Оценки вирулентности и патогенез Aeromonas инфекции в Caenorhabditis elegans модели

Резюме

Здесь мы представляем три различных экспериментов для изучения Aeromonas инфекции в C. elegans. Используя эти удобные методы, это легко для оценки токсичности между и внутри Aeromonas видов.

Аннотация

Человеческий патоген Aeromonas было клинически показано, чтобы причинить гастроэнтерита, раневые инфекции, сепсис и мочевыводящих путей. Большинство человеческих заболеваний, как сообщается, быть связаны с четырьмя видами бактерий: Aeromonas dhakensis, аэромонадами hydrophila, Aeromonas veroniiи Aeromonas caviae. Модельный организм Caenorhabditis elegans является bacterivore, который обеспечивает отличную инфекции модель изучить бактериальных патогенеза Aeromonas. Здесь мы представляем три различных экспериментов для изучения Aeromonas инфекции с использованием модели C. elegans , включая выживание, жидкие токсичности и анализов некроз мышц. Результаты трех методов определения вирулентности Aeromonas согласуются. A. dhakensis , было показано, что наиболее токсичных среди 4 основных вида Aeromonas , вызывая клинической инфекции. Эти методы представлены быть удобным способом для оценки токсичности между и внутри Aeromonas видов и способствовать нашему пониманию патогенеза Aeromonas инфекции.

Введение

Клинически доказано человеческий патоген, Aeromonas, причинить гастроэнтерита, раневые инфекции, сепсис и мочевых инфекций^1,2. Ассоциироваться с четырех бактериальных видов были зарегистрированы наиболее ассоциированных заболеваний человека: Aeromonas dhakensis, аэромонадами hydrophila, Aeromonas veroniiи Aeromonas caviae ^{2,3 , 4 , 5}. среди Aeromonas инфекционные заболевания, инфекции мягких тканей может привести к тяжелой заболеваемости и смертности в организме человека. Следует отметить некроз мышц является наиболее тяжелой формой инфекции мягких тканей⁶. Наблюдение за выживание и некроз мышц Caenorhabditis elegans после инфекции является удобным способом спекулировать на токсичность Aeromonas.

Ученые уже разработали многочисленные модели организмов для изучения бактериальных инфекций. В предыдущих исследованиях мышей, zebrafishes и нематод использовались как животных моделей для изучения патогенеза и вирулентности Aeromonas^6,,78. Каждое животное модель имеет свой ' преимущества и приложений. Модельный организм, Caenorhabditis elegans, представляет нематода bacterivorous какие потребления бактерий как foodnaturally. C. elegansразработал сложный врожденной иммунной системы против бактериальной инфекции в течение его эволюции. Под напряжение, бактериальной инфекции C. elegans было доказано быть отличным инфекции модель для изучения бактериальных патогенеза Aeromonas^6,7,9 и другие патогены как гриб¹⁰ и инфекции, вызванной энтерогеморрагической кишечной палочки O157: H7¹¹. Однако есть еще не публикации, которая фокусируется на методологии использования C. elegans в качестве модели для изучения вирулентности Aeromonas.

Здесь, мы представляем три различных экспериментов для изучения Aeromonas инфекции с помощью C. elegans как животной модели: анализы для выживания, жидкие токсичности и некроз мышц. Эти методы являются удобным способом для оценки токсичности между и внутри Aeromonas видов и улучшения понимания патогенеза Aeromonas.

протокол

1. Подготовка питательной среды

Примечание: См. таблицу 1 для приготовления раствора.

1. Подготовить M9 средних¹², растворяют 1,5 г х₂PO₄, 5,66 g Na₂HPO₄и 2,5 г NaCl в 500 мл деионизованной воды. Автоклавированием при температуре 121 ° C в течение 20 минут ждать, пока остынет до комнатной температуры, а затем добавить 0,5 мл 1 М MgSO₄ перед первым использованием.
2. Чтобы подготовить нематоды роста среднего (НГМ)¹², Растворите 3 g NaCl, бактериальных Пептон 2.5 g и 20 g агар в 1 Л деионизированной воды. Автоклавированием при температуре 121 ° C в течение 20 минут ждать, пока остынет до 55 ° C на водяной бане, а затем добавить 1 мл CaCl 1 M₂, 1 мл 1 М MgSO₄, 1 мл 5% холестерина в этаноле и 25 мл фосфатного буфера. Вихрем перемешать.
3. Наливайте около 5 мл NGM в каждый 6 см Петри. Избегайте пузырь производства на поверхности пластины. Оставьте пластины при комнатной температуре на 1 ночь и пакет для сохранения при 4 ° C. Вернуть к комнатной температуре перед использованием.
4. Чтобы подготовить обогащенного NGM (ENGM), растворяют 3 g NaCl, 5 g бактериальных Пептон, экстракт дрожжей 1 g и 30 g агар в 1 Л деионизированной воды. Автоклавированием при температуре 121 ° C в течение 20 минут подождать, пока остынет до 55 ° C в ванне с водой и добавить 1 мл CaCl 1 M₂, 1 мл 1 М MgSO₄, 1 мл 5% холестерина в этаноле и 25 мл фосфатного буфера. Вихрем перемешать.
5. Наливайте около 10 мл ENGM в каждом 9 см Петри. Избегайте пузырь производства на поверхности пластины. Оставьте пластины при комнатной температуре на 1 ночь и пакет для сохранения при 4 ° C. Привести к комнатной температуре перед использованием.
6. Подготовить S средних¹², смешать цитрат калия 40 мл S базальной, 0,4 мл 1 M, решение, 0,12 мл CaCl 1 М₂, 0,12 мл 1 М MgSO₄, 40 мкл 5% холестерина в этаноле и 1 мл 8 мм FudR перед использованием металлов 0,4 мл трассировки.

2. Синхронизация C. elegans^6,9,12

1. Мыть около 2000 червей в стадии беременных Взрослый с 10 мл стерильной обессоленной воды в 15 мл. Промойте бактерий 3 x, держим червей в нижней части трубки.
2. Центрифуга для образца за 1 мин на 500 x g тянуть вниз червей. Удалить супернатант и держать червей в 3,5 мл деионизированной воды.
3. Добавьте 1 mL NaOCl (10 – 15%) и 0,5 мл 5 M Кох в трубу. Смесь равномерно встряхнув для < 6 мин лизируют тела червя.
4. После того, как яйца освобождаются от червей, добавьте 10 мл деионизированной воды, чтобы остановить lysis. Центрифуги для 1 мин на 1200 x g тянуть вниз яйца и удалить супернатант насколько это возможно. Промойте средних по крайней мере 3 x 15 мл M9.
   Примечание: Смотрите шаг 1.1 для состава среднего M9.
5. Храните яйца в 1 мл M9 среде. Транспортировать яйца в 3,5 см блюдо для инкубации при 20 ° C на одну ночь (примерно 12-18 ч).
   Примечание: После инкубации яиц вылупятся червь личинки, который называется первой стадии личинки (L1).
6. Пипетка из 10 мкл L1 червей в среде M9. Подсчитать количество червя и рассчитать концентрацию L1 червей в среде M9.
7. Семя более 10000 инкубировали L1 стадии червей с пипетки на 9 см ENGM плиты с ОР50 кишечная палочка .
   1. В этом шаге распространение 0,5 мл на ночь культивированный E. coli ОР50 отваром Бертани Лурия (LB) на пластину ENGM 9 см. Инкубировать пластины при 37 ° C для 16-18 ч
      Примечание: Чтобы избежать загрязнения, распространяя шаг должен выполняться в Ламинарный шкаф.
   2. Охладите до комнатной температуры перед посевом L1 червей. Семя более 10000 инкубировали L1 стадии червей на ENGM табличке с E. coli ОР50.
8. Инкубируйте червей при 20 ° C для 44 h, или до тех пор, пока они растут на стадии личинки (L4) 4^тыс .
   Примечание: Смотрите Шаг 1.3 для состава ENGM среды. Червь имеет белая точка в форме полумесяца на середине тела стороне на стадии L4.
9. Используйте синхронизированные L4, этап червей в следующем анализов. Использование дикого типа N2 червей в C. elegans assay выживаемости с Aeromonas dhakensis и пробирной жидкости токсичности C. elegans с Aeromonas dhakensis. Использование RW1596 червей (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) в C. elegans assay некроз мышц с Aeromonas dhakensis.

3. C. elegans Assay выживаемости с Aeromonas^6,9

1. В день посева L1 червей на распространение с E. coli ОР50 ENGM выберите один колонии каждого из четырех Aeromonas штаммов или E. coli ОР50 и культуры с 2 мл LB отвара соответственно при 37 ° C для 16 h.
   Примечание: Чтобы избежать заражения, этот шаг должен выполняться в Ламинарный шкаф. Здесь были использованы следующие штаммы бактерий: E. coli ОР50, нормальное питание источник C. elegans. A. dhakensis AAK1, первый полностью виртуализированных патогенных клинических A. dhakensis изолировать. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 и A. caviae А2-9307121 являются репрезентивно клинических изолятов от национального Ченг Кунг университетской больницы.
2. Измерение поглощения₆₀₀ ОД бактериальных бульона и корректировать бактериальных бульон ОД₆₀₀ = 2.0 с LB отвара.
3. Месте и распространение 30 мкл бактериальных бульон каждая пластина NGM 6 см. На ночь культуры пластин при комнатной температуре.
   Примечание: Смотрите Шаг 1.2 состав NGM среднего.
4. На следующий день L1 червей расти на сцену L4 случайным образом выбрать и передачи 50 червей NGM пластины с каждым из четырех Aeromonas штаммов или кишечной палочки ОР50.
5. Инкубируйте NGM пластины при 20 ° C до завершения анализа.
6. Передать все живые черви свежеподготовленные NGM пластины с бактериями и подсчитать количество живой, мертвой, а датчик глистов каждый день до тех пор, пока последний червь мертв.
   Примечание: Передать червей свежий подготовленный NGM пластины каждый день для поддержания инфекции, даже если с помощью стерильных червей (напримерglp-4, или с FudR).
7. Участок на основе ежедневных данных расчет кривых выживания.

4. C. elegans жидкого токсичности Assay с Aeromonas⁷

Примечание: Чтобы избежать заражения, шаги должны выполняться в Ламинарный шкаф.

1. На следующий день после посева L1 червей на ENGM табличке с E. coli ОР50, выбрать один колонии каждого из четырех Aeromonas штаммы E. coli ОР50 и культуры с 5 мл LB отвара при 37 ° C для 16 h.
   Примечание: В протоколе, были использованы следующие штаммы бактерий: E. coli ОР50, нормальное питание источник C. elegans. A. dhakensis AAK1, первый полностью виртуализированных патогенных клинических A. dhakensis изолировать. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 и A. caviae А2-9307121 являются репрезентивно клинических изолятов от национального Ченг Кунг университетской больницы.
2. Измерьте absorbance₆₀₀ ОД бактерии бульона.
3. Центрифуга бактериальных бульон на 3500 x g на 15 минут, чтобы удалить LB отвара. Ресуспензируйте бактерии и отрегулировать бактериальных бульон ОД₆₀₀ = 3.0 с S среднего. Мкл 195 бактериальной бульон в среде S для по крайней мере 8 скважин 96-луночных плиты.
   Примечание: Смотрите Шаг 1.6 для состава S среды.
4. Смывают червей L4 на ENGM табличке с E. coli ОП5 с помощью M9 среднего. Отрегулируйте червь решение к концентрации 5 червей за мкл и добавить 5 мкл раствора червя в каждой скважине 96-луночных пластины. Убедитесь, что существует примерно 25 червей за хорошо.
5. Инкубировать 96-луночных пластины на шейкер на 200 об/мин при 25 ° C.
6. Подсчитать количество живой червей и мертвых червей после 24, 48 и 72 ч. рассчитать выживаемость каждой скважины с использованием следующей формулы: (Черви живут черви/общее) × 100%.
7. Нарисуйте точечная диаграмма с ежедневных расчетов данных.

5. C. elegans Assay некроз мышц с Aeromonas⁶

Примечание: Чтобы избежать заражения, эти шаги должны выполняться в Ламинарный шкаф.

1. В день L1 черви являются семенами на распространение с E. coli ОР50 ENGM, выбрать один колонии каждого из четырех Aeromonas штаммы E. coli ОР50 и культуры с 2 мл LB отвара при 37 ° C для 16 h.
   Примечание: Здесь были использованы следующие штаммы бактерий: E. coli ОР50, нормальное питание источник C. elegans. A. dhakensis AAK1, первый полностью виртуализированных патогенных клинических A. dhakensis изолировать. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 и A. caviae А2-9307121 являются репрезентивно клинических изолятов от национального Ченг Кунг университетской больницы.
2. Измерить ОД₆₀₀ поглощения бактерий бульона и отрегулировать бактерии бульон ОД₆₀₀ = 2.0 с LB отвара. Месте и распространение 30 мкл бактериальной бульон на 6 см NGM пластины. На ночь культуры пластин при комнатной температуре.
3. В день L1 червей расти на сцену L4, передачи 50 червей для каждой NGM пластины с каждым из четырех Aeromonas штаммов или кишечной палочки ОР50. Инкубировать NGM пластины при 20 ° C. Передача червей каждые 24 ч для недавно подготовленных NGM пластины с бактериями.
4. Возьмите мышцы изображения с помощью микроскопа флуоресценции.
   1. Случайным образом выберите 10 червей на 2% гель агарозы в среде M9 на слайде. Парализовать червей, используя 2 мкл азид натрия 1% в среде M9 на агарозе менее чем 5 минут прежде чем принимать фотографии.
   2. Поместите крышку выскальзования и захвата изображения мышц, используя Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) фильтр на флуоресцентный микроскоп с зарядовой камеры. Захвата изображения мышц на 24, 48 и 72 ч после этапа L4.
5. Проведите анализ и фигура Подготовка образа с обработки изображений программное обеспечение.
   Примечание: Определения баллы и уровни повреждения мышц показаны на рисунке 3, для которой критерии перечислены следующим: 3 очка за отсутствующих мышечных волокон; 2 балла за разрыв или сломанные мышечных волокон; 1 очко для изогнутых мышечных волокон; 0 очков для здорового мышечных волокон.

6. Статистический анализ

1. Выполните все эксперименты как минимум три раза независимо.
2. Используйте метод Каплана-Мейера для оценки нематоды Caenorhabditis elegans выживания анализов и лог ранг тест в анализе различия на выживание. Установить статистической значимости 0,05.
3. Используйте t критерия Стьюдента для анализа статистические результаты анализов жидких токсичности C. elegans для двух разных групп. Используйте одностороннюю теста ANOVA, анализируя различия между тремя или более значениями для одной независимой переменной. Установить статистической значимости 0,05.

Результаты

Следуя протоколы, описанные выше, это легко различать токсичность из четырех Aeromonas штаммов. Выживание пробирного C. elegans показан на рисунке 1. C. elegans инфицированных Aeromonas видов, в порядке от высокой к низкой выживаемости были: A. caviae, A. v...

Обсуждение

C. elegans является bacterivorous нематод, что естественно воздухозаборники бактерий как еда и разработал сложный врожденный иммунитет к бактерии в ходе эволюционного процесса. Два главных органов, техническое обслуживание и поддержание иммунитета являются эпидермиса и кишки⁹...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shaker incubator	YIH DER	LM-570R	Bacteria incubation
K2HPO4	J.T.Baker	MP021519455	Culture medium preparation
KH2PO4	J.T.Baker	3246-05	Culture medium preparation
Na2HPO4	J.T.Baker	MP021914405	Culture medium preparation
NaCl	SIGMA	31434	Culture medium preparation
MgSO4	SIGMA	M7506	Culture medium preparation
agar	Difco	214530	Culture medium preparation
CaCl2	SIGMA	C1016	Culture medium preparation
cholesterol	SIGMA	C8503	Culture medium preparation
ethanol	SIGMA	32205	Culture medium preparation
KOH	SIGMA	P5958	Culture medium preparation
6 cm Petri plate	ALPHA PLUS	46	agar plate preparation
96-well plate	FALCON	353072	liquid assay
bacterial peptone	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Culture medium preparation
yeast extract	SIGMA	92144	Culture medium preparation
citric acid•H2O	SIGMA	C1909	Culture medium preparation
tri-potassium citrate•H2O	SIGMA	104956	Culture medium preparation
FudR	SIGMA	1271008	Culture medium preparation
disodium EDTA	SIGMA	E1644	Culture medium preparation
FeSO4•7 H2O	SIGMA	215422	Culture medium preparation
MnCl2•4 H2O	SIGMA	221279	Culture medium preparation
ZnSO4•7 H2O	SIGMA	204986	Culture medium preparation
CuSO4•5 H2O	SIGMA	C8027	Culture medium preparation
tryptone	SIGMA	16922	Culture medium preparation
Microscope system	Nikon	Eclipase Ti inverted	microscope imaging
Scientific CCD Camera	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	microscope imaging