nous présentons trois expériences différentes afin d’étudier les infection à Aeromonas à l’aide de c. elegans comme modèle animal : dosages pour la survie, la toxicité liquide et nécrose musculaire. Ces méthodes sont un moyen pratique d’évaluer la toxicité entre et au sein des espèces d’Aeromonas et améliorer la compréhension de la pathogenèse de Aeromonas.

Protocole

1. préparation du milieu de Culture

NOTE : Voir le tableau 1 pour la préparation de la solution.

1. Pour préparer le M9 moyenne¹², dissoudre 1,5 g de KH₂PO₄, 5,66 g Na₂HPO₄et 2,5 g de NaCl dans 500 mL d’eau désionisée. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min. attendez que refroidie à température ambiante et puis ajouter 0,5 mL de 1 M MgSO₄ avant la première utilisation.
2. Pour la préparation des nématodes de la croissance moyenne (NGM)¹², dissoudre 3 g NaCl peptone bactérienne de 2,5 g et agar de 20 g dans 1 L d’eau déionisée. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min. attendez que refroidi à 55 ° C dans un bain d’eau et puis ajouter 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de cholestérol de 5 % dans l’éthanol et 25 mL de tampon phosphate. Tourbillon pour bien mélanger.
3. Verser environ 5 mL de NGM dans chaque boîte de pétri de 6 cm. Éviter la production de bulles à la surface des tôles. Laisser les plaques à température ambiante pendant 1 nuit et paquet à conserver à 4 ° C. Ramener à température ambiante avant utilisation.
4. Pour la préparation enrichie NGM (ENGM), dissoudre 3 g NaCl peptone bactérienne de 5 g, 1 g d’extrait de levure et agar 30 g dans 1 L d’eau déionisée. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min. attendez que refroidi à 55 ° C dans un bain d’eau et ajouter 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de cholestérol de 5 % dans l’éthanol et 25 mL de tampon phosphate. Tourbillon pour bien mélanger.
5. Verser environ 10 mL ENGM dans chaque boîte de pétri de 9 cm. Éviter la production de bulles à la surface des tôles. Laisser les plaques à température ambiante pendant 1 nuit et paquet à conserver à 4 ° C. Ramener à température ambiante avant utilisation.
6. Pour préparer S moyen¹², citrate de potassium de 1 M 40 mL S basale, 0,4 mL de mélange, trace de 0,4 mL métaux solution, 0,12 mL de 1 M CaCl₂, 0,12 mL de 1 M MgSO₄, 40 µL de cholestérol de 5 % dans l’éthanol et 1 mL de 8 mM FudR avant utilisation.

2. synchronisation de c. elegans^6,9,12

1. Laver les vers environ 2 000 dans la phase d’adultes gravides avec 10 mL d’eau désionisée stérile dans un tube de 15 mL. Lavez les bactéries 3 x, garder les vers au fond du tube.
2. Centrifuger l’échantillon pendant 1 min à 500 x g à tirer vers le bas les vers. Retirez le surnageant et garder les vers à 3,5 mL d’eau désionisée.
3. Ajouter 1 mL de NaOCl (10 – 15 %) et 0,5 mL 5 M KOH dans le tube. Mélanger uniformément en brassant pour < 6 min à lyser les corps du ver.
4. Après que les œufs sont libérés vers, ajouter 10 mL d’eau désionisée pour arrêter la lyse. Centrifuger pendant 1 min à 1 200 g pour tirer vers le bas les oeufs et éliminer le surnageant autant que possible. Laver avec 15 mL M9 moyenne au moins 3 x.
   Remarque : Reportez-vous à l’étape 1.1 pour la composition du milieu de M9.
5. Conserver les oeufs dans un milieu 1 mL M9. Transport des oeufs dans un plat de 3,5 cm pour incubation à 20 ° C pendant une nuit (environ 12 à 18 h).
   Remarque : Après l’incubation, les œufs vont éclore pour la larve qui s’appelle le premier stade de larve (L1) à vis sans fin.
6. Pipette à 10 µL de L1 vers dans un milieu M9. Compter le nombre de ver et calculer la concentration de L1 vers chez M9 moyen.
7. Semences au plus 10 000 incubés worms de stade L1 avec une pipette sur une plaque ENGM 9 cm parsemé d’Escherichia coli OP50.
   1. Dans cette étape, tartinade 0,5 mL cultivé du jour au lendemain e. coli OP50 avec bouillon Luria-Bertani (LB) sur la plaque ENGM 9 cm. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 16-18 h
      Remarque : Pour éviter toute contamination, l’étape de propagation doit être effectuée sous une hotte à flux laminaire.
   2. Refroidir à température ambiante avant de semer vers L1. Semences au plus 10 000 incubés vers stade L1 sur la plaque ENGM avec e. coli OP50.
8. Incuber les vers à 20 ° C pour 44 h ou jusqu'à ce qu’ils cultivent le stade de larve (L4)^th 4.
   Remarque : Voir l’étape 1.3 pour la composition du milieu ENGM. Un ver a un point blanc en forme de demi-lune au milieu du côté du corps au stade L4.
9. Utilisez le L4 synchronisée étape vers de terre dans les épreuves suivantes. Utilisez le type sauvage que N2 vers de terre dans le test de survie de c. elegans avec Aeromonas dhakensis et le test de toxicité liquide c. elegans avec Aeromonas dhakensis. Utiliser les vers de RW1596 (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) dans l’essai de nécrose musculaire de c. elegans avec Aeromonas dhakensis.

3. test de survie c. elegans avec Aeromonas^6,9

1. Le jour de l’ensemencement L1 worms sur le ENGM étalé avec e. coli OP50, choisir une seule colonie de chacun des quatre souches d’Aeromonas ou e. coli OP50 et culture avec 2 mL du bouillon LB respectivement à 37 ° C pendant 16 h.
   Remarque : Pour éviter toute contamination, cette étape doit être effectuée sous une hotte à flux laminaire. Ici, les souches bactériennes suivantes ont été utilisées : e. coli OP50, la source de nourriture normale de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, la première entièrement séquencé pathogènes cliniques dhakensis a. isoler. A. hydrophila A2-066, a. veronii A2-007 et a. caviae A2-9307121 sont des isolats cliniques représentative de la National Cheng Kung University Hospital.
2. Mesurer l’absorbance de₆₀₀ OD de bouillon bactérienne et ajuster le bouillon de culture bactérienne pour OD₆₀₀ = 2.0 avec bouillon LB.
3. Repérer et diffuser 30 µL de bouillon bactérienne chaque plaque NGM 6 cm. Culture du jour au lendemain les plaques à température ambiante.
   Remarque : Voir l’étape 1.2 pour la composition du milieu NGM.
4. Le jour que les vers L1 croître sur la scène de L4, au hasard choisir et transfert 50 vers à une plaque NGM avec chacune des quatre souches d’Aeromonas ou e. coli OP50.
5. Incuber les plaques NGM à 20 ° C jusqu'à ce que le test est terminé.
6. Transférer tous les vers vivants à un NGM nouvellement préparé sur plaque avec des bactéries et comptent le nombre de vivants, morts, et le capteur vers chaque jour jusqu'à ce que le dernier ver est mort.
   Remarque : Transférer vers une plaque NGM fraîchement préparés chaque jour pour le maintien de l’infection, même si vers stérile à l’aide (p. ex.glp-4, ou avec FudR).
7. Tracer les courbes de survie basés sur le calcul de données tous les jours.

4. analyse de toxicité liquide c. elegans avec Aeromonas⁷

Remarque : Pour éviter toute contamination, les étapes doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire.

1. Le jour après l’ensemencement les vers L1 sur la plaque ENGM parsemée d’e. coli OP50, choisir une seule colonie de chacune des quatre souches d’Aeromonas et e. coli OP50 et culture 5 ml bouillon LB chaque à 37 ° C pendant 16 h.
   Remarque : Dans le protocole, les souches de bactéries suivantes ont été utilisées : e. coli OP50, la source de nourriture normale de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, la première entièrement séquencé pathogènes cliniques dhakensis a. isoler. A. hydrophila A2-066, a. veronii A2-007 et a. caviae A2-9307121 sont des isolats cliniques représentative de la National Cheng Kung University Hospital.
2. Mesurer l’absorbance de₆₀₀ OD du bouillon de bactéries.
3. Centrifuger le bouillon bactérien à 3 500 x g pendant 15 min retirer le bouillon LB. Remettre en suspension les bactéries et ajuster le bouillon de culture bactérienne pour OD₆₀₀ = 3.0 avec S moyenne. Ajouter 195 µL de bouillon bactérienne dans un milieu S au moins 8 puits d’une plaque de 96 puits.
   Remarque : Voir l’étape 1.6 pour la composition du milieu S.
4. Laver les vers L4 sur la plaque ENGM avec e. coli OP5 utilisant le milieu M9. Ajuster la solution ver à une concentration de 5 vers par µL et ajouter 5 µL de la solution de ver dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Veiller à ce qu’il y a environ 25 vers par puits.
5. Incuber la plaque 96 puits sur un agitateur à 200 tr/min à 25 ° C.
6. Compter le nombre de vers vivants et les morts vers après 24, 48 et 72 h. calculent le taux de survie de chaque puits avec la formule suivante : (Live vers/Total vers) × 100 %.
7. Dessiner un graphique de parcelle de nuages de points avec le calcul de données tous les jours.

5. c. elegans Muscle nécrose dosage avec Aeromonas⁶

Remarque : Pour éviter toute contamination, ces étapes doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire.

1. Ce jour-là, les vers L1 sont ensemencées sur le ENGM parsemée d’e. coli OP50, prélever une colonie unique de chacun des quatre souches d’Aeromonas et e. coli OP50 et culture avec 2 mL LB de bouillon chaque à 37 ° C pendant 16 h.
   Remarque : Ici, les souches de bactéries suivantes ont été utilisées : e. coli OP50, la source de nourriture normale de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, la première entièrement séquencé pathogènes cliniques dhakensis a. isoler. A. hydrophila A2-066, a. veronii A2-007 et a. caviae A2-9307121 sont des isolats cliniques représentative de la National Cheng Kung University Hospital.
2. Mesurer l’absorbance de₆₀₀ OD du bouillon bactéries et ajuster le bouillon de bactéries à OD₆₀₀ = 2.0 avec bouillon LB. Repérer et diffuser 30 µL de bouillon bactérienne sur des plaques NGM 6 cm. Culture du jour au lendemain les plaques à température ambiante.
3. Ce jour-là les L1 vers atteignent le stade L4, transfert 50 vers pour chaque plaque NGM avec chacune des quatre souches d’Aeromonas ou e. coli OP50. Incuber les plaques NGM à 20 ° C. Transfert vers toutes les 24 h à plaques NGM nouvellement préparés avec des bactéries.
4. Prendre des photos de muscle à l’aide d’un microscope à fluorescence.
   1. Choisir au hasard 10 vers sur un gel d’agarose de 2 % dans le milieu de la M9 sur une diapositive. Paralyser les vers en utilisant 2 µL de l’azide de sodium à 1 % dans le milieu de la M9 sur gel d’agarose pour moins de 5 min avant de prendre des images.
   2. Placez une lamelle couvre-objet et capturer les images de muscle à l’aide d’un vert protéine fluorescente (GFP) filtrer sur un microscope à fluorescence avec dispositif à couplage de charge caméra. Capturer les images de muscle à 24, 48 et 72 h après le stade L4.
5. Mener des image analyse et figure la préparation avec une logiciel de traitement d’image.
   Remarque : Les définitions des scores et les niveaux de dommages musculaires sont indiquées à la Figure 3, pour lequel les critères sont énumérés comme suit : 3 points pour les fibres musculaires manquantes ; 2 points pour les fibres musculaires ruptures ou cassées ; 1 point pour les fibres musculaires courbés ; 0 point pour les fibres du muscle sains.

6. statistiques Analyses

1. Effectuer toutes les expériences au moins trois fois indépendamment.
2. Utilisez la méthode de Kaplan-Meier pour évaluer les essais de survie de c. elegans et le test de Mantel-Haenzel en analysant les différences de survie. La valeur de signification statistique à 0,05.
3. Test t de Student permet d’analyser les résultats statistiques, les essais de toxicité liquide c. elegans pour les deux groupes différents. Utiliser le sens unique test ANOVA dans l’analyse des différences entre les valeurs de trois ou plus pour une variable indépendante. La valeur de signification statistique à 0,05.

Résultats

En suivant les protocoles décrits ci-dessus, il est facile de différencier les toxicités des quatre souches d’Aeromonas . Le test de survie de c. elegans est illustré à la Figure 1. Le taux de survie c. elegans infectés par des espèces d’Aeromonas , indiqués dans l’ordre de haut en bas : a. caviae, a. veronii, a. hydrophila et a. dhakensis. Bien qu’il y a diversité en termes de toxicité ...

Discussion

C. elegans est un nématode scuticociliés qui naturellement bactéries apports comme nourriture et a développé une immunité innée compliquée aux bactéries au cours de son processus évolutif. Deux des principaux organes soutenant l’immunité sont l’épiderme et l’intestin^9,13. L’épiderme et les bandes de muscle de c. elegans ressemblent à des structures de tissus mous dans les mammifères et les êtres humains^6...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shaker incubator	YIH DER	LM-570R	Bacteria incubation
K2HPO4	J.T.Baker	MP021519455	Culture medium preparation
KH2PO4	J.T.Baker	3246-05	Culture medium preparation
Na2HPO4	J.T.Baker	MP021914405	Culture medium preparation
NaCl	SIGMA	31434	Culture medium preparation
MgSO4	SIGMA	M7506	Culture medium preparation
agar	Difco	214530	Culture medium preparation
CaCl2	SIGMA	C1016	Culture medium preparation
cholesterol	SIGMA	C8503	Culture medium preparation
ethanol	SIGMA	32205	Culture medium preparation
KOH	SIGMA	P5958	Culture medium preparation
6 cm Petri plate	ALPHA PLUS	46	agar plate preparation
96-well plate	FALCON	353072	liquid assay
bacterial peptone	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Culture medium preparation
yeast extract	SIGMA	92144	Culture medium preparation
citric acid•H2O	SIGMA	C1909	Culture medium preparation
tri-potassium citrate•H2O	SIGMA	104956	Culture medium preparation
FudR	SIGMA	1271008	Culture medium preparation
disodium EDTA	SIGMA	E1644	Culture medium preparation
FeSO4•7 H2O	SIGMA	215422	Culture medium preparation
MnCl2•4 H2O	SIGMA	221279	Culture medium preparation
ZnSO4•7 H2O	SIGMA	204986	Culture medium preparation
CuSO4•5 H2O	SIGMA	C8027	Culture medium preparation
tryptone	SIGMA	16922	Culture medium preparation
Microscope system	Nikon	Eclipase Ti inverted	microscope imaging
Scientific CCD Camera	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	microscope imaging