Genaue Follikel-Aufzählung in adulten Maus-Ovarien

Zusammenfassung

Hier beschreiben, vergleichen und kontrastieren wir zwei verschiedene Techniken für die genaue Follikelzählung von festen Eierstockgeweben der Maus.

Zusammenfassung

Sexuell reproduzierende weibliche Säugetiere werden mit ihrer gesamten lebensleinen Versorgung mit Eizellen geboren. Unreife, stille Eizellen finden sich in den Urfollikel, der Speichereinheit der weiblichen Keimbahn. Sie sind nicht erneuerbar, so dass ihre Zahl bei der Geburt und anschließende Verlustrate weitgehend die weibliche fruchtbare Lebensdauer diktiert. Eine genaue Quantifizierung der Urfollikelzahlen bei Frauen und Tieren ist für die Bestimmung der Auswirkungen von Arzneimitteln und Giftstoffen auf die Eierstockreserve von entscheidender Bedeutung. Es ist auch notwendig, die Notwendigkeit und den Erfolg bestehender und neu entstehender Techniken zur Erhaltung der Fruchtbarkeit zu bewerten. Derzeit gibt es keine Methoden, um die Anzahl der Urfollikel, die die Eierstockreserve bei Frauen umfassen, genau zu messen. Darüber hinaus ist es oft nicht möglich, Eierstockgewebe von großen Tieren oder gefährdeten Arten für Experimente zu erhalten. So sind Mäuse zu einem wesentlichen Modell für solche Studien geworden, und die Fähigkeit, urfolale Follikelzahlen in ganzen Eierstöcken der Maus zu bewerten, ist ein entscheidendes Werkzeug. Berichte über absolute Follikelzahlen in den Eierstöcken der Maus in der Literatur sind jedoch sehr variabel, was es schwierig macht, Daten zu vergleichen und/oder zu replizieren. Dies ist auf eine Reihe von Faktoren wie Belastung, Alter, Behandlungsgruppen sowie technische Unterschiede in den methoden zur Zählung zurückzuführen. In diesem Artikel stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Vorbereitung histologischer Abschnitte und das Zählen von Urfollikel in Denstöcken der Maus mit zwei verschiedenen Methoden bereit: [1] Stereologie, die sich auf die Fraktionator-/optische Dissektortechnik stützt; und [2] die direkte Zähltechnik. Einige der wichtigsten Vor- und Nachteile jeder Methode werden hervorgehoben, so dass die Reproduzierbarkeit vor Ort verbessert werden kann und die Forscher die am besten geeignete Methode für ihre Studien auswählen können.

Einleitung

Die unreifen, meiotisch verhafteten Eizellen, die in Urfollikel im Eierstock gelagert werden, sind die Lagereinheit für die weibliche Keimbahn und bilden die lebenslange Eierstockreserve eines Individuums. Primordial Follikel Zahlen sinken natürlich mit dem Alter¹, oder alternativ, kann vorzeitig nach der Exposition gegenüber exogenen Chemikalien, einschließlich einiger Pharmazeutika und Umweltgifte in Luft, Lebensmittel und Wasser². Da die ursprüngliche Follikelzahl endlich ist, bestimmen die Menge und Qualität der Follikel innerhalb des Eierstocks weitgehend die weibliche Fruchtbarkeit und die Gesundheit der Nachkommen. Daher ist eine genaue Quantifizierung der Urfollikelzahl bei Frauen für die Bewertung der außerhalb des Ziels von exogenen Beleidigungen auf die Eierstockreserve wichtigen Bedeutung.

Bei Frauen ist eine Analyse des gesamten Eierstocks im Allgemeinen nicht möglich, so dass nicht-invasive Ersatzmaßnahmen der Ovarialreserve in einem klinischen Umfeld eingesetzt werden müssen. Das Anti-M-Llerian-Hormon (AMH) ist der am weitesten verbreitete Ersatz-Biomarker klinisch³. Serum AMH-Spiegel werden oft bei Frauen im fortgeschrittenen mütterlichen Alter oder vor und nach der Krebsbehandlung, wie Chemotherapie, gemessen. AMH wird jedoch durch den Anbau von Follikel und nicht durch Urfollikel erzeugt, und daher informieren serumspiegel nicht über die absolute Urfollikelzahl.

Da es keine Methoden gibt, um die Primordialzahl bei Frauen in situgenau zu bestimmen, bleibt die Zählung der Eierstockfollikel in Kleintiermodellen wie Nagetieren ein wesentliches Forschungsinstrument, um zu beurteilen, inwieweit exogene Beleidigungen Auswirkungen auf die Urfollikel und damit auf die Fruchtbarkeit haben. Leider sind die Berichte in der gesamten Literatur über urfolgische Zahlen in Nagetiermodellen sehr variabel⁴. Ein Hauptgrund dafür sind weithin berichtete technische Unterschiede in der eingesetzten Zählmethode. Vor allem gibt es zwei verschiedene Techniken, die in der Literatur beschrieben werden, um Urfollikel bei Mäusen aufzuzählen. Dazu gehören die Stereologie, die die optische Dissektormethode des Fraktionators verwendet, und die Anzahl der direkten Follikel.

Die Stereologie wird weithin als Goldstandard angesehen, da sie systematische einheitliche Stichproben⁵verwendet, was sie zur genauesten Methode zur Quantifizierung der urtypischen Follikelzahl in der ganzen Maus oder Ratteneierstöcke^4,6,7macht. Die Stereologie ist unvoreingenommen, da sie die dreidimensionale Struktur des^Objektsvon Interesse 8 berücksichtigt. Mit Hilfe einer optischen Dissektor-/Fraktionatormethode werden drei Stichprobenebenen angewendet, um Urfollikel mit dicken Gewebeabschnitten (z. B. 20 m) innerhalb eines bekannten Bruchteils des gesamten Mausovarials zu quantifizieren. Zunächst wird das Stichprobenintervall (z. B. jeder^dritte Abschnitt) zu einem zufälligen Start gewählt (Sampling-Fraktion 1, f₁)⁴. Die Abschnitte werden dann systematisch und einheitlich von diesem Punkt an durch den gesamten Eierstock abgetastet. Dann wird ein unvoreingenommener Zählrahmen über dem Eierstockbereich überlagert und nach und nach entlang eines definierten, randomisierten Zählrasters bewegt (Sampling-Fraktion 2, f₂)⁸. Schließlich wird ein bekannter Bruchteil der Schnittdicke optisch beprobt (z.B. 10 m) und Follikel in diesem Bereich gezählt (Probenahmefraktion 3, f₃)⁴. Die rohe Follikelzahl wird mit der Umkehrung dieser Stichprobenfraktionen multipliziert, um den Endwert zu erhalten. Diese Methode erfordert eine fachkundige Schulung und Ausrüstung, einschließlich eines Mikroskops mit einer motorisierten Bühne, die von stereologischer Software angetrieben wird. Gewebe sollten in einem speziellen Bouin-Fixativ konserviert und in Glycolmethacrylatharz eingebettet werden, damit dicke Gewebeabschnitte mit einem Glycolmethacrylatharz-Mikrotom mit einem Glasmesser geschnitten werden können. Diese Methode wurde entwickelt, um Gewebeschrumpfung und Verformung zu berücksichtigen, um die dreidimensionale morphologische Struktur des Eierstocks und der Follikel am besten zu erhalten⁹.

Die direkte Follikelzählung ist die am häufigsten verwendete Methode zum Zählen von Follikel¹⁰. Es können häufigere Fixative (d. h. Formalin) verwendet werden, gefolgt von Paraffinwachseinbettung und erschöpfender serieller Schnitte mit einem Standardmikrotome mit einer Dicke zwischen 4 und 6 m. Follikel werden systematisch im gesamten Gewebeabschnitt in einem definierten Intervall gezählt und dann mit der Umkehrung des Probenahmeintervalls multipliziert, um die Gesamtfollikelschätzung zu erhalten. Diese Methode ist schnell und einfach, kann mit archivierten Geweben durchgeführt und mit standardmäßigen histologischen Techniken vorbereitet werden. Es erfordert nur ein Lichtmikroskop mit Standard-Bildgebungsfunktionen. Trotz dieser Vorteile fehlt es der direkten Follikelzählung jedoch an Genauigkeit und strengen Zählparametern der Stereologie, was sie anfälliger für Voreingenommenheit der Prüfer macht. Darüber hinaus können Gewebe während der Verarbeitung schrumpfen und verformt werden, wodurch die Integrität und Morphologie des Eierstocks gestört wird und somit die Follikelklassifizierung und -quantifizierung erschwert wird.

Ziel dieses Artikels ist es, zwei häufig verwendete Methoden zur quantitativen Bewertung der Urfollikelzahl in den Eierstöcken der Maus zu beschreiben: Stereologie und direkte Follikelzählung. Wir werden detaillierte Protokolle für diese beiden Methoden bereitstellen und einige ihrer Stärken und Schwächen aufzeigen, um die Reproduzierbarkeit in unserem Bereich zu verbessern und es den Forschern zu ermöglichen, eine fundierte Entscheidung über die am besten geeignete Zählmethode für ihre Studien zu treffen.

Protokoll

Eierstöcke wurden von weiblichen C57BL6J-Mäusen gesammelt. Alle tierischen Verfahren und Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Australischen Verhaltenskodex für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt und von der Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee genehmigt.

ANMERKUNG: Ein Chemotherapeutikum, das nachweislich primordiale Follikeloozyten erschöpft, wie mit Stereologie¹¹ und direkten^{Zählungen 12bestimmt,13} wurde in diesem Bericht verwendet, um die beiden Zählmethoden bei demselben Tier zu vergleichen. Weibliche, 8 Wochen alte (junge Erwachsene) Mäuse wurden vor einer einzigen intraperitonealen Injektion von 75 mg/kg/Körpergewicht von Cyclophosphamid oder einer sainen Fahrzeugkontrolle (n=5/Gruppe) gewogen. Es hat sich gezeigt, dass diese Dosis eine Erschöpfung der Urfollikel von ca. 50 % verursacht, aber nicht berichtet, dass sie Morbidität oder Mortalität bei Mäusen verursacht¹⁴. Die Eierstöcke wurden 48 Stunden nach der Behandlung geerntet. Ein Eierstock von jedem Tier wurde in 10% (v/v) neutral gepufferte Formalin-Lösung für 24 Stunden fixiert, und der andere in Bouins Lösung für 24 Stunden fixiert. Das Gewebe wurde dann entweder in Glykolmethacrylatharz eingebettet und seriell auf 20 m oder in Paraffin und seriell auf 5 m geschnitten. Alle Gewebe wurden mit Periodensäure Schiff und Hämatoxylin gefärbt.

1. Histologische Präparation: Fixierung, Verarbeitung, Einbettung und Schnitt von Maus-Ovarien

1. Sezieren Sie die Eierstöcke der Maus, indem Sie das Eileiter und das gesamte umgebende Fett schneiden, ohne den Eierstock selbst zu beschädigen oder zu schneiden. Verwenden Sie bei Bedarf für diesen Schritt ein Sezieren von Mikroskop und eine feine Klinge (Abbildung 1A).
2. Beheben Sie Gewebe sofort, indem Sie es in ein kleines, beschriftetes Rohr legen, das entweder Bouins fixative (Stereologie) oder formalin fixative (direkte Zählungen) für 24 Stunden enthält(Abbildung 1B), bevor Gewebe in 70 % Ethanol übertragen werden.
   HINWEIS: Die Follikelmorphologie wird am besten in Bouins festem Eierstockgewebe konserviert und in Glykolmethacrylatharz eingebettet (Abbildung 2).
3. Verarbeiten Sie ganze feste Eierstöcke und betten Sie dann in Glykolmethacrylatharz für die Stereologie (Ergänzende Akte 1), oder Paraffinwachs für direkte Zählungen mit einem Standard histologisches Protokoll.
   VORSICHT: Harz ist giftig, so stellen Sie sicher, dass alle Gewebeverarbeitungsschritte in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden und Handschuhe zu jeder Zeit getragen werden.
4. Verwenden Sie ein spezielles Harzmethacrylat-Mikrotom (Abbildung 1C), das mit einem Glasmesser (Abbildung 1D) ausgestattet ist, um dicke Glycolmethacrylatharzabschnitte (z. B. 20 m) erschöpfend zu schneiden. Sammeln Sie die Abschnitte in regelmäßigen Abständen (z. B. jeden^3. Abschnitt) auf Glasmikroskop-Dias für die Stereologie.
5. Verwenden Sie ein Standard-Mikrotom, um dünne Paraffinabschnitte (z. B. 4-6 m) zu schneiden. Sammeln Sie Gewebeabschnitte in regelmäßigen Abständen (z. B. jeden^9. Abschnitt) auf einem Glasmikroskopschlitten für direkte Follikelzahlen.
6. Die Dias mit periodischer Säure Schiff und Hämatoxylin(Ergänzungsdatei 2) beflecken
7. Coverslip mit Standard-DPX für Paraffinprofile oder dickes DPX für Glycolmethacrylatharzabschnitte (Abbildung 1E).
   VORSICHT: Glycolmethacrylatharz DPX ist gefährlich, also führen Sie diesen Schritt in, um Dunstabzugshaube zu verwenden.
   HINWEIS: Glycolmethacrylatharz DPX ist extrem zähflüssig. Der Glasdeckel muss fest mit einem Spachtel nach unten gedrückt werden, um sicherzustellen, dass der DPX gleichmäßig und dünn dispergiert ist und unter dem Deckschein keine Luftblasen vorhanden sind (Abbildung 1F).

2. Stereologische Schätzung der urzeitlichen Follikelzahl mit dem optischen Fractionator

1. Schalten Sie den Computer, die Multi-Control-Einheit, die Kamera und die Lichtquelle innerhalb des stereologischen Setups ein und stellen Sie das Mikroskopobjektiv auf eine geringe Vergrößerung (z. B. 10x).
2. Öffnen Sie die Stereologie-Software.
3. Setzen Sie den ersten Schlitten sicher auf die Mikroskopstufe.
4. Stellen Sie die Lichtbelichtung ein, indem Sie im Bedienfeld "Kameraeinstellungen" (Ergänzende Abbildung 1A ) unter Automatisch unter Belichtung überprüfen. Alternativ können Sie die Lichtbelichtung manuell einstellen.
5. Verwenden Sie den Joystick, um die erste Gewebeprobe zu lokalisieren und die Probe in den Fokus zu rücken.
6. Passen Sie den Weißabgleich an, indem Sie entweder auf Weitere Einstellungen (unten rechts im Bedienfeld Kameraeinstellungen) klicken und dann auf Weißabgleich und auf Automatisch klicken (Ergänzende Abbildung 1B). Alternativ können Sie auf die Schaltfläche Weißabgleich neben der Schaltfläche Weitere Einstellungen (oder Bereich in weiteren Einstellungen auswählen ) klicken, um den Weißabgleich manuell festzulegen, indem Sie einen weißen Bereich im Abschnitt auswählen.
7. Gehen Sie zum Dropdown-Menü "Sonden" und klicken Sie auf Optical Fractionator Workflow. Klicken Sie dann auf Neues Projekt starten und klicken Sie auf OK.
   1. Wenn eine vorhandene Sampling-Konfiguration gespeichert wurde, klicken Sie unter Sampling-Parameter auf Ja | ... und wählen Sie die gewünschte Sampling-Konfiguration aus.
   2. Wenn dies nicht der Fall ist, klicken Sie auf Nein, und geben Sie die Informationen zum seriellen Abschnitt (Ergänzende Abbildung 1C) manuell ein, und definieren Sie die Prüfpunktkonfiguration in Schritt 2.13.
8. Klicken Sie auf Weiter, stellen Sie das Mikroskop auf Niedrige Vergrößerung ein und wählen Sie aus dem Dropdown-Menü die 10-fache Vergrößerung aus.
9. Klicken Sie auf Weiter, und verfolgen Sie dann den gesamten Eierstockbereich – beginnen Sie mit einem links klickenden Abschnitt und klicken Sie am Ende mit der rechten Maustaste und wählen Sie Kontur schließen.
10. Klicken Sie auf Weiter, stellen Sie das Mikroskop auf Hohe Vergrößerung und wählen Sie 100x Ölvergrößerung aus dem Dropdown-Menü.
11. Legen Sie einen Tropfen Öl auf den Gewebebereich auf dem Dia und bewegen Sie das Mikroskopobjektiv auf die 100-fache Vergrößerung.
12. Passen Sie die Lichtbelichtung an (wie in Schritt 2.4) und klicken Sie auf Weiter.
13. Richten Sie die Sampling-Parameter ein, um die Prüfpunktkonfiguration zu definieren. Hier wurde der Zählrahmen auf 47,5 x 47,5 m (2.256,25 m²) und die Schrittlänge auf 100 x 100 m (10.000 m²) eingestellt (Zusatzabbildung 2). Nachdem die Samplingparameter festgelegt wurden, speichern Sie die Vorlage und öffnen Sie sie während der nachfolgenden Analysesitzungen unter Schritt 2.7 erneut.
14. Klicken Sie auf Counting starten (Zusatzabbildung 1D). Konzentrieren Sie sich auf den Oberen Rand des Beispiels, klicken Sie auf OK, und beginnen Sie mit der Zählung.
15. Verwenden Sie den Fokussierknopf, um sich durch die 10 m Probentiefe zu bewegen und alle Urfollikel zu zählen, deren Eizellenkern in den Fokus rückt. Klicken Sie auf Weiter, um zum nächsten Bereich zu wechseln.
    1. Klassifizieren Sie Follikel als Ur-Ur-Zellen, wenn die Oozyte von Plattenzellen (abgeflachten) Granulosazellen umgeben ist, aber keine quakodenalen Granulosazellen (Abbildung 2A).
       ANMERKUNG: Primordialfollikel unterscheiden sich von Zwischen-/Übergangsfollikel, die eine Kombination von quatolen und Plattenepithelzellen(Abbildung 2B) und Primärfollikel umfassen, die überwiegend von quaderalen Granulosazellen umgeben sind (Abbildung 2C). Diese Follikelklassen sollten separat quantifiziert werden.
    2. Zählen Sie nur Follikel, in denen der Eizellkern sichtbar ist. Der Oozytenkern muss innerhalb des Zählrahmens erscheinen oder die grünen Einschlusslinien des Zählrahmens berühren (Zusatzabbildung 1E,F).
    3. Wenn der Oozytenkern außerhalb des Zählrahmens liegt (Zusatzabbildung 1G) oder die roten Ausschlusslinien des Zählrahmens berührt, zählen Sie diesen Follikel nicht.
    4. Bei der Beurteilung des Urfollikelabbaus als Reaktion auf eine exogene Chemikalie (z. B. Chemotherapie) stellen Sie sicher, dass alle gezählten Follikel gesund sind und somit eine normale Morphologie haben (Abbildung 2). Zählen Sie alle abnormalen oder atretischen Follikel separat. Oft wird der Follikeltod durch Beleidigungen wie Chemotherapie induziert, und die Quantifizierung der atretischen Follikel sollte separat erfolgen, um zwischen gesunden und atretischen Follikel zu unterscheiden, da nur gesunde Follikel die Ovarialreserve¹⁵umfassen.
16. Führen Sie nach Abschluss der Zählung in diesem Abschnitt eine der folgenden Schritte aus:
    1. Klicken Sie auf Neuer Abschnitt hinzufügen, und kehren Sie dann zu Schritt 2.3 zurück, um den nächsten Abschnitt für die Zählung einzurichten.
    2. Klicken Sie auf Ich habe die Zählung beendet, um die Sitzung zu beenden. Setzen Sie das Objektiv auf 10x zurück, beenden Sie die Stereologie-Software und schalten Sie die Lichtquelle, Kamera, Multi-Control-Einheit und Computer aus.
17. Beziehen Sie die Summe Rohfollikelzahl (Q) aus jedem Gewebeabschnitt aus dem gesamten Eierstock, dann mit einer Tabelle, verwenden Sie die Gleichung unten, um den endgültigen Wert von jedem replizierenden Tier (N)⁴zu erhalten.
    Wo:
    N = Gesamtgeschätzte Anzahl der Follikel innerhalb des Eierstocks.
    Q = Rohe Urfollikelzahl.
    f₁ = Abtastintervall. Jeder^dritte Abschnitt wurde so abgetastet.
    f₂ = Beziehung zwischen Zählrahmen (Beispielfläche) und Stepper, berechnet als . Da die Probenfläche 2256 m² (47,5 x 47,5 m) betrug und die Schrittfläche 10000 m² (100 x 100 m) betrug.
    f₃ = Anteil des Eierstockschnitts. Da 10 m des 20-mm-Abschnitts abgetastet wurden, .
    Daher.
    ANMERKUNG: Dieses Protokoll beschreibt, wie diese Prinzipien der stereologischen Analysen mit einer viel zitierten Stereologie-Software (Tabelle der Materialien)angewendet werden können; es steht jedoch eine andere stereologische Software zur Verfügung. Die Prinzipien, die bei stereologischen Analysen von Eierstockfollikel angewendet werden, sind die gleichen, unabhängig von der Software, die zum Einrichten der Parameter verwendet wird. Die Stereologie ist am genauesten, wenn 100 oder mehr Objekte in einem erwachsenen Maus-Ovarial⁴gezählt werden, da dies einen Fehlerkoeffizienten für die Schätzung unter 10%¹⁶ergibt. Die hier beschriebenen Stichprobenparameter wurden optimiert, um sicherzustellen, dass mindestens 100 Objekte (d. h. Ur-, Übergangs- und Primärfollikel) in der Kontrolle der adulten Wild-Typ C57BL6J-Eierstöcke gezählt werden können. Eine Pilotstudie mit einem kleinen Stichprobenumfang kann durchgeführt werden, um die optimalen Stichprobenparameter zu ermitteln, wie das Intervall und die Anzahl der zu analysierenden Abschnitte und die Anzahl der optischen Dissektoren innerhalb der stichprobenartig untersuchten Abschnitte¹⁷.

3. Schätzung der Urfollikelzahl durch direkte Ovarialfollikelzahl

1. Platzieren Sie den Mikroskopschlitten sicher unter einem Standard-Lichtmikroskop und führen Sie direkte Zählungen durch, um eine rohe Urfollikelzahl zu erhalten.
   1. Klassifizieren Sie Follikel als Ur-Granulosa-Zellen, aber keine quaroilen Granulosazellen (Abbildung 2D).
      ANMERKUNG: Primordialfollikel unterscheiden sich von Zwischen-/Übergangsfollikel, die eine Kombination von quatolen und Plattenepithelzellen (Abbildung 2E) und Primärfollikel umfassen, die überwiegend von quaderalen Granulosazellen umgeben sind (Abbildung 2F). Diese Follikelklassen sollten separat quantifiziert werden.
   2. Stellen Sie sicher, dass alle gezählten Follikel gesund sind und somit eine normale Morphologie haben (Abbildung 2). Zählen Sie alle abnormalen oder atretischen Follikel separat, da nur gesunde Follikel die Eierstockreserve umfassen.
2. Alternativ können Sie mehrere oder genähte Hochleistungsphotomikroskope (z. B. 20x) des gesamten Eierstockgewebeabschnitts verwenden, um Zählungen durchzuführen, indem Sie die Bilddatei(en) öffnen. Dies kann manuell oder mit einem automatisierten Diascanner erfolgen.
3. Erhalten Sie die Summe Rohfollikelzahl (Q) aus jedem Gewebeabschnitt, der im vorgegebenen Intervall aus dem gesamten Eierstock entnommen wird. Multiplizieren Sie diese Zahl mit der Umkehrung des Stichprobenbruchs, um den Endwert für jedes Replizierungstier (N) zu erhalten, wobei die folgende Gleichung verwendet wird.
   Wo:
   N = Gesamtgeschätzte Anzahl der Follikel innerhalb des Eierstocks.
   Q = Rohfollikelzahl (von jedem einzelnen Typ, separat berechnet).
   f₁ = Abtastintervall. Jeder^9. Abschnitt wurde so abgetastet.
   Daher.

Ergebnisse

Es wurde ein gut charakterisiertes Modell der Follikeldepletion verwendet, bei dem jungen erwachsenen weiblichen Mäusen eine Einzeldosis Cyclophosphamid-Chemotherapie oder kochische Fahrzeugkontrolle (n=5/Gruppe) verabreicht wurde und beide Eierstöcke nach 48 Stunden von jedem Tier geerntet wurden. Für jede der beiden Methoden wurde ein Eierstock pro Tier hergestellt, wie in Schritt 1 beschrieben: Stereologie oder direkte Zählung. Der linke und rechte Eierstock jedes Tieres wurde jeder Gruppe zufällig zugeordnet. Di...

Diskussion

Dieser Artikel enthält ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Goldstandard-Technik zur Aufzählung von Maus-Urfollikel, Stereologie und die am häufigsten verwendete Methode der direkten Follikelzählung. Die Chemotherapie wurde verwendet, um die Ergebnisse dieser beiden verschiedenen Methoden innerhalb des linken und rechten Eierstocks desselben Tieres zu vergleichen und zu vergleichen. Beide Methoden zeigten eine hohe variabilile Zwischentiervariabilität bei den ursprünglichen Follikelzahlen. Eine signifikante ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Butanol (HPLC)	Fisher Chemical	#A383-1
Acid alcohol	Amber Scientific	#ACDL
Bouin’s fixative	Sigma-Aldrich	#HT10132	Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)
Cyclophosphamide	Sigma-Aldrich	#C0768-5G
Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)	Sigma-Aldrich	#06522
Ethanol	Amber Scientific	#ETH	Ethanol 100%
Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle	Designs for Vision	#FEA-745-SR	Feather blade for dissections (seen in Figure 1)
Formalin fixative	Australian Biostain	#ANBFC
Glass coverslip	Thermo Scientific	#MENCS22501GP	22 mm x 50 mm
Glycomethacrylate resin RM2165 microtome	Leica Microsystems	#RM2165
Glycolmethacrylate DPX	*made in house		*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks
Histolene	Trajan	#11031
Mayer’s haematoxylin	Amber Scientific	#MH
Olympus BX50 microscope	Olympus	#BX50	Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)
Olympus immersion oil type-F	Olympus	#IMMOIL-F30CC
Olympus TH4-200 light source	Olympus	#TH4-200
Paraffin wax	Sigma-Aldrich	#03987
Periodic acid	Trajan	#PERI1%	Periodic acid 1%
Rotary Microtome CUT 4060	MicroTec	#4060R/F	Used to cut paraffin sections
Schiff’s reagent	Trajan	#SCHF
Scott's tap water	Amber Scientific	#SCOT	Potassium carbonate, magnesium sulphate, water
StereoInvestigator Stereological System	MBF Bioscience		Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick
Superfrost microscope slides	Thermo Scientific	#MENSF41296SP	1 mm, 72 pcs
Technovit 7100 Plastic embedding system	Emgrid Australia	#64709003	500 mL/5 x 1 g/40 mL
Technovit 3040 yellow	Emgrid Australia	#64708805	100 g/80 mL