הערכת התקפה אלימה ו פתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans

Summary

כאן, אנחנו מציגים 3 ניסויים שונים כדי ללמוד זיהום Aeromonas C. elegans. באמצעות שיטות אלה נוח, קל להעריך את הרעילות בין מיני ותוך מיני Aeromonas .

Abstract

פתוגניות Aeromonas הוכח קלינית לגרום דלקת הקבה והמעים, הפצע, ספטיסמיה דלקות בדרכי השתן. רוב המחלות האנושיות דווחו להיות מזוהה עם ארבעה מינים של חיידקים: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Aeromonas caviae. האורגניזם דגם Caenorhabditis elegans הוא bacterivore זה מספק מודל הידבקות מעולה שבו ללמוד חיידקי בפתוגנזה של Aeromonas. כאן, אנחנו מציגים 3 ניסויים שונים כדי ללמוד זיהום Aeromonas באמצעות מודל של C. elegans , כולל הישרדות, רעילות נוזלי של מבחני נמק שריר. התוצאות של שלוש שיטות לקביעת של התקפה אלימה של Aeromonas היו עקביים. Dhakensis א הוצגה רעיל ביותר בין הגדולות Aeromonas מינים גרימת זיהומים קליניים. שיטות אלה מוצגים להיות דרך נוחה כדי להעריך את הרעילות בין מיני ותוך מיני Aeromonas ולתרום להבנת בפתוגנזה של זיהום Aeromonas .

Introduction

פתוגניות, Aeromonas, הוכח קלינית לגרום דלקת הקבה והמעים, הפצע, ספטיסמיה דלקות בדרכי השתן בזיהומים^1,2. ביותר הקשורים מחלות האדם דווחו להיות מזוהה עם ארבעת המינים חיידקי: ^2, Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Aeromonas caviae ^{3 , 4 , 5}. בין מחלות זיהומיות Aeromonas , דלקות ברקמות הרכות עלולה לגרום לזיהום חמור בבני אדם. ראוי לציין, נמק שריר היא הצורה החמורה ביותר של זיהום רקמות רכות⁶. תצפית של הישרדות, נמק שריר של Caenorhabditis elegans לאחר ההדבקה היא שיטה נוחה שלפיו לשער הרעילות של Aeromonas.

מדענים פיתחו כבר אורגניזמים רבים דגם ללמוד זיהומים חיידקיים. במחקרים קודמים, עכברים zebrafishes, נמטודות שימשו כמודלים חיים ללמוד הפתוגנזה של התקפה אלימה של^7,6, Aeromonas⁸. כל המודל החייתי יש שלה "יתרונות ויישומים. האורגניזם מודל, Caenorhabditis elegans, היא תולעים נימיות bacterivorous אילו חיידקים intakes כמו foodnaturally. C. elegansפיתחה מערכת חיסונית מולדת מסובך נגד זיהום חיידקי במהלך האבולוציה שלה. תחת הלחץ של זיהום חיידקי, C. elegans הוכח להיות מודל זיהום מצוינת ללמוד חיידקי בפתוגנזה של Aeromonas^6,7,9 , פתוגנים אחרים כמו פטריה¹⁰ ו- enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7¹¹. עם זאת, יש עדיין אין פרסום המתמקד המתודולוגיה בשימוש C. elegans כמודל ללימוד של התקפה אלימה של Aeromonas.

. כאן, אנחנו מציגים 3 ניסויים שונים כדי ללמוד Aeromonas זיהום באמצעות C. elegans כמו במודל חיה: מבחני הישרדות, רעילות נוזלי של נמק שריר. שיטות אלה הן דרך נוחה להעריך הרעילות בין מיני ותוך מיני Aeromonas , לשפר את ההבנה של הפתוגנזה של Aeromonas.

Protocol

1. הכנת המדיום תרבות

הערה: ראה טבלה 1 להכנה פתרון.

1. כדי להכין M9 בינוני¹², להמיס 1.5 גר'₂פו ח'₄, g 5.66 של Na-₂-HPO-₄ו- 2.5 גר' NaCl ב 500 מ"ל מים יונים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דק עד מקורר לטמפרטורת החדר ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ של 1 מ' MgSO₄ לפני השימוש הראשון.
2. כדי להכין נמטודות צמיחה בינוני (NGM)¹², להמיס 3g NaCl, peptone חיידקי 2.5 g, ו- 20 גרם אגר ב- 1 ליטר של מים יונים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דק עד מקורר עד 55 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' CaCl₂, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO₄, 1 מ"ל של 5% כולסטרול אתנול, 25 מ של מאגר פוספט. מערבולת לערבב היטב.
3. יוצקים על 5 מ"ל NGM לתוך כל 6 ס מ פטרי. הימנע לייצור בועות על פני השטח של צלחת. להשאיר צלחות בטמפרטורת החדר במשך לילה 1 וחבילת כדי לשמור על 4 מעלות צלזיוס. להביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
4. כדי להכין מועשר NGM ואקלים, להמיס 3g NaCl, 5 g peptone חיידקי, תמצית שמרים 1 g, ו- 30 גרם אגר ב- 1 ליטר של מים יונים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דק עד מקורר עד 55 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים, ולהוסיף 1 מ"ל של 1 מ' CaCl₂, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO₄, 1 מ"ל של 5% כולסטרול אתנול, 25 מ של מאגר פוספט. מערבולת לערבב היטב.
5. יוצקים על 10 מ"ל ENGM לתוך כל 9 ס מ פטרי. הימנע לייצור בועות על פני השטח של צלחת. להשאיר צלחות בטמפרטורת החדר במשך לילה 1 וחבילת כדי לשמור על 4 מעלות צלזיוס. מביאים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
6. כדי להכין S בינוני¹², מערבבים 40 מ ל S הבזליים, 0.4 מ ל 1 מ' פוטסיום ציטראט, מעקב מ ל 0.4 מתכות פתרון, 0.12 מ של 1 מ' CaCl₂, 0.12 מ של 1 מ' MgSO₄, 40 µL של 5% כולסטרול אתנול, 1 מ"ל של 8 מ"מ FudR לפני השימוש.

2. סינכרון של C. elegans^6,9,12

1. רחץ תולעים כ-2,000 בשלב םיפתתשמ gravid עם 10 מ ל מים יונים סטרילי בשפופרת 15 מ"ל. לשטוף החוצה את החיידקים 3 x, לשמור את התולעים בתחתית הצינורית.
2. Centrifuge לדוגמה עבור 1 דקות ב x 500 g כדי להוריד את התולעים. הסר את תגובת שיקוע, ולשמור את התולעים יונים 3.5 מ"ל מים.
3. להוסיף 1 mL NaOCl (10-15%) ו- 0.5 מ ל 5 מ' KOH לתוך הצינור. תערובת אחיד ע י ניעור עבור < 6 דקות כדי lyse הגופים תולעת.
4. אחרי הביצים משתחררים מן התולעים, מוסיפים יונים 10 מ"ל מים כדי לעצור את פירוק. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב x 1,200 g כדי לנתץ את הביצים ולהסיר את תגובת שיקוע ככל האפשר. לשטוף עם x לפחות 3 בינוני 15 מ"ל M9.
   הערה: ראה צעד 1.1 ההרכב של M9 בינוני.
5. שמור ביצים 1 מ"ל M9 בינוני. תחבורה ביצים מאכל 3.5 ס"מ עבור הדגירה ב- 20 ° C ללילה אחד (כ ח 12-18).
   הערה: לאחר הדגירה, הביצים יבקעו לתעל זחל אשר נקרא בשם בשלב הראשון פגית (L1).
6. פיפטה החוצה µL 10 התולעים L1 M9 בינוני. לספור את התולעת ולחשב שהריכוז של L1 תולעים M9 בינוני.
7. זרע לכל היותר 10,000 מודגרות L1 הבמה תולעים עם pipet על צלחת ENGM 9 ס מ, מורחים עם Escherichia coli OP50.
   1. בשלב זה, התפשטות 0.5 mL תרבותי בין לילה e. coli OP50 עם מרק לוריא-Bertani (LB) על הצלחת ENGM 9 ס מ. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h
      הערה: כדי למנוע זיהום, הצעד מתפשטת צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.
   2. להתקרר לטמפרטורת החדר לפני זריעה L1 תולעים. זרע לכל היותר 10,000 מודגרות L1 תולעים הבמה בצלחת ENGM עם OP50 e. coli .
8. דגירה התולעים ב- 20 ° C 44 h או עד שהם גדלים לבמה^th פגית (L4) 4.
   הערה: ראה שלב 1.3 להרכב ENGM בינוני. תולעת יש נקודה לבנה בצורת חצי ירח-אמצע הגוף בצד בשלב L4.
9. השתמש L4 מסונכרן על הבמה תולעים את מבחני הבאים. השתמש בסוג הפרוע ש-n2 תולעים וזמינותו להישרדות C. elegans עם Aeromonas dhakensis ואת וזמינותו רעילות נוזלי C. elegans עם Aeromonas dhakensis. השתמש תולעים RW1596 (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) ב- C. elegans נמק שריר וזמינותו עם Aeromonas dhakensis.

3. C. elegans וזמינותו להישרדות עם^6, Aeromonas⁹

1. ביום של זריעה L1 תולעים על ENGM התפשטות עם OP50 e. coli , לבחור מושבה בודדת של כל אחד של ארבעה זנים Aeromonas או e. coli OP50 והתרבות עם 2 מ ל ציר LB בהתאמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
   הערה: כדי למנוע זיהום, שלב זה צריך להתבצע בתוך תא למינארי. כאן, שימשו את זני חיידקים הבאים: e. coli OP50, המקור אוכל רגיל של C. elegans. Dhakensis א AAK1, לבודד הראשון וסודרו באופן מלא פתוגניים קלינית dhakensis א . א hydrophila A2-066 veronii א A2-007, caviae א A2-9307121 הם מבודד representatively קלינית של בית חולים האוניברסיטה הלאומית צ'נג קונג.
2. למדוד את ספיגת₆₀₀ OD מרק חיידקי ולהתאים שהמרק בקטריאלי כדי OD₆₀₀ = 2.0 עם מרק ליברות.
3. לזהות ולהפיץ 30 µL מרק חיידקי שהלוח NGM 6 ס מ. תרבות הלוחות בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
   הערה: ראה שלב 1.2 עבור הרכב NGM בינוני.
4. ביום שהתולעים L1 לגדול על הבמה L4, באופן אקראי לאסוף ולהעביר תולעים 50 ל צלחת NGM עם אחד של ארבעה זנים Aeromonas או OP50 e. coli .
5. דגירה הלוחות NGM ב- 20 ° C עד לסיום וזמינותו.
6. העברת כל התולעים חי צלחת NGM החדש מוכן עם חיידקים, לספור המספרים של לחיות, מת, חיישן תולעים כל יום עד התולעת האחרון מת.
   הערה: להעביר תולעים צלחת NGM מוכן טרי כל יום לשם קיום זיהום, גם אם באמצעות תולעים סטרילי (לדוגמהglp-4, או עם FudR).
7. להתוות את עקומות הישרדות מבוסס על חישוב נתונים יומי.

4. C. elegans Assay רעילות נוזלי עם Aeromonas⁷

הערה: כדי למנוע זיהום, צעדים צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.

1. יום לאחר זריעה התולעים L1 על הצלחת ENGM פזורים OP50 e. coli , לבחור מושבה בודדת של כל אחד של ארבעה זנים Aeromonas ו- e. coli OP50, והתרבות 5 מ ל ציר ליברות כל ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
   הערה: בפרוטוקול, זני חיידקים הבאים שימשו: e. coli OP50, המקור אוכל רגיל של C. elegans. Dhakensis א AAK1, לבודד הראשון וסודרו באופן מלא פתוגניים קלינית dhakensis א . א hydrophila A2-066 veronii א A2-007, caviae א A2-9307121 הם מבודד representatively קלינית של בית חולים האוניברסיטה הלאומית צ'נג קונג.
2. למדוד את ספיגת₆₀₀ OD ציר חיידקים.
3. Centrifuge שהמרק בקטריאלי ב x 3,500 g למשך 15 דקות להסיר שהמרק ליברות. Resuspend החיידק ולהתאים שהמרק בקטריאלי כדי OD₆₀₀ = 3.0 S בינונית. להוסיף µL 195 מרק חיידקי S בינוני לפחות 8 בארות של צלחת 96-ובכן.
   הערה: ראה שלב 1.6 על ההרכב של S בינוני.
4. לשטוף את התולעים L4 בצלחת ENGM עם e. coli OP5 באמצעות M9 בינוני. להתאים את הפתרון תולעת ריכוז של תולעים 5 לכל µL ולהוסיף 5 µL של הפתרון תולעת מכל קידוח של צלחת 96-ובכן. ודא כי ישנם כ 25 תולעים לכל טוב.
5. דגירה על הלוחית 96-ובכן מטרף-200 סל ד ב 25 º C.
6. לספור את מספר בשידור חי תולעים, תולעים מתים לאחר 24, 48, 72 ח' חשב שיעורי ההישרדות של כל טוב עם הנוסחה הבאה: (תולעים תולעים בשידור חי/סה כ) × 100%.
7. צייר גרף פיזור מגרש עם החישוב נתונים יומי.

5. C. elegans שריר נמק Assay עם Aeromonas⁶

הערה: כדי למנוע זיהום, שלבים אלה צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.

1. ביום שהתולעים L1 הם נזרע על ENGM להתפשט עם OP50 e. coli , לבחור מושבה בודדת של כל אחד של ארבעה זנים Aeromonas ו- e. coli OP50 והתרבות עם 2 מ ל LB מרק כל ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
   הערה: כאן, שימשו את זני חיידקים הבאים: e. coli OP50, המקור אוכל רגיל של C. elegans. Dhakensis א AAK1, לבודד הראשון וסודרו באופן מלא פתוגניים קלינית dhakensis א . א hydrophila A2-066 veronii א A2-007, caviae א A2-9307121 הם מבודד representatively קלינית של בית חולים האוניברסיטה הלאומית צ'נג קונג.
2. למדוד את ספיגת₆₀₀ OD ציר חיידקים ולהתאים שהמרק חיידקים כדי OD₆₀₀ = 2.0 עם מרק ליברות. לזהות ולהפיץ 30 µL מרק חיידקי על צלחות NGM 6 ס מ. תרבות הלוחות בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
3. ביום לגדל התולעים L1 לבמה L4, תולעים 50 העברת כל צלחת NGM עם אחד של ארבעה זנים Aeromonas או OP50 e. coli . דגירה הלוחות NGM ב 20 º C. להעביר תולעים כל 24 שעות החדש מוכן NGM צלחות עם חיידקים.
4. קח תמונות שריר באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
   1. נבחר באקראי 10 תולעים על 2% agarose ג'ל מדיום M9 בשקופית. לשתק את התולעים באמצעות 2 µL של אזיד הנתרן 1% במדיום M9 על agarose עבור פחות מ 5 דקות לפני לקיחת תמונות.
   2. המקום מכסה, ללכוד את התמונות שריר באמצעות ירוקה חלבון פלואורסצנטי (GFP) לסנן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם תשלום מצמידים מכשיר המצלמה. ללכוד את התמונות שריר בגיל 24, 48, 72 h פוסט על הבמה L4.
5. התנהגות הכנה לניתוח ודמות תמונה עם תמונה בתוכנת עיבוד.
   הערה: ציוני לבין רמות נזק השריר המיובאים והקיימים מוצגות באיור 3, שעבורם הקריטריון מפורטים כדלקמן: 3 נקודות על סיבי השריר חסר; 2 נקודות עבור סיבי שריר קרוע או שבורים; 1 נקודה עבור סיבי השריר מכופף; 0 נקודות עבור סיבי שריר בריא.

6. ניתוחים סטטיסטיים

1. לבצע ניסויים כל מינימום של שלוש פעמים באופן עצמאי.
2. השתמש בשיטת קפלן-מאייר כדי להעריך את מבחני הישרדות של C. elegans , והשתמש לבדוק את יומן-דרגה ניתוח הישרדות הבדלים. להגדיר מובהקות סטטיסטית 0.05.
3. השתמש בשם מבחן t של סטודנט כדי לנתח את התוצאות הסטטיסטיות של מבחני רעילות נוזלי C. elegans עבור שתי הקבוצות השונות. השתמש במבחן חד-כיווני אנובה בניתוח הבדלים בין שלושה ערכים או יותר אחד המשתנה הבלתי תלוי. להגדיר מובהקות סטטיסטית 0.05.

תוצאות

לפי הפרוטוקולים שתוארו לעיל, קל להבחין בין רעילות של זנים Aeromonas 4. וזמינותו להישרדות של C. elegans מוצג באיור1. שיעורי ההישרדות של C. elegans נגוע Aeromonas מינים, שמוצג צו מגבוה לנמוך היו: א caviae, veronii א, א hydrophila, ו dhakensis א. למרות שיש גיוון מבחינת...

Discussion

C. elegans הוא תולעים נימיות bacterivorous זה טבעי intakes חיידקים כמזון, פיתחה חיסון מולדת מסובך חיידקים במהלך התהליך האבולוציוני שלו. שני האיברים החיוניים לתחזוקה ותמיכה החסינות הן האפידרמיס והמעי^9,13. האפידרמיס ואת להקות של שריר של C. elegans דומים המבנים ברקמות ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shaker incubator	YIH DER	LM-570R	Bacteria incubation
K2HPO4	J.T.Baker	MP021519455	Culture medium preparation
KH2PO4	J.T.Baker	3246-05	Culture medium preparation
Na2HPO4	J.T.Baker	MP021914405	Culture medium preparation
NaCl	SIGMA	31434	Culture medium preparation
MgSO4	SIGMA	M7506	Culture medium preparation
agar	Difco	214530	Culture medium preparation
CaCl2	SIGMA	C1016	Culture medium preparation
cholesterol	SIGMA	C8503	Culture medium preparation
ethanol	SIGMA	32205	Culture medium preparation
KOH	SIGMA	P5958	Culture medium preparation
6 cm Petri plate	ALPHA PLUS	46	agar plate preparation
96-well plate	FALCON	353072	liquid assay
bacterial peptone	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Culture medium preparation
yeast extract	SIGMA	92144	Culture medium preparation
citric acid•H2O	SIGMA	C1909	Culture medium preparation
tri-potassium citrate•H2O	SIGMA	104956	Culture medium preparation
FudR	SIGMA	1271008	Culture medium preparation
disodium EDTA	SIGMA	E1644	Culture medium preparation
FeSO4•7 H2O	SIGMA	215422	Culture medium preparation
MnCl2•4 H2O	SIGMA	221279	Culture medium preparation
ZnSO4•7 H2O	SIGMA	204986	Culture medium preparation
CuSO4•5 H2O	SIGMA	C8027	Culture medium preparation
tryptone	SIGMA	16922	Culture medium preparation
Microscope system	Nikon	Eclipase Ti inverted	microscope imaging
Scientific CCD Camera	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	microscope imaging