Yetişkin Fare Yumurtalıklarında Doğru Folikül Numaralandırması

Özet

Burada, sabit fare yumurtalık dokularının doğru folikül sayımı için iki farklı tekniği açıklıyor, karşılaştırıyor ve karşılaştırıyoruz.

Özet

Cinsel olarak üreyen dişi memeliler, ömür boyu oosit tedariki ile doğarlar. Olgunlaşmamış, sessiz oositler, dişi mikrop hattının depolama birimi olan ilkel foliküllerde bulunur. Yenilenemezler, bu nedenle doğumdaki sayıları ve sonraki kayıp oranları büyük ölçüde kadın doğurganlık ömrünü belirler. Kadınlarda ve hayvanlarda ilkel folikül sayılarının doğru ölçülmesi, ilaçların ve toksikantların yumurtalık rezervi üzerindeki etkisini belirlemek için gereklidir. Mevcut ve gelişmekte olan doğurganlık koruma tekniklerine duyulan ihtiyacı ve başarısını değerlendirmek için de gereklidir. Şu anda, kadınlarda yumurtalık rezervini oluşturan ilkel foliküllerin sayısını doğru bir şekilde ölçmek için herhangi bir yöntem bulunmamaktadır. Ayrıca, deney için büyük hayvanlardan veya nesli tükenmekte olan türlerden yumurtalık dokusu elde etmek genellikle mümkün değildir. Bu nedenle, fareler bu tür çalışmalar için önemli bir model haline gelmiştir ve tüm fare yumurtalıklarındaki ilkel folikül sayılarını değerlendirme yeteneği kritik bir araçtır. Bununla birlikte, literatürde fare yumurtalıklarındaki mutlak folikül sayıları raporları oldukça değişkendir, bu da verilerin karşılaştırılmasını ve/veya çoğaltılmasını zorlaştırır. Bunun nedeni, zorlanma, yaş, tedavi grupları gibi bir dizi faktörün yanı sıra kullanılan sayım yöntemlerindeki teknik farklılıklardır. Bu yazıda, histolojik bölümlerin hazırlanması ve fare yumurtalıklarındaki ilkel foliküllerin sayılması için iki farklı yöntem kullanarak adım adım bir öğretim kılavuzu sunuyoruz: [1] fraksiyonör / optik distör tekniğine dayanan stereoloji; ve [2] doğrudan sayım tekniği. Her yöntemin bazı temel avantajları ve dezavantajları vurgulanacak, böylece sahada tekrarlanabilirlik geliştirilebilir ve araştırmacıların çalışmaları için en uygun yöntemi seçmelerini sağlayacaktır.

Giriş

Yumurtalıktaki ilkel foliküller içinde depolanan olgunlaşmamış, meiyotik olarak tutuklanmış oositler, kadın germline için depolama birimidir ve bireyin yaşam boyu yumurtalık rezervini oluşturur. İlkel folikül sayıları¹yaşla birlikte doğal olarak azalır veya alternatif olarak, hava, gıda ve sudaki bazı farmasötikler ve çevresel toksik maddeler de dahil olmak üzere ekzojen kimyasallara maruz kaldıktan sonra erken tükenebilir². İlkel folikül sayısının sınırlı olduğu göz önüne alındığında, yumurtalıkta bulunan foliküllerin miktarı ve kalitesi büyük ölçüde kadın doğurganlığını ve yavru sağlığını belirler. Bu nedenle, kadınlarda ilkel folikül sayısının doğru ölçülmesi, eksojen hakaretlerin yumurtalık rezervi üzerindeki hedef dışı etkilerini değerlendirmek için gereklidir.

Kadınlarda, tüm yumurtalığın analizi genellikle mümkün değildir, bu nedenle yumurtalık rezervinin invaziv olmayan taşıyıcı önlemleri klinik bir ortamda kullanılmalıdır. Anti-Mϋllerian hormonu (AMH) klinik olarak en yaygın kullanılan taşıyıcı biyobelirteçtir³. Serum AMH düzeyleri genellikle ileri anne çağındaki kadınlarda veya kemoterapi gibi kanser tedavisinden önce ve sonra ölçülür. Bununla birlikte, AMH ilkel foliküller tarafından değil, büyüyen foliküller tarafından üretilir ve bu nedenle serum seviyeleri mutlak ilkel folikül sayısı hakkında bilgi vermemektedir.

Kadınlarda ilkel folikül sayısını doğru bir şekilde belirlemek için yöntemlerin bulunmaması ile in situ, kemirgenler gibi küçük hayvan modellerinde yumurtalık köklerini saymak, eksojen hakaretlerin ilkel foliküller ve dolayısıyla doğurganlık üzerindeki etkisini değerlendirmek için gerekli bir araştırma aracı olmaya devam etmektedir. Ne yazık ki, kemirgen modellerinde ilkel folikül sayılarının literatürü boyunca raporlar oldukça değişkendir⁴. Bunun önemli bir nedeni, kullanılan sayım yöntemindeki teknik farklılıklar yaygın olarak bildirilmektedir. Ağırlıklı olarak, literatürde farelerde ilkel foliküllerin numaralandırması için açıklanan iki farklı teknik vardır. Bunlar, fraksiyonatör optik disektör yöntemini kullanan stereoloji ve doğrudan folikül sayılarını içerir.

Stereology yaygın olarak kullanılan altın standart sistematik tekdüze rastgele örnekleme⁵, bütün fare veya sıçan yumurtalıkları^4,6,7ilkel folikül sayısını ölçmenin en doğru yöntemidir. Stereology, ilgi çekici nesnenin üç boyutlu yapısını oluşturduğu için tarafsızdır⁸. Optik bir disektör/fraksiyonatör yöntemi kullanılarak, toplam fare yumurtalığının bilinen bir fraksiyonu içinde kalın doku bölümleri (örneğin, 20 μm) kullanılarak ilkel folikülleri ölçmek için üç örnekleme seviyesi uygulanır. İlk olarak, örnekleme aralığı rastgele bir başlangıçta (örneğin, her 3^rd bölümde) seçilir (örnekleme fraksiyonu 1, f₁)⁴. Bölümler daha sonra bu noktadan tüm yumurtalık boyunca sistematik, düzgün bir şekilde örneklenir. Daha sonra, tarafsız bir sayım çerçevesi yumurtalık bölümünün üzerine bindirilir ve tanımlı, randomize bir sayım ızgarası boyunca aşamalı olarak hareket ettirilir (örnekleme fraksiyonu 2, f₂)⁸. Son olarak, kesit kalınlığının bilinen bir kısmı optik olarak örneklenir (örneğin, 10 μm) ve bu alandaki foliküller sayılır (örnekleme fraksiyonu 3, f₃)⁴. Ham folikül sayısı, nihai değeri elde etmek için bu örnekleme fraksiyonlarının tersi ile çarpılır. Bu yöntem, stereolojik yazılım tarafından tahrik edilen motorlu bir aşamaya sahip bir mikroskop da dahil olmak üzere uzman eğitimi ve ekipmanı gerektirir. Dokular özel bir Bouin fiksatifinde korunmalı ve cam bıçaklı glikolmethakrilat reçine mikrotom kullanılarak kalın doku bölümlerinin kesilmesini sağlamak için glikolmethakrilat reçinesine gömülmelidir. Bu yöntem, yumurtalık ve foliküllerin üç boyutlu morfolojik yapısını en iyi şekilde korumak için doku büzülme ve deformasyonunu hesaba katmak için tasarlanmıştır⁹.

Doğrudan folikül sayımı, folikülleri saymak için en sık kullanılan yöntemdir¹⁰. Daha yaygın fiksatifler (formalin) kullanılabilir, ardından parafin balmumu gömme ve 4-6 μm arasında bir kalınlıkta standart bir mikrotom kullanılarak kapsamlı seri kesitler kullanılabilir. Foliküller tüm doku bölümünde tanımlanmış bir aralıkta sistematik olarak sayılır ve daha sonra toplam folikül tahminini elde etmek için örnekleme aralığının tersi ile çarpılır. Bu yöntem hızlı, kolaydır, arşivlenmiş dokular kullanılarak yapılabilir ve standart histolojik teknikler kullanılarak hazırlanabilir. Standart görüntüleme yeteneklerine sahip sadece bir ışık mikroskobu gerektirir. Bununla birlikte, bu avantajlara rağmen, doğrudan folikül sayımı, stereolojinin doğruluğundan ve katı sayım parametrelerinden yoksun olduğundan, araştırmacı önyargısına daha yatkın hale getirir. Ek olarak, dokular işlem sırasında büzülme ve deformasyona uğrayabilir, yumurtalığın bütünlüğünü ve morfolojisini bozabilir ve böylece folikül sınıflandırmasını ve nicelleştirmeyi zorlaştırabilir.

Bu makalenin amacı, fare yumurtalıklarındaki ilkel folikül sayısını nicel olarak değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan iki yöntemi açıklamaktır: stereoloji ve doğrudan folikül sayımı. Alanımızda tekrarlanabilirliği artırmak ve araştırmacıların çalışmaları için en uygun sayım yöntemi hakkında bilinçli bir karar vermelerini sağlamak için bu iki yöntem için ayrıntılı protokoller sağlayacağız ve bazı güçlü ve zayıf yönlerini vurgulayacağız.

Protokol

Yumurtalıklar dişi C57BL6J farelerinden toplanarak elde edildi. Tüm hayvan prosedürleri ve deneyleri NHMRC Avustralya Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Uygulama Kuralları'na uygun olarak gerçekleştirilmesi ve Monash Hayvan Araştırma Platformu Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanması.

NOT: Bu raporda, aynı hayvandaki iki sayım yöntemini karşılaştırmak için stereoloji 11 ve doğrudan^{sayımlar 12 ,13}kullanılarak belirlenen ilkel folikül oositlerini tükendiğini gösteren bir kemoterapi ajanı kullanılmıştır. Kadın, 8 haftalık (genç yetişkin) fareler, siklofosfaminit veya tuzlu araç kontrolünün (n=5/grup) 75 mg/kg/vücut ağırlığına sahip tek bir intraperitoneal enjeksiyondan önce tartıldı. Bu dozun ilkel foliküllerin yaklaşık% 50 tükenmesine neden olduğu gösterilmiştir, ancak farelerde morbidite veya mortaliteye neden olduğu^{bildirilmemiştir 14}. Yumurtalıklar tedaviden 48 saat sonra hasat edildi. Her hayvandan bir yumurtalık 24 saat boyunca% 10 (v / v) nötr tamponlu formalin çözeltisinde, diğeri ise Bouin'in çözeltisinde 24 saat boyunca sabitlendi. Doku daha sonra glikolmethakrilat reçinesine gömüldü ve seri olarak 20 μm'de veya parafin ve seri olarak 5 μm'de bölümlere yerleştirildi. Tüm dokular periyodik asit Schiff ve hematoksilin ile boyandı.

1. Histolojik hazırlık: sabitleme, işleme, gömme ve fare yumurtalıklarını bölümleme

1. Yumurtalığın kendisine zarar vermeden veya kesmeden, yumurtalığı ve çevresindeki tüm yağı keserek fare yumurtalıklarını parçalara ayrıştırın. Gerekirse, bu adım için bir diseksiyon mikroskobu ve ince bıçak kullanın (Şekil 1A).
2. Dokuları% 70 etanol içine aktarmadan önce, Bouin'in fiksatif (stereolojisi) veya formalin fiksatif (doğrudan sayımları) içeren küçük bir etiketli tüpe 24 saat boyunca(Şekil 1B)yerleştirerek dokuları hemen düzeltin.
   NOT: Folikül morfolojisi en iyi Bouin'in glikolmethakrilat reçinesine gömülü sabit yumurtalık dokusunda korunur (Şekil 2).
3. Tüm sabit yumurtalıkları işleyin ve daha sonra standart bir histolojik protokol kullanarak doğrudan sayımlar için glikolmethakrilat reçinesine(Ek Dosya 1) veya parafin balmumuna gömün.
   DİkKAT: Reçine toksiktir, bu nedenle tüm doku işleme adımlarının duman kaputunda gerçekleştirilmesini ve eldivenlerin her zaman giyilmesini sağlayın.
4. Kalın glikolmethakrilat reçine bölümlerini (örneğin, 20 μm) kapsamlı bir şekilde kesmek için cam bıçakla (Şekil 1D) donatılmış özel bir reçine methakrilat mikrotom ( Şekil1C) kullanın. Bölümleri düzenli aralıklarla (örneğin, her 3^rd bölümde) stereoloji için cam mikroskop slaytları üzerine toplayın.
5. İnce parafin bölümlerini kesmek için standart bir mikrotom kullanın (örneğin, 4-6 μm). Doku bölümlerini düzenli aralıklarla (örneğin, her^9. bölümde bir) doğrudan folikül sayısı için cam mikroskop kaydırağından toplayın.
6. Slaytları periyodik asit Schiff ve hematoksilin ile lekeleyin (Ek Dosya 2).
7. Parafin bölümleri için standart DPX veya glikolmethakrilat reçine bölümleri için kalın DPX ile kapak (Şekil 1E).
   DİkKAT: Glikolmethakrilat reçine DPX tehlikelidir, bu nedenle bu adımı davlumbaz dumanlamak için gerçekleştirin.
   NOT: Glikolmethakrilat reçine DPX son derece viskozdur. Cam kapak, DPX'in eşit ve ince bir şekilde dağıldığından ve kapak kılıfı altında hava kabarcıkları olmadığından emin olmak için bir spatula ile bastırılarak sıkıca tutturılmalıdır (Şekil 1F).

2. Optik fraksiyonatör kullanılarak ilkel folikül sayısının stereolojik tahmini

1. Bilgisayarı, çoklu kontrol ünitesini, kamerayı ve stereoloji kurulumundaki ışık kaynağını açın ve mikroskop hedefini düşük büyütmeye (örn. 10x) ayarlayın.
2. Stereology yazılımını açın.
3. İlk slaytı mikroskop aşamasına güvenli bir şekilde koyun.
4. Kamera Ayarları panelinde Pozlama altında Otomatik'i kontrol derek ışık pozlamasını ayarlayın(Tamamlayıcı Şekil 1A). Alternatif olarak, ışığa maruz kalmayı manuel olarak ayarlayın.
5. İlk doku örneğini bulmak ve numuneyi odak noktasına getirmek için joystick'i kullanın.
6. Beyaz dengesini, Diğer Ayarlar'a tıklayarak (Kamera Ayarları panelinin sağ alt kısmında bulunur) ve ardından Beyaz Dengesi'ne tıklayın ve Otomatik (Tamamlayıcı Şekil 1B)'e tıklayın. Alternatif olarak, bölümde beyaz bir alan seçerek beyaz dengesini el ile ayarlamak için Diğer Ayarlar düğmesinin (veya Diğer Ayarlar'da Alan Seç) bitişik Beyaz Dengesi düğmesini tıklatın.
7. Problar açılır menüsüne gidin ve Optik Kesirleyici İş Akışı'nı tıklatın. Ardından Yeni Projeyi Başlat'ı ve Tamam'ı tıklatın.
   1. Varolan bir örnekleme yapılandırması kaydedilmişse, Örnekleme Parametreleri'nin altında Evet | ... ve istediğiniz örnekleme yapılandırmasını seçin.
   2. Değilse, Hayır'ı tıklatın ve seri bölüm bilgilerini (Tamamlayıcı Şekil 1C)el ile girin ve 2.13.
8. İleri'ye tıklayın, mikroskobu Düşük Büyütme olarak ayarlayın ve açılır menüden 10x büyütmeyi seçin.
9. İleri'ye tıklayın ve sonra tüm yumurtalık bölümünün etrafını takip edin - bölümün etrafına sol tıklayarak başlayın ve sonunda sağ tıklatın ve Kontur Kapat'ı seçin.
10. İleri'ye tıklayın, mikroskobu Yüksek Büyütme olarak ayarlayın ve açılır menüden 100x Yağ büyütmeyi seçin.
11. Slayttaki doku bölümüne bir damla yağ yerleştirin ve mikroskop hedefini 100x büyütmeye taşıyın.
12. Işığa pozlamayı ayarlayın (adım 2.4'te olduğu gibi) ve İleri 'yitıklatın.
13. Prob yapılandırmasını tanımlamak için Örnekleme Parametrelerini ayarlayın. Burada, sayım çerçevesi 47,5 μm x 47,5 μm (2,256,25 μm²⁾olarak ayarlanmış ve adım uzunluğu 100 μm x 100 μm (10.000 μm²) ( Ek Şekil 2 ) olarakayarlanmıştır. Örnekleme parametreleri oluşturulduktan sonra şablonu kaydedin ve 2.7.
14. Saymaya Başla 'ya tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 1D). Örneğin en üstüne odaklanın, Tamam'ı tıklatın ve saymaya başlayın.
15. 10 μm örnekleme derinliğinde hareket etmek ve oosit çekirdeği odak noktasına gelen ilkel kökleri saymak için odaklama düğmesini kullanın. Sonraki alana geçmek için İleri'yi tıklatın.
    1. Oosit skuamöz (düzleştirilmiş) granüloza hücreleri ile çevriliyse, ancak küboidal granüloza hücreleri yoksa folikülleri ilkel olarak sınıflandırın (Şekil 2A).
       NOT: İlkel foliküller, ağırlıklı olarak küboidal granüloza hücreleri ile çevrili olan küboidal ve skuamöz granüloza hücrelerinin(Şekil 2B)ve birincil foliküllerin birleşiminden oluşan ara/geçiş köklerinden farklıdır (Şekil 2C). Bu folikül sınıfları ayrı ayrı ölçülmelidir.
    2. Sadece oosit çekirdeğinin görünür olduğu folikülleri sayın. Oosit çekirdeği sayım çerçevesinde görünmeli veya sayım çerçevesinin yeşil ekleme satırlarına dokunmalıdır(Tamamlayıcı Şekil 1E,F).
    3. Oosit çekirdeği sayım çerçevesinin dışına düşerse (Tamamlayıcı Şekil 1G) veya sayım çerçevesinin kırmızı dışlama çizgilerine dokunursa, bu folikülü saymayın.
    4. Eksojen bir kimyasala (örneğin kemoterapi) yanıt olarak ilkel folikül tükenmesini değerlendirirken, sayılan tüm foliküllerin sağlıklı olduğundan ve böylece normal morfolojiye sahip olduğundan emin olun (Şekil 2). Anormal veya atretic folikülleri ayrı ayrı sayın. Genellikle, folikül ölümü kemoterapi gibi hakaretlerle tetiklenmiştir ve atretic foliküllerin nicelliği, sadece sağlıklı foliküller yumurtalık rezervini oluşturduğundan, sağlıklı ve atretic folikülleri ayırt etmek için ayrı ayrı elde edilmelidir¹⁵.
16. Bu bölümde sayım tamamlandıktan sonra aşağıdakilerden birini yapın:
    1. Yeni Bölüm Ekle 'yitıklatın ve sonraki bölümü sayım için ayarlamak üzere 2.3.
    2. Oturumu sonlandırmak için Sayımı Bitirdim'i tıklatın. Hedefi 10x'e döndürün, stereoloji yazılımından çıkın ve ışık kaynağını, kamerayı, çoklu kontrol birimini ve bilgisayarı kapatın.
17. Tüm yumurtalıktan örneklenmiş her doku bölümünden toplam ham folikül numarasını (Q) alın, ardından bir elektronik tablo kullanarak, her çoğaltma hayvanından (N)^4'tennihai değeri elde etmek için aşağıdaki denklemi kullanın.
    nerede:
    N = Yumurtalık içindeki toplam tahmini folikül sayısı.
    S = Ham ilkel folikül sayısı.
    f₁ = Örnekleme aralığı. Her 3^rd bölüm böylece örneklenmiş.
    f₂ = Sayım çerçevesi (örnek alan) ve step arasındaki ilişki, olarak hesaplanır. Numune alanı 2256 μm 2 (47,5^μm x 47,5 μm) ve step alanı 10000 μm^{2 (100} μm x 100 μm), .
    f₃ = Yumurtalık kesiri örneklenmiş. 20 μm'lik bölümün 10 μm'si örneklendiklerinden, .
    Bu nedenle, .
    NOT: Bu protokol, yaygın olarak atıfta bulunulan bir stereoloji yazılımı kullanılarak bu stereolojik analizilkelerininnasıl uygulanacağını açıklar ( Malzeme Tablosu ); ancak, başka stereolojik yazılımlar mevcuttur. Yumurtalık köklerinin stereolojik analizleri sırasında uygulanan ilkeler, parametreleri ayarlamak için kullanılan yazılımdan bağımsız olarak aynıdır. Stereology en doğru 100 veya daha fazla nesne yetişkin bir fare yumurtalığında sayıldığında⁴, bu% 10'un altındaki tahmin için bir hata katsayısı verir¹⁶. Burada özetlenen örnekleme parametreleri, yetişkin vahşi tip C57BL6J yumurtalıklarının kontrol altında sayılabilmesi için en az 100 nesnenin (yani ilkel, geçiş ve birincil foliküller) sayılabilmesini sağlamak için optimize edilmiştir. Analiz edilecek bölümlerin aralığı ve sayısı ve örneklenen bölümlerdeki optik disissektör sayısı gibi en uygun örnekleme parametrelerini belirlemek için küçük bir örnekleme boyutu içeren bir pilot çalışma yapılabilir^17.

3. İlkel folikül sayısının doğrudan yumurtalık folikül sayılarının tahmini

1. Mikroskop kaydıramasını standart bir ışık mikroskobu altına güvenli bir şekilde yerleştirin ve ham ilkel folikül numarası elde etmek için doğrudan sayımlar gerçekleştirin.
   1. Oosit açıkça görünüyorsa ve skuamöz (düzleştirilmiş) granüloza hücreleri ile çevriliyse, ancak küboidal granüloza hücreleri yoksa folikülleri ilkel olarak sınıflandırın (Şekil 2D).
      NOT: İlkel foliküller, ağırlıklı olarak küboidal granüloza hücreleri ile çevrili olan küboidal ve skuamöz granüloza hücrelerinin(Şekil 2E)ve birincil foliküllerin bir kombinasyonunu içeren ara/geçiş köklerinden farklıdır (Şekil 2F). Bu folikül sınıfları ayrı ayrı ölçülmelidir.
   2. Sayılan tüm foliküllerin sağlıklı olduğundan ve böylece normal morfolojiye sahip olduğundan emin olun (Şekil 2). Sadece sağlıklı foliküller yumurtalık rezervini oluşturduğundan, anormal veya atretic folikülleri ayrı ayrı sayın.
2. Alternatif olarak, görüntü dosyalarını açarak sayımları gerçekleştirmek için tüm yumurtalık dokusu bölümünün birden fazla veya dikişli yüksek güçlü (örneğin, 20x) fotomikrograflarını alın. Bu, el ile veya otomatik slayt tarayıcısı kullanılarak yapılabilir.
3. Önceden belirlenmiş aralıkta tüm yumurtalıktan örneklenen her doku bölümünden toplam ham folikül sayısını (Q) alın. Aşağıdaki denklemi kullanarak her çoğaltma hayvanının (N) son değerini elde etmek için bu sayıyı örnekleme kesirinin tersiyle çarpın.
   nerede:
   N = Yumurtalık içindeki toplam tahmini folikül sayısı.
   S = Ham folikül sayısı (her bir türün ayrı ayrı hesaplanmıştır).
   f₁ = Örnekleme aralığı. Her^9. bölümden böylece örneklenmiş.
   Bu nedenle, .

Sonuçlar

Genç yetişkin dişi farelere tek doz siklofosfaminid kemoterapisi veya salin araç kontrolü (n=5/grup) uygulandığı ve her iki yumurtalığın 48 saat sonra her hayvandan toplandığı iyi karakterize edilmiş bir folikül tükenme modeli kullanılmıştır. İki yöntemin her biri için Adım 1'de açıklandığı gibi hayvan başına bir yumurtalık hazırlandı: stereoloji veya doğrudan sayımlar. Her hayvanın sol ve sağ yumurtalığı her gruba rastgele atandı. Bu veriler, stereoloji kullanırken, kemoterapi...

Tartışmalar

Bu makalede, fare ilkel folikülleri, stereolojiyi ve daha yaygın olarak kullanılan doğrudan folikül sayma yöntemini numaralandırmak için altın standart tekniği için adım adım bir protokol sağlanmıştır. Kemoterapi tedavisi, sol ve sağ yumurtalık içinde bu iki farklı yöntemden elde edilen sonuçları aynı hayvandan karşılaştırmak ve karşılaştırmak için kullanılmıştır. Her iki yöntem de ilkel folikül sayılarında hayvanlar arası yüksek değişkenliği ortaya koydu. Yumurtalık rezerv...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Butanol (HPLC)	Fisher Chemical	#A383-1
Acid alcohol	Amber Scientific	#ACDL
Bouin’s fixative	Sigma-Aldrich	#HT10132	Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)
Cyclophosphamide	Sigma-Aldrich	#C0768-5G
Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)	Sigma-Aldrich	#06522
Ethanol	Amber Scientific	#ETH	Ethanol 100%
Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle	Designs for Vision	#FEA-745-SR	Feather blade for dissections (seen in Figure 1)
Formalin fixative	Australian Biostain	#ANBFC
Glass coverslip	Thermo Scientific	#MENCS22501GP	22 mm x 50 mm
Glycomethacrylate resin RM2165 microtome	Leica Microsystems	#RM2165
Glycolmethacrylate DPX	*made in house		*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks
Histolene	Trajan	#11031
Mayer’s haematoxylin	Amber Scientific	#MH
Olympus BX50 microscope	Olympus	#BX50	Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)
Olympus immersion oil type-F	Olympus	#IMMOIL-F30CC
Olympus TH4-200 light source	Olympus	#TH4-200
Paraffin wax	Sigma-Aldrich	#03987
Periodic acid	Trajan	#PERI1%	Periodic acid 1%
Rotary Microtome CUT 4060	MicroTec	#4060R/F	Used to cut paraffin sections
Schiff’s reagent	Trajan	#SCHF
Scott's tap water	Amber Scientific	#SCOT	Potassium carbonate, magnesium sulphate, water
StereoInvestigator Stereological System	MBF Bioscience		Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick
Superfrost microscope slides	Thermo Scientific	#MENSF41296SP	1 mm, 72 pcs
Technovit 7100 Plastic embedding system	Emgrid Australia	#64709003	500 mL/5 x 1 g/40 mL
Technovit 3040 yellow	Emgrid Australia	#64708805	100 g/80 mL