Enumeración exacta del folículo en ovarios adultos del ratón

Resumen

Aquí, describimos, comparamos, y ponemos en contraste dos diversas técnicas para la cuenta exacta del folículo de tejidos ováricos fijos del ratón.

Resumen

Las hembras que se reproducen sexualmente nacen con su suministro de ovocitos durante toda su vida. Los ovocitos inmaduros y quietos se encuentran dentro de los folículos primordiales, la unidad de almacenamiento de la línea germinal femenina. No son renovables, por lo que su número al nacer y la posterior tasa de pérdida dictan en gran medida la esperanza de vida fértil de la mujer. La cuantificación precisa del número de folículos primordiales en mujeres y animales es esencial para determinar el impacto de los medicamentos y tóxicos en la reserva ovárica. También es necesario para evaluar la necesidad y el éxito de las técnicas de preservación de la fertilidad existentes y emergentes. Actualmente, no existen métodos para medir con precisión el número de folículos primordiales que comprenden la reserva ovárica en las mujeres. Además, la obtención de tejido ovárico de animales grandes o especies en peligro de extinción para la experimentación a menudo no es factible. Por lo tanto, los ratones se han convertido en un modelo esencial para tales estudios, y la capacidad de evaluar los números de folículos primordiales en ovarios enteros de ratón es una herramienta crítica. Sin embargo, los informes de los números absolutos del folículo en ovarios del ratón en la literatura son altamente variables, haciendo difícil comparar y/o replicar datos. Esto se debe a una serie de factores que incluyen la tensión, la edad, los grupos de tratamiento, así como las diferencias técnicas en los métodos de conteo empleados. En este artículo, proporcionamos una guía instructiva paso a paso para preparar secciones histológicas y contar folículos primordiales en ovarios de ratón utilizando dos métodos diferentes: [1] estereología, que se basa en la técnica de fraccionador / disector óptico; y [2] la técnica de conteo directo. Se destacarán algunas de las principales ventajas e inconvenientes de cada método para que se pueda mejorar la reproducibilidad en el campo y para que los investigadores puedan seleccionar el método más adecuado para sus estudios.

Introducción

Los ovocitos inmaduros, meiotically-arrestados almacenados dentro de los folículos primordiales en el ovario son la unidad de almacenamiento para la línea germinal femenina y comprenden la reserva ovárica de por vida de un individuo. Los números de folículos primordiales disminuyen naturalmente con la edad^{de 1,}o alternativamente, pueden agotarse prematuramente después de la exposición a productos químicos exógenos, incluidos algunos productos farmacéuticos y tóxicos ambientales en el aire, los alimentos y el agua^2. Dado que el número de folículos primordiales es finito, la cantidad y calidad de los folículos presentes en el ovario determinan en gran medida la fertilidad femenina y la salud de la descendencia. Así, la cuantificación exacta del número primordial del folículo en mujeres es esencial para evaluar los impactos fuera de la blanco de insultos exógenos en la reserva ovárica.

En las mujeres, el análisis de todo el ovario generalmente no es posible, por lo que las medidas sustitutas no invasivas de la reserva ovárica deben utilizarse en un entorno clínico. La hormona anti-mϋlleriana (AMH) es el biomarcador sustituto más utilizado clínicamente³. Los niveles séricos de AMH a menudo se miden en mujeres de edad materna avanzada, o antes y después del tratamiento del cáncer, como la quimioterapia. Sin embargo, la AMH es producida por folículos en crecimiento y no por folículos primordiales, y por lo tanto, los niveles séricos no informan sobre el número absoluto de folículos primordiales.

Con la ausencia de métodos para determinar con precisión el número de folículos primordiales en mujeres in situ,el recuento de folículos ováricos en modelos animales pequeños, como los roedores, sigue siendo una herramienta de investigación esencial para evaluar el grado en que los insultos exógenos impactan en los folículos primordiales y, por lo tanto, en la fertilidad. Desafortunadamente, sin embargo, los informes a lo largo de la literatura de los números de folículos primordiales en modelos de roedores son altamente^{variables 4}. Una de las principales razones de esto son las diferencias técnicas ampliamente reportadas en el método de conteo empleado. Predominantemente, hay dos técnicas diferentes descritas en la literatura para enumerar folículos primordiales en ratones. Estos incluyen la estereología, que emplea el método de disector óptico del fraccionador, y los recuentos directos de folículos.

La estereología es ampliamente considerada el patrón oro, ya que utiliza el muestreo aleatorio uniforme sistemático^5,por lo que es el método más preciso de cuantificar el número de folículos primordiales en ratones enteros, o ovarios de rata^4,6,7. La estereología es imparcial, ya que explica la estructura tridimensional del objeto de interés⁸. Utilizando un método de disector/fraccionador óptico, se aplican tres niveles de muestreo para cuantificar los folículos primordiales utilizando secciones gruesas de tejido (por ejemplo, 20 μm) dentro de una fracción conocida del ovario total del ratón. En primer lugar, se elige el intervalo de muestreo (por ejemplo, cada^3ª sección) al azar (fracción de muestreo 1, f₁₎^4. Las secciones se muestrea de una manera sistemática y uniforme desde este punto hasta todo el ovario. Luego, un marco de conteo imparcial se superpone sobre la sección ovárica y se mueve progresivamente a lo largo de una cuadrícula de conteo definida y aleatoria (fracción de muestreo 2, f₂₎^8. Por último, se muestrea ópticamente una fracción conocida del espesor de la sección (por ejemplo, 10 μm) y se cuentan los folículos dentro de esta área (fracción de muestreo 3, f₃₎^4. El número de folículos en bruto se multiplica por la inversa de estas fracciones de muestreo para obtener el valor final. Este método requiere capacitación y equipo de expertos, incluido un microscopio con una etapa motorizada impulsada por un software estereológico. Los tejidos deben preservarse en un fijador especializado de Bouin, e incrustarse en resina de glicolmetacrilato para permitir que las secciones gruesas de tejido se corten utilizando un microtome de resina de glicolmetacrilato con un cuchillo de vidrio. Este método está diseñado para explicar la contracción y deformación de los tejidos, para preservar mejor la estructura morfológica tridimensional del ovario y los folículos^9.

El conteo directo de folículos es el método más utilizado para contar folículos¹⁰. Se pueden usar fijadores más comunes (es decir, formol), seguidos de incrustación de cera de parafina y seccionamiento en serie exhaustivo utilizando un microtomo estándar a un espesor de entre 4-6 μm. Los folículos se cuentan sistemáticamente en toda la sección del tejido en un intervalo definido, y luego se multiplican por la inversa del intervalo de muestreo para obtener la estimación del folículo total. Este método es rápido, fácil, se puede realizar usando tejidos archivados, y preparado usando técnicas histológicas estándar. Requiere solamente un microscopio ligero con capacidades estándar de la proyección de imagen. Sin embargo, a pesar de estas ventajas, el conteo directo de folículos carece de la precisión y los parámetros de conteo estrictos de la estereología, lo que lo hace más propenso al sesgo del investigador. Además, los tejidos pueden sufrir contracción y deformación durante el procesamiento, interrumpiendo la integridad y la morfología del ovario y, por lo tanto, dificultando la clasificación y cuantificación del folículo.

El objetivo de este artículo es describir dos métodos de uso común para evaluar cuantitativamente el número de folículos primordiales en los ovarios de ratón: estereología y recuento directo de folículos. Proporcionaremos protocolos detallados para estos dos métodos y destacaremos algunas de sus fortalezas y debilidades, con el fin de mejorar la reproducibilidad en nuestro campo y permitir a los investigadores tomar una decisión informada del método de conteo más apropiado para sus estudios.

Protocolo

Los ovarios se recogieron de ratones hembra C57BL6J. Todos los procedimientos y experimentos con animales se realizaron de conformidad con el Código australiano de prácticas para el cuidado y uso de animales de la NHMRC y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Plataforma de Investigación Animal de Monash.

NOTA: Un agente quimioterapéutico demostrado para agotar los ovocitos del folículo primordial, según lo determinado usando la estereología¹¹ y las cuentas directas^12,13 fue utilizado en este informe para comparar los dos métodos de cuenta en el mismo animal. Hembra, 8-week-old (adulto joven) ratones fueron pesados antes de una sola inyección intraperitoneal de 75 mg/kg/bodyweight del ciclofosfamida, o control salino del vehículo (n=5/group). Se ha demostrado que esta dosis causa un agotamiento aproximado del 50% de los folículos primordiales, pero no se ha informado que cause morbilidad o mortalidad en ratones^14. Los ovarios fueron cosechados 48 horas después del tratamiento. Un ovario de cada animal se fijó en una solución de formalina tamponada neutra al 10% (v/v) durante 24 horas, y el otro se fijó en la solución de Bouin durante 24 horas. A continuación, el tejido se incrustó en resina de glicolmetacrilato y se seccionó en serie a 20 μm, o en parafina y se seccionó en serie a 5 μm. Todos los tejidos fueron manchados con Schiff y hematoxylin ácidos periódicos.

1. Preparación histológica: fijación, procesamiento, incrustación y seccionamiento de ovarios de ratón

1. Diseccione los ovarios de ratón recortando el oviducto y toda la grasa circundante, sin dañar o cortar el ovario en sí. Si es necesario, utilice un microscopio de disección y una cuchilla fina para este paso (Figura 1A).
2. Fije los tejidos inmediatamente colocándolos en un pequeño tubo etiquetado que contenga el fijador de Bouin (estereología) o el fijador de formalina (recuentos directos) durante 24 horas(Figura 1B),antes de transferir los tejidos al etanol al 70%.
   NOTA: La morfología del folículo se conserva mejor dentro del tejido ovárico fijo de Bouin, incrustado en la resina de glicolmetacrilato(Figura 2).
3. Procese ovarios fijos enteros y luego incruste en resina de glicolmetacrilato para estereología(Archivo Suplementario 1),o cera de parafina para recuentos directos utilizando un protocolo histológico estándar.
   PRECAUCIÓN: La resina es tóxica, así que asegúrese de que todos los pasos de procesamiento de tejido se realizan en una campana extractora de humos y guantes se usan en todo momento.
4. Utilice un microtomo especializado en metacrilato de resina(Figura 1C)equipado con un cuchillo de vidrio(Figura 1D)para cortar exhaustivamente secciones gruesas de resina de glicolmetacrilato (por ejemplo, 20 μm). Recoja las secciones a intervalos regulares (por ejemplo, cada^3ª sección) en portaobjetos de microscopio de vidrio para estereología.
5. Utilice un microtomo estándar para cortar secciones delgadas de parafina (por ejemplo, 4-6 μm). Recoja las secciones del tejido en un intervalo regular (e.g., cada^9ta sección) en una diapositiva del microscopio de cristal para las cuentas directas del folículo.
6. Manche los portaobjetos con ácido periódico Schiff y hematoxilina (Expediente Suplementario 2).
7. Cubrebocas con DPX estándar para secciones de parafina, o DPX grueso para secciones de resina de glicolmetacrilato (Figura 1E).
   PRECAUCIÓN: La resina de glicolmetacrilato DPX es peligrosa, así que realice este paso en la campana extractora de humos.
   NOTA: La resina de glicolmetacrilato DPX es extremadamente viscosa. La cubierta de vidrio debe adherirse firmemente presionando hacia abajo con una espátula para garantizar que la DPX esté dispersa de manera uniforme y fina, y que no haya burbujas de aire presentes debajo de la cubierta(Figura 1F).

2. Estimación estereológica del número de folículos primordiales utilizando el fraccionador óptico

1. Encienda la computadora, la unidad de control múltiple, la cámara y la fuente de luz dentro de la configuración de estereología y establezca el objetivo del microscopio en un aumento bajo (por ejemplo, 10x).
2. Abra el software de estereología.
3. Coloque el primer portaobjetos de forma segura en la etapa del microscopio.
4. Ajuste la exposición a la luz marcando Automático en Exposición en el panel Ajustes de la cámara ( Figurasuplementaria 1A). Alternativamente, ajuste manualmente la exposición a la luz.
5. Utilice el joystick para localizar la primera muestra de tejido y enfocar la muestra.
6. Ajuste el balance de blancos, ya sea haciendo clic en Más ajustes (ubicado en la parte inferior derecha del panel Configuración de la cámara), y luego haga clic en Balance de blancos y haga clic en Automático ( Figurasuplementaria 1B). Como alternativa, haga clic en el botón Balance de blancos junto al botón Más configuraciones (o Seleccione área en Más configuraciones), para establecer el balance de blancos manualmente seleccionando un área blanca en la sección.
7. Vaya al menú desplegable Sondas y haga clic en Flujo de trabajo del fraccionador óptico. A continuación, haga clic en Iniciar nuevo proyecto y haga clic en Aceptar.
   1. Si se ha guardado una configuración de muestreo existente, en Parámetros de muestreo, haga clic en Sí | ... y seleccione la configuración de muestreo deseada.
   2. Si no es así, haga clic en No e introduzca manualmente la información de la sección serie(Figura suplementaria 1C)y defina la configuración de la sonda en el paso 2.13.
8. Haga clic en Siguiente, ajuste el microscopio a Bajo aumento y elija aumento de 10x en el menú desplegable.
9. Haga clic en Siguiente, y luego trace alrededor de toda la sección ovárica – comience haciendo clic izquierdo alrededor de la sección y al final, haga clic derecho y elija Cerrar contorno.
10. Haga clic en Siguiente, ajuste el microscopio a Alta ampliación y elija 100x Aumento de aceite en el menú desplegable.
11. Coloque una gota de aceite en la sección de tejido en el portaobjetos y mueva el objetivo del microscopio a un aumento de 100x.
12. Ajuste la exposición a la luz (como en el paso 2.4) y haga clic en Siguiente.
13. Configure los Parámetros de muestreo para definir la configuración del sondeo. Aquí, el marco de conteo se estableció en 47,5 μm x 47,5 μm (2.256,25 μm²⁾y la longitud del paso se estableció en 100 μm x 100 μm (10.000 μm²⁾(Figura suplementaria 2). Una vez establecidos los parámetros de muestreo, guarde la plantilla y vuelva a abrirla durante las sesiones de análisis posteriores en el paso 2.7.
14. Haga clic en Empezar a contar ( Figura suplementaria1D). Concéntrese en la parte superior de la muestra, haga clic en Aceptar y comience a contar.
15. Utilice la perilla de enfoque para moverse a través de la profundidad de muestreo de 10 μm y contar los folículos primordiales cuyo núcleo de ovocitos entra en foco. Haga clic en Siguiente para desplazarse a la siguiente área.
    1. Clasificar los folículos como primordiales si el ovocito está rodeado de células escamosas (aplanadas) de la granulosa, pero no de células granulosas cuboidales(Figura 2A).
       NOTA: Los folículos primordiales son distintos de los folículos intermedios/transitorios, que comprenden una combinación de células granulosas cuboidales y escamosas(Figura 2B),y folículos primarios, que están rodeados predominantemente por células granulosas cuboidales(Figura 2C). Estas clases foliculares deben cuantificarse por separado.
    2. Sólo cuentan los folículos en los que el núcleo del ovocito es visible. El núcleo del ovocito debe aparecer dentro del marco de conteo o estar tocando las líneas de inclusión verde del marco de conteo (Figura Suplementaria 1E,F).
    3. Si el núcleo del ovocito cae fuera del marco de conteo(Figura Suplementaria 1G)o toca las líneas de exclusión rojas del marco de conteo, no cuente este folículo.
    4. Al evaluar el agotamiento del folículo primordial en respuesta a una sustancia química exógena (por ejemplo, quimioterapia), asegúrese de que todos los folículos contados estén sanos y, por lo tanto, tengan una morfología normal(Figura 2). Cuente los folículos anormales o atretic por separado. A menudo, la muerte del folículo es inducida por insultos como la quimioterapia, y la cuantificación de los folículos atreticos debe obtenerse por separado para distinguir entre folículos sanos y atreticos, ya que sólo los folículos sanos comprenden la reserva ovárica¹⁵.
16. Una vez completado el recuento en esa sección, realice una de las siguientes acciones:
    1. Haga clic en Agregar nueva seccióny, a continuación, vuelva al paso 2.3 para configurar la siguiente sección para el recuento.
    2. Haga clic en He terminado de contar para finalizar la sesión. Devuelva el objetivo a 10x, salga del software de estereología y apague la fuente de luz, la cámara, la unidad de control múltiple y la computadora.
17. Obtenga la suma del número de folículo bruto (Q) de cada sección de tejido muestreada de todo el ovario, luego, utilizando una hoja de cálculo, utilice la ecuación a continuación para obtener el valor final de cada animal replicado (N)^4.
    Dónde:
    N = Número total estimado de folículos dentro del ovario.
    Q = Recuento de folículos primordiales crudos.
    f₁ = Intervalo de muestreo. Cada^3ª sección fue muestreada así.
    f₂ = Relación entre el marco de recuento (área de muestra) y el paso a paso, calculada como . Dado que el área de la muestra era de 2256^{μm 2} (47,5 μm x 47,5 μm) y el área paso a paso era de 10000 μm² (100 μm x 100 μm), .
    f₃ = Fracción de la sección ovárica muestreada. Dado que se muestreó 10 μm de la sección de 20 μm, .
    Por lo tanto, .
    NOTA: Este protocolo describe cómo aplicar estos principios de los análisis estereológicos utilizando un software de estereología ampliamente citado(Tabla de materiales); sin embargo, hay otro software estereológico disponible. Los principios aplicados durante los análisis estereológicos de los folículos ováricos son los mismos, independientemente del software utilizado para configurar los parámetros. La estereología es más precisa cuando se cuentan 100 o más objetos en un ovario de ratón adulto^4,ya que esto da un coeficiente de error para la estimación por debajo del 10%^16. Los parámetros de muestreo descritos aquí se han optimizado para garantizar que un mínimo de aproximadamente 100 objetos (es decir, folículos primordiales, transitorios y primarios) se puedan contar en los ovarios adultos de tipo salvaje C57BL6J de control. Se puede realizar un estudio piloto que incluya un tamaño de muestra pequeño para establecer los parámetros de muestreo óptimos, como el intervalo y el número de secciones a analizar y el número de disectores ópticos dentro de las secciones muestreadas^17.

3. Estimación del número de folículos primordiales por recuentos directos de folículos ováricos

1. Coloque el portaobjetos del microscopio de forma segura bajo un microscopio de luz estándar y realice recuentos directos para obtener el número de folículos primordiales en bruto.
   1. Clasificar los folículos como primordiales si el ovocito es claramente visible y está rodeado de células escamosas (aplanadas) de la granulosa, pero no de células granulosas cuboidales(Figura 2D).
      NOTA: Los folículos primordiales son distintos de los folículos intermedios/transitorios, que comprenden una combinación de células granulosas cuboidales y escamosas(Figura 2E),y folículos primarios, que están rodeados predominantemente por células granulosas cuboidales(Figura 2F). Estas clases foliculares deben cuantificarse por separado.
   2. Asegúrese de que todos los folículos contados estén sanos y por lo tanto tengan una morfología normal (Figura 2). Cuente cualquier folículo anormal o atretic por separado, pues solamente los folículos sanos comprenden la reserva ovárica.
2. Alternativamente, tome múltiples o cosidas fotomicrografías de alta potencia (por ejemplo, 20x) de toda la sección de tejido ovárico para realizar recuentos abriendo los archivos de imagen. Esto se puede hacer manualmente, o utilizando un escáner de diapositivas automatizado.
3. Obtenga la suma del número de folículo bruto (Q) de cada sección de tejido muestreada de todo el ovario en el intervalo predeterminado. Multiplique este número por el inverso de la fracción de muestreo para obtener el valor final para cada animal replicado (N), utilizando la siguiente ecuación.
   Dónde:
   N = Número total estimado de folículos dentro del ovario.
   Q = Recuento de folículos sin procesar (de cada tipo individual, calculado por separado).
   f₁ = Intervalo de muestreo. Cada^9ª sección fue muestreada así.
   Por lo tanto, .

Resultados

Un modelo bien-caracterizado del agotamiento del folículo fue utilizado, por el que los ratones femeninos adultos jovenes fueran administrados una dosis sola de la quimioterapia del ciclofosfamida, o del control salino del vehículo (n=5/group) y ambos ovarios fueron cosechados de cada animal después de 48 horas. Se preparó un ovario por animal como se describe en el Paso 1 para cada uno de los dos métodos: estereología o recuentos directos. El ovario izquierdo y derecho de cada animal fue asignado aleatoriamente a ...

Discusión

Este artículo proporciona un protocolo paso a paso para la técnica del patrón oro para enumerar los folículos primordiales del ratón, la estereología, y el método más comúnmente empleado de cuenta directa del folículo. El tratamiento de quimioterapia fue utilizado para comparar y para contrastar los resultados obtenidos de estos dos diversos métodos dentro del ovario izquierdo y derecho del mismo animal. Ambos métodos revelaron alta variabilidad inter-animal en números primordiales del folículo. Un agotamie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Butanol (HPLC)	Fisher Chemical	#A383-1
Acid alcohol	Amber Scientific	#ACDL
Bouin’s fixative	Sigma-Aldrich	#HT10132	Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)
Cyclophosphamide	Sigma-Aldrich	#C0768-5G
Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)	Sigma-Aldrich	#06522
Ethanol	Amber Scientific	#ETH	Ethanol 100%
Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle	Designs for Vision	#FEA-745-SR	Feather blade for dissections (seen in Figure 1)
Formalin fixative	Australian Biostain	#ANBFC
Glass coverslip	Thermo Scientific	#MENCS22501GP	22 mm x 50 mm
Glycomethacrylate resin RM2165 microtome	Leica Microsystems	#RM2165
Glycolmethacrylate DPX	*made in house		*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks
Histolene	Trajan	#11031
Mayer’s haematoxylin	Amber Scientific	#MH
Olympus BX50 microscope	Olympus	#BX50	Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)
Olympus immersion oil type-F	Olympus	#IMMOIL-F30CC
Olympus TH4-200 light source	Olympus	#TH4-200
Paraffin wax	Sigma-Aldrich	#03987
Periodic acid	Trajan	#PERI1%	Periodic acid 1%
Rotary Microtome CUT 4060	MicroTec	#4060R/F	Used to cut paraffin sections
Schiff’s reagent	Trajan	#SCHF
Scott's tap water	Amber Scientific	#SCOT	Potassium carbonate, magnesium sulphate, water
StereoInvestigator Stereological System	MBF Bioscience		Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick
Superfrost microscope slides	Thermo Scientific	#MENSF41296SP	1 mm, 72 pcs
Technovit 7100 Plastic embedding system	Emgrid Australia	#64709003	500 mL/5 x 1 g/40 mL
Technovit 3040 yellow	Emgrid Australia	#64708805	100 g/80 mL