Valutazione di virulenza e patogenesi dell'infezione da Aeromonas in un modello di Caenorhabditis elegans

Riepilogo

Qui, presentiamo tre diversi esperimenti per studiare l'infezione di Aeromonas in c. elegans. Utilizzando questi metodi convenienti, è facile valutare la tossicità tra e all'interno della specie dell'Aeromonas .

Abstract

L'agente patogeno umano Aeromonas ha dimostrato clinicamente di causare la gastroenterite, infezioni della ferita, setticemia e infezioni delle vie urinarie. Malattie più umane sono stati segnalati per essere associati con quattro specie di batteri: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila dell'Aeromonas veroniie Aeromonas caviae. L'organismo di modello Caenorhabditis elegans è un bacterivore che fornisce un modello di infezione eccellente da cui studiare la patogenesi batterica dell'Aeromonas. Qui, presentiamo tre diversi esperimenti per studiare Aeromonas infezione utilizzando un modello di c. elegans , compreso la sopravvivenza, liquido tossicità e le analisi di necrosi del muscolo. I risultati dei tre metodi determinare la virulenza dell'Aeromonas sono stati coerenti. A. dhakensis è stato indicato per essere la più tossica tra le 4 principali specie di Aeromonas causando infezioni cliniche. Questi metodi sono indicati per essere un modo conveniente per valutare la tossicità tra e all'interno della specie dell'Aeromonas e contribuiscono alla nostra comprensione della patogenesi dell'infezione dell'Aeromonas .

Introduzione

L'agente patogeno umano, Aeromonas, ha dimostrato clinicamente di causare la gastroenterite, infezioni della ferita, setticemia e infezioni delle vie urinarie^1,2. Più associate malattie umane sono state segnalate per essere associati con quattro specie batteriche: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila dell'Aeromonas veroniie Aeromonas caviae ^{2,3 , 4 , 5}. tra Aeromonas malattie infettive, infezioni del morbido-tessuto possono causare grave morbilità e mortalità negli esseri umani. Della nota, la necrosi del muscolo è la forma più grave di tessuti molli infezione⁶. Osservazione della sopravvivenza e la necrosi del muscolo di Caenorhabditis elegans dopo l'infezione è un metodo conveniente di cui speculare la tossicità dell'Aeromonas.

Gli scienziati hanno già sviluppato numerosi organismi modello per studiare le infezioni batteriche. Negli studi precedenti, topi, zebrafishes e nematodi sono stati utilizzati come modelli animali per studiare la patogenesi e la virulenza di Aeromonas^6,7,8. Ogni modello animale ha sua ' vantaggi e applicazioni. L'organismo di modello, elegans di Caenorhabditis, è un nematode bacterivorous quali batteri le assunzioni come foodnaturally. C. elegansha sviluppato un complicato sistema immunitario innato contro l'infezione batterica nel corso della sua evoluzione. Sotto lo stress di infezione batterica, c. elegans ha dimostrato di essere un modello di infezione eccellente per studiare la patogenesi batterica di Aeromonas^6,7,9 e altri agenti patogeni come fungo¹⁰ ed enterohaemorrhagic Escherichia coli O157: H7¹¹. Tuttavia, non c'è ancora nessuna pubblicazione che si concentra sulla metodologia utilizzando c. elegans come modello per studiare la virulenza dell'Aeromonas.

Qui, presentiamo tre diversi esperimenti per studiare Aeromonas infezione usando c. elegans come modello animale: saggi per la sopravvivenza, la tossicità liquido e necrosi del muscolo. Questi metodi sono un modo pratico per valutare la tossicità tra e all'interno della specie dell'Aeromonas e migliorare la comprensione della patogenesi dell'Aeromonas.

Protocollo

1. preparazione del terreno di coltura

Nota: Vedere la tabella 1 per la preparazione di soluzione.

1. Per preparare M9 medio¹², sciogliere 1,5 g di KH₂PO₄, 5,66 g di Na₂HPO₄e 2,5 g di NaCl in 500 mL di acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 20 min. attendere fino a quando raffreddato a temperatura ambiente e poi aggiungere 0,5 mL di 1 M MgSO₄ prima del primo utilizzo.
2. Per preparare del nematode crescita medio (NGM)¹², sciogliere 3 g NaCl, peptone batterica 2,5 g e 20 g di agar in 1 L di acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 20 min. attendere fino a quando raffreddato a 55 ° C in un bagno di acqua e poi aggiungere 1 mL di 1 M CaCl₂, 1 mL di 1 M MgSO₄, 1 mL di colesterolo di 5% in etanolo e 25 mL di tampone fosfato. Ricciolo per mescolare bene.
3. Versare circa 5 mL di NGM in ogni 6 cm di Petri. Evitare la produzione di bolle sulla superficie della piastra. Lasciare le piastre a temperatura ambiente per 1 notte e pacchetto per risparmiare a 4 ° C. Riportare a temperatura ambiente prima dell'uso.
4. Per preparare arricchito NGM (ENGM), sciogliere 3 g NaCl, peptone batterica 5 g, 1 g di Estratto di lievito e 30 g di agar in 1 L di acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 20 min. attendere fino a quando raffreddato a 55 ° C a bagnomaria e aggiungere 1 mL di 1 M CaCl₂, 1 mL di 1 M MgSO₄, 1 mL di colesterolo di 5% in etanolo e 25 mL di tampone fosfato. Ricciolo per mescolare bene.
5. Versare circa 10 mL ENGM in ogni capsula di Petri di 9 cm. Evitare la produzione di bolle sulla superficie della piastra. Lasciare le piastre a temperatura ambiente per 1 notte e pacchetto per risparmiare a 4 ° C. Portare a temperatura ambiente prima dell'uso.
6. Per preparare S medio¹², mescolare il citrato di potassio basale, 1 M 0,4 mL 40 mL S, traccia 0,4 mL metalli soluzione, 0,12 mL di 1 M CaCl₂, 0,12 mL di 1 M MgSO₄, 40 µ l di colesterolo del 5% in etanolo e 1 mL di 8mm FudR prima dell'uso.

2. sincronizzazione dei elegans del c.^6,9,12

1. Lavare circa 2.000 vermi nella fase gravid-adulto con 10 mL di acqua deionizzata sterile in una provetta da 15 mL. Lavare i batteri 3 x, mantenendo i vermi nella parte inferiore del tubo.
2. Centrifugare il campione per 1 min a 500 x g per tirare giù i vermi. Rimuovere il surnatante e mantenere i vermi in 3,5 mL di acqua deionizzata.
3. Aggiungere 1 mL NaOCl (10 – 15%) e 0,5 mL 5 M KOH nella provetta. Mix in modo uniforme agitando per < 6 min a lisare i corpi di verme.
4. Dopo le uova vengono rilasciate dai vermi, aggiungere 10 mL di acqua deionizzata per fermare la lisi. Centrifugare per 1 min a 1.200 x g per tirare giù le uova e rimuovere il surnatante per quanto possibile. Lavare con 15ml M9 media almeno 3 volte.
   Nota: Vedere il punto 1.1 per la composizione del mezzo M9.
5. Conservare le uova in media 1 mL M9. Uova di trasporto per un piatto di 3,5 cm per incubazione a 20 ° C per una notte (circa 12 – 18 h).
   Nota: Dopo l'incubazione, le uova si schiudono per vite senza fine della larva che si chiama come primo stadio di larva (L1).
6. Pipettare fuori 10 µ l di L1 vermi nel mezzo di M9. Contare il numero di vite senza fine e calcolare che la concentrazione di L1 vermi nel mezzo di M9.
7. Seme al massimo 10.000 incubate vermi di fase L1 con una pipetta su una zolla ENGM 9cm sparsa con Escherichia coli OP50.
   1. In questo passaggio, diffusione 0,5 mL coltivato durante la notte OP50 Escherichia coli con brodo di Luria-Bertani (LB) sulla piastra ENGM 9cm. Incubare la piastra a 37 ° C per 16 – 18 h
      Nota: Per evitare contaminazioni, il passo di diffusione dovrebbe essere eseguito in una cappa a flusso laminare.
   2. Raffreddare a temperatura ambiente prima della semina L1 vermi. Seme al massimo 10.000 incubate vermi fase L1 sulla piastra ENGM con Escherichia coli OP50.
8. Incubare i vermi a 20 ° C per 44 ore o fino a quando non si sviluppano per la 4^° tappa della larva (L4).
   Nota: Vedere il passaggio 1.3 per la composizione del mezzo ENGM. Un verme presenta una macchia bianca a forma di mezzaluna a metà del lato del corpo nella fase di L4.
9. Utilizzare la L4 sincronizzato fase vermi nei seguenti saggi. Uso selvaggio tipo N2 vermi in analisi di sopravvivenza di c. elegans con Aeromonas dhakensis e il dosaggio di liquido tossicità di c. elegans con Aeromonas dhakensis. Utilizzare RW1596 worm (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) nell'analisi di c. elegans muscolo necrosi con il dhakensis dell'Aeromonas.

3. analisi di sopravvivenza di c. elegans con Aeromonas^6,9

1. Il giorno di semina L1 worm su ENGM diffusione con Escherichia coli OP50, prendere una singola colonia di ciascuno dei quattro ceppi di Aeromonas o e. coli OP50 e cultura con 2 mL di brodo LB rispettivamente a 37 ° C per 16 h.
   Nota: Per evitare contaminazioni, questo passaggio deve essere eseguito in una cappa a flusso laminare. Qui, sono stati utilizzati i seguenti ceppi batterici: e. coli OP50, la fonte di cibo normale di C. elegans. A. dhakensis AAK1, il primo completamente sequenziato patogeni clinica dhakensis a. isolare. A. hydrophila A2-066, a. veronii A2-007 e a. caviae A2-9307121 sono isolati clinici rappresentativo da National Cheng Kung University Hospital.
2. Misurare l'assorbanza di₆₀₀ OD di brodo batterico e regolare il brodo batterico a OD₆₀₀ = 2.0 con libbra di brodo.
3. Individuare e diffondere 30 µ l di brodo batterico ogni piastra NGM di 6 cm. Le piastre a temperatura ambiente della coltura durante la notte.
   Nota: Vedere il passaggio 1.2 per la composizione del mezzo NGM.
4. Il giorno che i vermi L1 crescono sul palco di L4, casualmente di pick e transfer 50 vermi ad una piastra del NGM con ciascuna delle quattro ceppi di Aeromonas o e. coli OP50.
5. Incubare le piastre NGM a 20 ° C fino a quando il test è finito.
6. Trasferire tutti i vermi di vita a un piatto appena preparato NGM con batteri e conteggio i numeri di vivono, morti, e vermi sensore ogni giorno fino a quando l'ultimo worm è morto.
   Nota: Trasferimento worm ad una piastra NGM preparato fresco ogni giorno per il mantenimento dell'infezione, anche se utilizzando sterile vermi (ad es.glp-4, o con FudR).
7. Tracciare le curve di sopravvivenza secondo il calcolo di dati giornalieri.

4. c. elegans liquido saggio di tossicità con Aeromonas⁷

Nota: Per evitare contaminazioni, la procedura deve essere eseguita in una cappa a flusso laminare.

1. Il giorno dopo la semina i vermi L1 sulla piastra ENGM sparsa con Escherichia coli OP50, scegliere una singola colonia di ciascuno dei quattro ceppi di Aeromonas ed Escherichia coli OP50 e cultura con 5 mL di libbra di brodo ogni a 37 ° C per 16 h.
   Nota: Nel protocollo, sono stati utilizzati i seguenti ceppi di batteri: Escherichia coli OP50, la fonte di cibo normale di C. elegans. A. dhakensis AAK1, il primo completamente sequenziato patogeni clinica dhakensis a. isolare. A. hydrophila A2-066, a. veronii A2-007 e a. caviae A2-9307121 sono isolati clinici rappresentativo da National Cheng Kung University Hospital.
2. Misurare l'assorbanza di₆₀₀ OD il brodo di batteri.
3. Centrifugare il brodo batterico a 3.500 x g per 15 min rimuovere la libbra di brodo. Risospendere i batteri e regolare il brodo batterico a OD₆₀₀ = 3.0 con il mezzo di S. Aggiungere 195 µ l di brodo batterico in mezzo S almeno 8 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
   Nota: Vedere il passaggio 1.6 per la composizione del mezzo di S.
4. Lavare i vermi L4 sulla piastra ENGM con Escherichia coli OP5 mezzo M9. Regolare la vite senza fine in soluzione ad una concentrazione di 5 worm al µ l e aggiungere 5 µ l della soluzione verme in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti. Assicurarsi che ci siano circa 25 vermi per pozzetto.
5. Incubare la piastra a 96 pozzetti su un agitatore a 200 giri/min a 25 ° C.
6. Contare il numero di vermi vivi e vermi morti dopo 24, 48 e 72 h. calcolare i tassi di sopravvivenza di ogni bene con la seguente formula: (Live vermi/totale vermi) × 100%.
7. Disegnare un grafico a dispersione con il calcolo giornaliero dei dati.

5. c. elegans muscolo necrosi Assay con Aeromonas⁶

Nota: Per evitare contaminazioni, questa procedura deve essere eseguita in una cappa a flusso laminare.

1. Il giorno che i vermi di L1 sono seminati su ENGM diffondere con Escherichia coli OP50, prendere una singola colonia di ciascuno dei quattro ceppi di Aeromonas ed e. coli OP50 e cultura con 2ml libbra di brodo ogni a 37 ° C per 16 h.
   Nota: Qui, sono stati utilizzati i seguenti ceppi di batteri: Escherichia coli OP50, la fonte di cibo normale di C. elegans. A. dhakensis AAK1, il primo completamente sequenziato patogeni clinica dhakensis a. isolare. A. hydrophila A2-066, a. veronii A2-007 e a. caviae A2-9307121 sono isolati clinici rappresentativo da National Cheng Kung University Hospital.
2. Misurare l'assorbanza di₆₀₀ OD il brodo di batteri e regolare il brodo di batteri a OD₆₀₀ = 2.0 con libbra di brodo. Individuare e diffondere 30 µ l di brodo batterica su piastre di NGM di 6 cm. Le piastre a temperatura ambiente della coltura durante la notte.
3. Il giorno i vermi L1 crescono al livello L4, trasferimento 50 vermi per ogni piatto NGM con ciascuna delle quattro ceppi di Aeromonas o e. coli OP50. Incubare le piastre NGM a 20 ° C. Trasferimento vermi ogni 24 h per appena preparato NGM piastre con batteri.
4. Prendere immagini muscolare utilizzando un microscopio a fluorescenza.
   1. Scegliere casualmente 10 vermi su un gel di agarosio al 2% in mezzo M9 in una diapositiva. Paralizzare i vermi utilizzando 2 µ l di 1% sodio azide in mezzo M9 su agarosio per meno di 5 minuti prima di prendere immagini.
   2. Posizionare un vetrino coprioggetto e catturare le immagini di muscolo utilizzando un verde fluorescente protein (GFP) filtrare su un microscopio a fluorescenza con la macchina fotografica charge coupled device. Catturare le immagini di muscolo a 24, 48 e 72 h dopo la fase di L4.
5. Condurre analisi e figura preparazione dell'immagine con una software di elaborazione di immagini.
   Nota: Le definizioni dei punteggi e i livelli di danno del muscolo sono mostrate in Figura 3, per cui i criteri sono elencati come segue: 3 punti per le fibre muscolari mancante; 2 punti per le fibre di muscolo rotte o rotte; 1 punto per piegato fibre muscolari; 0 punti per fibre di muscolo sane.

6. statistiche analisi

1. Eseguire tutti gli esperimenti un minimo di tre volte in modo indipendente.
2. Utilizzare il metodo di Kaplan-Meier per valutare le analisi di sopravvivenza di c. elegans e utilizzare il test log-rank nell'analizzare le differenze di sopravvivenza. Impostare la significatività statistica a 0,05.
3. Utilizzare test t di Student per analizzare i risultati statistici dei saggi di tossicità liquido di c. elegans per i due diversi gruppi. Utilizzare One-way ANOVA test nell'analizzare le differenze tra tre o più valori per una variabile indipendente. Impostare la significatività statistica a 0,05.

Risultati

Seguendo i protocolli descritti sopra, è facile distinguere tra le tossicità da quattro ceppi di Aeromonas . L'analisi di sopravvivenza di c. elegans è illustrato nella Figura 1. I tassi di sopravvivenza di c. elegans infettati con specie dell'Aeromonas , mostrati in ordine dal più alto al più basso erano: a. caviae, a. veronii, a. hydrophila e a. dhakensis. Anche se c'è diversità in termini di toss...

Discussione

C. elegans è un nematode bacterivorous che naturalmente i batteri le assunzioni come cibo e ha sviluppato un'immunità innata complicati ai batteri durante il suo processo evolutivo. Due dei principali organi mantenere e sostenere l'immunità sono l'epidermide e intestino^9,13. Le bande del muscolo di c. elegans ed epidermide assomigliano le strutture molli in mammiferi ed esseri umani⁶. A causa di queste caratteristiche,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shaker incubator	YIH DER	LM-570R	Bacteria incubation
K2HPO4	J.T.Baker	MP021519455	Culture medium preparation
KH2PO4	J.T.Baker	3246-05	Culture medium preparation
Na2HPO4	J.T.Baker	MP021914405	Culture medium preparation
NaCl	SIGMA	31434	Culture medium preparation
MgSO4	SIGMA	M7506	Culture medium preparation
agar	Difco	214530	Culture medium preparation
CaCl2	SIGMA	C1016	Culture medium preparation
cholesterol	SIGMA	C8503	Culture medium preparation
ethanol	SIGMA	32205	Culture medium preparation
KOH	SIGMA	P5958	Culture medium preparation
6 cm Petri plate	ALPHA PLUS	46	agar plate preparation
96-well plate	FALCON	353072	liquid assay
bacterial peptone	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Culture medium preparation
yeast extract	SIGMA	92144	Culture medium preparation
citric acid•H2O	SIGMA	C1909	Culture medium preparation
tri-potassium citrate•H2O	SIGMA	104956	Culture medium preparation
FudR	SIGMA	1271008	Culture medium preparation
disodium EDTA	SIGMA	E1644	Culture medium preparation
FeSO4•7 H2O	SIGMA	215422	Culture medium preparation
MnCl2•4 H2O	SIGMA	221279	Culture medium preparation
ZnSO4•7 H2O	SIGMA	204986	Culture medium preparation
CuSO4•5 H2O	SIGMA	C8027	Culture medium preparation
tryptone	SIGMA	16922	Culture medium preparation
Microscope system	Nikon	Eclipase Ti inverted	microscope imaging
Scientific CCD Camera	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	microscope imaging