Enumerazione accurata del follicolo nelle ovaie di topo adulto

Riepilogo

Qui descriviamo, confrontiamo e confrontiamo due diverse tecniche per un accurato conteggio follicolo dei tessuti ovarico del topo fissi.

Abstract

Mammiferi femminili che si riproducono sessualmente nascono con tutta la loro fornitura di ovociti per tutta la vita. Gli ovociti immaturi e quiescenti si trovano all'interno dei follicoli primordiali, l'unità di stoccaggio della linea germinale femminile. Non sono rinnovabili, quindi il loro numero alla nascita e il conseguente tasso di perdita dettano in gran parte la durata fertile della vita femminile. Una quantificazione accurata del numero primordiale di follicoli nelle donne e negli animali è essenziale per determinare l'impatto di medicinali e sostanze tossiche sulla riserva ovarica. È anche necessario valutare la necessità e il successo delle tecniche di conservazione della fertilità esistenti ed emergenti. Attualmente, non esistono metodi per misurare con precisione il numero di follicoli primordiali che comprendono la riserva ovarica nelle donne. Inoltre, ottenere tessuto ovarico da grandi animali o specie in via di estinzione per la sperimentazione spesso non è fattibile. Pertanto, i topi sono diventati un modello essenziale per tali studi e la capacità di valutare i numeri primordiali dei follicoli nelle ovaie del topo intero è uno strumento critico. Tuttavia, i rapporti sui numeri assoluti dei follicoli nelle ovaie di topo in letteratura sono altamente variabili, rendendo difficile confrontare e / o replicare i dati. Ciò è dovuto a una serie di fattori tra cui tensione, età, gruppi di trattamento, nonché differenze tecniche nei metodi di conteggio impiegati. In questo articolo, forniamo una guida didattica passo-passo per preparare sezioni istologiche e contare follicoli primordiali nelle ovaie di topo usando due metodi diversi: [1] stereologia, che si basa sulla tecnica del frazionamento / dissector ottico; e [2] la tecnica del conteggio diretto. Alcuni dei principali vantaggi e svantaggi di ciascun metodo saranno evidenziati in modo da migliorare la riproducibilità sul campo e consentire ai ricercatori di selezionare il metodo più appropriato per i loro studi.

Introduzione

Gli ovociti immaturi, arrestati meioticamente immagazzinati all'interno di follicoli primordiali nell'ovaio sono l'unità di stoccaggio della linea germinale femminile e comprendono la riserva ovarica a vita di un individuo. Il numero primordiale di follicoli diminuisce naturalmente^{con l'età di 1}, o in alternativa, può essere prematuramente impoverito a seguito dell'esposizione a sostanze chimiche esogene, tra cui alcuni prodotti farmaceutici e sostanze tossiche ambientali nell'aria, negli alimenti e^{nell'acqua 2}. Dato che il numero primordiale del follicolo è finito, la quantità e la qualità dei follicoli presenti all'interno dell'ovaio determinano in gran parte la fertilità femminile e la salute della prole. Pertanto, una quantificazione accurata del numero primordiale di follicoli nelle donne è essenziale per valutare gli impatti fuori bersaglio degli insulti esogeni sulla riserva ovarica.

Nelle donne, l'analisi dell'intera ovaia non è generalmente possibile, quindi le misure surrogate non invasive della riserva ovarica devono essere utilizzate in un ambiente clinico. L'Mϋllerian anti-Mϋllerian (AMH) è il biomarcatore surrogato più utilizzato clinicamente³. I livelli di AMH sierico sono spesso misurati nelle donne in età materna avanzata, o prima e dopo il trattamento del cancro, come la chemioterapia. Tuttavia, l'AMH è prodotto dalla crescita dei follicoli e non dai follicoli primordiali, e quindi, i livelli del siero non informano sul numero primordiale assoluto del follicolo.

Con l'assenza di metodi per determinare con precisione il numero primordiale di follicoli nelle donne in situ, il conteggio dei follicoli ovarico in piccoli modelli animali, come i roditori, rimane uno strumento di ricerca essenziale per valutare il grado in cui gli insulti esogeni hanno un impatto sui follicoli primordiali e quindi sulla fertilità. Sfortunatamente, tuttavia, i rapporti in tutta la letteratura sui numeri primordiali dei follicoli nei modelli di roditori sono altamente^{variabili 4}. Una delle ragioni principali di ciò sono le differenze tecniche ampiamente riportate nel metodo di conteggio utilizzato. Prevalentemente, ci sono due diverse tecniche descritte nella letteratura per enumerare i follicoli primordiali nei topi. Questi includono la stereologia, che utilizza il metodo del dissector ottico del frazionatore, e il conteggio diretto dei follicoli.

La stereologia è ampiamente considerata il gold standard in quanto utilizza un campionamento casuale uniforme^{sistematico 5}, rendendolo il metodo più accurato per quantificare il numero primordiale del follicolo nell'intero topo, o ovaie^{di ratto 4,6,7}. La stereologia è imparziale, in quanto spiega la struttura tridimensionale dell'oggetto di interesse⁸. Utilizzando un metodo di dissector/frazionatore ottico, vengono applicati tre livelli di campionamento per quantificare i follicoli primordiali utilizzando sezioni di tessuto spesse (ad esempio, 20 μm) all'interno di una frazione nota dell'ovaio totale del topo. In primo luogo, l'intervallo di campionamento viene scelto (ad esempio, ogni 3^rd section) ad un inizio casuale (frazione di campionamento 1, f₁)⁴. Le sezioni vengono quindi campionare in modo sistematico e uniforme da questo punto attraverso l'intera ovaia. Quindi, un sistema di conteggio imparziale viene sovrapposto alla sezione ovarica e progressivamente spostato lungo una griglia di conteggio definita e randomizzata (frazione di campionamento 2, f₂)⁸. Infine, una frazione nota dello spessore della sezione viene campionato otticamente (ad esempio, 10 μm) e vengono conteggiati i follicoli all'interno di quest'area (frazione di campionamento 3, f₃)⁴. Il numero del follicolo grezzo viene moltiplicato per l'inverso di queste frazioni di campionamento per ottenere il valore finale. Questo metodo richiede una formazione e attrezzature esperte, incluso un microscopio con uno stadio motorizzato guidato da software stereologico. I tessuti devono essere conservati in un fixativo di Bouin specializzato e incorporati nella resina glicolemetacrilato per consentire il taglio di sezioni di tessuto spesse utilizzando un microtomo di resina glicolemetacrilato con un coltello di vetro. Questo metodo è progettato per tenere conto del restringimento e della deformazione tissutale, per preservare al meglio la struttura morfologica tridimensionale dell'ovaio e dei follicoli⁹.

Il conteggio diretto dei follicoli è il metodo più utilizzato per contare i^{follicoli 10}. Possono essere utilizzati fissivi più comuni (cioè formalina), seguiti da incorporamento di cera di paraffina e sessatura seriale esaustiva utilizzando un microtomo standard con uno spessore compreso tra 4-6 μm. I follicoli vengono sistematicamente conteggiati nell'intera sezione tissutale ad un intervallo definito, e quindi moltiplicati per l'inverso dell'intervallo di campionamento per ottenere la stima totale del follicolo. Questo metodo è rapido, facile, può essere eseguito utilizzando tessuti archiviati e preparato utilizzando tecniche istologiche standard. Richiede solo un microscopio a luce con funzionalità di imaging standard. Tuttavia, nonostante questi vantaggi, il conteggio diretto dei follicoli manca dell'accuratezza e dei rigorosi parametri di conteggio della stereologia, rendendolo più incline ai pregiudizi degli investigatori. Inoltre, i tessuti possono subire restringimento e deformazione durante la lavorazione, interrompendo l'integrità e la morfologia dell'ovaio e rendendo così difficile la classificazione e la quantificazione dei follicoli.

Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere due metodi comunemente usati per valutare quantitativamente il numero primordiale di follicoli nelle ovaie del topo: stereologia e conteggio diretto dei follicoli. Forniremo protocolli dettagliati per questi due metodi ed evidenzieremo alcuni dei loro punti di forza e di debolezza, al fine di migliorare la riproducibilità nel nostro campo e consentire ai ricercatori di prendere una decisione informata sul metodo di conteggio più appropriato per i loro studi.

Protocollo

Le ovaie sono state raccolte da topi C57BL6J femminili. Tutte le procedure e gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il Codice di condotta australiano NHMRC per la cura e l'uso degli animali e approvati dal Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee.

NOTA: Un agente chemioterapico ha dimostrato di esaurire gli ovociti follicoli primordiali, come determinato usando la^{stereologia 11} e il conteggio^{diretto 12,13} è stato utilizzato in questo rapporto per confrontare i due metodi di conteggio nello stesso animale. I topi femmine di 8 settimane (giovani adulti) sono stati pesati prima di una singola iniezione intraperitoneale di 75 mg/kg/peso corporeo di ciclofosfamide o controllo del veicolo salino (n=5/gruppo). Questa dose ha dimostrato di causare un impoverimento approssimativo del 50% dei follicoli primordiali, ma non è stato riferito che causi morbilità o mortalità nei^{topi 14}. Le ovaie sono state raccolte 48 ore dopo il trattamento. Un'ovaia di ciascun animale è stata fissata in soluzione di formalina tamponata neutra al 10% (v/v) per 24 ore e l'altra fissata nella soluzione di Bouin per 24 ore. Il tessuto è stato quindi incorporato nella resina glicolemetacrilato e sessato serialmente a 20 μm, oppure in paraffina e sessato serialmente a 5 μm. Tutti i tessuti erano macchiati di acido periodico Schiff ed ematossilina.

1. Preparazione istologica: fissazione, lavorazione, incorporamento e sessatura delle ovaie del topo

1. Sezionare le ovaie del topo tagliando l'ovidotto e tutto il grasso circostante, senza danneggiare o tagliare l'ovaio stesso. Se necessario, utilizzare un microscopio sezionato e una lama fine per questo passaggio (Figura 1A).
2. Fissare immediatamente i tessuti posizionandoli in un piccolo tubo marcato contenente il fissatore (stereologia) di Bouin o il fissatore formalin (conteggi diretti) per 24 ore(Figura 1B),prima di trasferire i tessuti nel 70% di etanolo.
   NOTA: La morfologia follicolare è conservata al meglio all'interno del tessuto ovarico fisso di Bouin, incorporato nella resina glicolemetacrilato (Figura 2).
3. Elaborare le ovaie fisse intere e quindi incorporare nella resina glicolemetacrilato per la stereologia (File complementare 1), o cera di paraffina per conteggi diretti utilizzando un protocollo istologico standard.
   ATTENZIONE: La resina è tossica, quindi assicurati che tutte le fasi di lavorazione dei tessuti vengano eseguite in un cappuccio dei fumi e che i guanti vengano indossati in ogni momento.
4. Utilizzare un microtome specializzato in metacrilato di resina(Figura 1C)munito di un coltello di vetro(figura 1D)per tagliare in modo esaustivo sezioni di resina glicolemetacrilato spessa (ad esempio, 20 μm). Raccogliere le sezioni a intervalli regolari (ad esempio, ogni 3^{sezione rd)} su vetrini al microscopio per stereologia.
5. Utilizzare un microtomo standard per tagliare sezioni di paraffina sottili (ad esempio, 4-6 μm). Raccogliere sezioni di tessuto a intervalli regolari (ad esempio, ogni⁹ sezione) su un vetrino al microscopio in vetro per il conteggio diretto dei follicoli.
6. Macchiare le diapositive con acido periodico Schiff ed ematossilina (File complementare 2).
7. Coverslip con DPX standard per sezioni di paraffina o DPX spesso per sezioni di resina glicolemetacrilato (Figura 1E).
   ATTENZIONE: La resina glicolemetacrilato DPX è pericolosa, quindi eseguire questo passaggio nella cappa dei fumi.
   NOTA: La resina glicolemetacrilato DPX è estremamente viscosa. La coverlip di vetro deve essere aderendo saldamente premendola verso il basso con una spatola per garantire che il DPX sia uniformemente e sottilmente disperso e che non vi siano bolle d'aria presenti sotto il coverslip (Figura 1F).

2. Stima stereologica del numero primordiale del follicolo utilizzando il frazionatore ottico

1. Accendere il computer, l'unità multicontrollo, la fotocamera e la sorgente luminosa all'interno della configurazione stereologica e impostare l'obiettivo del microscopio su un ingrandimento basso (ad esempio, 10x).
2. Aprire il software di stereologia.
3. Mettere la prima diapositiva in modo sicuro sul palco del microscopio.
4. Regolare l'esposizione della luce controllando Automatico sotto Esposizione nel pannello Impostazioni fotocamera (Figura complementare 1A). In alternativa, regolare manualmente l'esposizione alla luce.
5. Utilizzare il joystick per localizzare il primo campione di tessuto e mettere a fuoco il campione.
6. Regolare il bilanciamento del bianco, facendo clic su Altre impostazioni (situato in basso a destra nel pannello Impostazioni fotocamera), quindi fare clic su Bilanciamento del bianco e fare clic su Automatico (Figura complementare 1B). In alternativa, fare clic sul pulsante Bilanciamento bianco adiacente al pulsante Altre impostazioni (o Seleziona area in altre impostazioni) per impostare manualmente il bilanciamento del bianco selezionando un'area bianca nella sezione.
7. Passare al menu a discesa Probes e scegliere Workflow frazionatore ottico. Quindi fare clic su Avvia nuovo progetto e quindi su OK.
   1. Se è stata salvata una configurazione di campionamento esistente, in Parametri campionamento fare clic su Sì | ... e selezionare la configurazione di campionamento desiderata.
   2. In caso di meno, fare clic su No e immettere manualmente le informazioni sulla sezione seriale ( Figuracomplementare 1C) e definire la configurazione della sonda al passaggio 2.13.
8. Fate clic su Avanti (Next),impostate il microscopio su Ingrandimento basso (Low Magnification) e scegliete Ingrandimento 10x dal menu a discesa.
9. Fare clic su Avanti, quindi tracciare l'intera sezione ovarica , iniziare facendo clic a sinistra intorno alla sezione e alla fine fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Chiudi contorno.
10. Fate clic su Avanti (Next),impostate il microscopio su Ingrandimento elevato (High Magnification) e scegliete Ingrandimento olio 100x dal menu a discesa.
11. Posizionare una goccia di olio sulla sezione tissutale sullo scivolo e spostare l'obiettivo del microscopio a un ingrandimento 100x.
12. Regolare l'esposizione alla luce (come nel passaggio 2.4) e fare clic su Avanti.
13. Impostate i parametri di campionamento per definire la configurazione del probe. Qui, il telaio di conteggio è stato impostato su 47,5 μm x 47,5 μm (2.256,25 μm²) e la lunghezza del passo è stata impostata su 100 μm x 100 μm (10.000 μm²)(Figura supplementare 2). Una volta stabiliti i parametri di campionamento, salvare il modello e riaprorlo durante le sessioni di analisi successive al passaggio 2.7.
14. Fare clic su Inizia conteggio ( Figura complementare 1D). Mettere a fuoco la parte superiore dell'esempio, fare clic su OK e iniziare a contare.
15. Utilizzare la manopola di messa a fuoco per muoversi attraverso la profondità di campionamento di 10 μm e contare tutti i follicoli primordiali il cui nucleo di ovocita viene messo a fuoco. Fare clic su Avanti per passare all'area successiva.
    1. Classificare i follicoli come primordiali se l'ovociti è circondato da cellule granulosa squamose (appiattite), ma nessuna cellule di granulosa cuboidale(Figura 2A).
       NOTA: I follicoli primordiali sono distinti dai follicoli intermedi/transitori, che comprendono una combinazione di cellule granulosa cuboidali e squamose (Figura 2B) e follicoli primari, che sono circondati prevalentemente da cellule granulosa cuboidali (Figura 2C). Queste classi follicoli devono essere quantificate separatamente.
    2. Conta solo i follicoli in cui è visibile il nucleo ovocita. Il nucleo di ovocita deve apparire all'interno del quadro di conteggio o toccare le linee di inclusione verde del quadro di conteggio (Figura supplementare 1E,F).
    3. Se il nucleo di ovocita cade al di fuori del telaio di conteggio (Figura supplementare 1G) o tocca le linee di esclusione rossa del telaio di conteggio, non contare questo follicolo.
    4. Quando si valuta l'esaurimento primordiale del follicolo in risposta a una sostanza chimica esogena (ad esempio, la chemioterapia), assicurarsi che tutti i follicoli contati siano sani e quindi abbiano una morfologia normale (Figura 2). Contare separatamente eventuali follicoli anomali o atretici. Spesso, la morte follicolare è indotta da insulti come la chemioterapia e la quantificazione dei follicoli atretici dovrebbe essere ottenuta separatamente al fine di distinguere tra follicoli sani e atretici, poiché solo i follicoli sani comprendono la riserva ovarica¹⁵.
16. Una volta completato il conteggio su quella sezione, eseguire una delle operazioni seguenti:
    1. Fare clic su Aggiungi nuovasezione , quindi tornare al passaggio 2.3 per impostare la sezione successiva per il conteggio.
    2. Fare clic su Ho finito di contare per terminare la sessione. Riportare l'obiettivo a 10x, uscire dal software di stereologia e spegnere la sorgente luminosa, la fotocamera, l'unità multicontrollo e il computer.
17. Ottenere la somma del numero di follicolo grezzo (Q) da ogni sezione di tessuto campionare dall'intera ovaia, quindi utilizzando un foglio di calcolo, utilizzare l'equazione seguente per ottenere il valore finale da ogni animale replicato (N)⁴.
    dove:
    N = Numero totale stimato di follicoli all'interno dell'ovaio.
    Q = Conteggio primordiale dei follicoli grezzi.
    f₁ = Intervallo di campionamento. Ogni sezione 3^rd è stata campio campionare così .
    f₂ = Relazione tra il frame di conteggio (area campione) e il stepper, calcolato come . Poiché l'area del campione era di 2256 μm² (47,5 μm x 47,5 μm) e l'area del stepper era di 10000 μm² (100 μm x 100 μm), .
    f₃ = Frazione della sezione ovarica campionare. Poiché sono stati campionati 10 μm della sezione di 20 μm, .
    Pertanto, .
    NOTA: Questo protocollo descrive come applicare questi principi di analisi stereologiche utilizzando un software stereologico ampiamente citato (Table of Materials); tuttavia, sono disponibili altri software stereologici. I principi applicati durante le analisi stereologiche dei follicoli ovarico sono gli stessi, indipendentemente dal software utilizzato per impostare i parametri. La stereologia è più accurata quando 100 o più oggetti sono contati in un'ovaia di topo adulto⁴, in quanto ciò fornisce un coefficiente di errore per la stima inferiore al 10%¹⁶. I parametri di campionamento qui delineati sono stati ottimizzati per garantire che un minimo di circa 100 oggetti (cioè follicoli primordiali, transitori e primari) possano essere conteggiati nelle ovaie di tipo selvatico per adulti di tipo selvatico C57BL6J. È possibile condurre uno studio pilota che includa una piccola dimensione del campione per stabilire i parametri di campionamento ottimali, come l'intervallo e il numero di sezioni da analizzare e il numero di dissettori ottici all'interno delle sezioni^{campionare 17}.

3. Stima del numero primordiale del follicolo per conteggio diretto del follicolo ovarico

1. Posizionare il vetrino del microscopio in modo sicuro sotto un microscopio a luce standard ed eseguire conteggi diretti per ottenere il numero di follicolo primordiale grezzo.
   1. Classificare i follicoli come primordiali se l'ovociti è chiaramente visibile ed è circondato da cellule granulosa squamose (appiattite), ma nessuna cellule granulosa cuboidale(Figura 2D).
      NOTA: I follicoli primordiali sono distinti dai follicoli intermedi/transitori, che comprendono una combinazione di cellule granulosa cuboidale e squamosa (Figura 2E) e follicoli primari, che sono circondati prevalentemente da cellule granulosa cuboidali (Figura 2F). Queste classi follicoli devono essere quantificate separatamente.
   2. Assicurarsi che tutti i follicoli contati siano sani e abbiano quindi una morfologia normale (Figura 2). Contare separatamente eventuali follicoli anomali o atretici, poiché solo i follicoli sani comprendono la riserva ovarica.
2. In alternativa, prendi fotomicrografi multipli o cuciti ad alta potenza (ad esempio, 20 volte) dell'intera sezione del tessuto ovarico per eseguire conteggi aprendo i file di immagine. Questo può essere fatto manualmente o utilizzando uno scanner di diapositive automatizzato.
3. Ottenere il numero di follicolo grezzo (Q) da ogni sezione tissutale campionato dall'intera ovaia all'intervallo predeterminato. Moltiplicare questo numero per l'inverso della frazione di campionamento per ottenere il valore finale per ogni animale replicato (N), usando l'equazione seguente.
   dove:
   N = Numero totale stimato di follicoli all'interno dell'ovaio.
   Q = Conteggio follicolo grezzo (di ogni singolo tipo, calcolato separatamente).
   f₁ = Intervallo di campionamento. Ogni^{9° sezione} è stata campionare così .
   Pertanto, .

Risultati

È stato utilizzato un modello ben caratterizzato di esaurimento del follicolo, in base al quale alle giovani topi adulte è stata somministrata una singola dose di chemioterapia ciclofosfamide, o controllo saline del veicolo (n = 5 / gruppo) ed entrambe le ovaie sono state raccolte da ogni animale dopo 48 ore. Un'ovaia per animale è stata preparata come descritto nel passaggio 1 per ciascuno dei due metodi: stereologia o conteggi diretti. L'ovaio sinistro e destro di ogni animale è stato assegnato casualmente a ciascu...

Discussione

Questo articolo fornisce un protocollo passo-passo per la tecnica gold standard per l'enumerazione dei follicoli primordiali del topo, la stereologia e il metodo più comunemente utilizzato per il conteggio diretto dei follicoli. Il trattamento chemioterapico è stato utilizzato per confrontare e confrontare i risultati ottenuti da questi due diversi metodi all'interno dell'ovaio sinistro e destro dello stesso animale. Entrambi i metodi hanno rivelato un'elevata variabilità tra gli animali nei numeri primordiali del fol...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Butanol (HPLC)	Fisher Chemical	#A383-1
Acid alcohol	Amber Scientific	#ACDL
Bouin’s fixative	Sigma-Aldrich	#HT10132	Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)
Cyclophosphamide	Sigma-Aldrich	#C0768-5G
Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)	Sigma-Aldrich	#06522
Ethanol	Amber Scientific	#ETH	Ethanol 100%
Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle	Designs for Vision	#FEA-745-SR	Feather blade for dissections (seen in Figure 1)
Formalin fixative	Australian Biostain	#ANBFC
Glass coverslip	Thermo Scientific	#MENCS22501GP	22 mm x 50 mm
Glycomethacrylate resin RM2165 microtome	Leica Microsystems	#RM2165
Glycolmethacrylate DPX	*made in house		*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks
Histolene	Trajan	#11031
Mayer’s haematoxylin	Amber Scientific	#MH
Olympus BX50 microscope	Olympus	#BX50	Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)
Olympus immersion oil type-F	Olympus	#IMMOIL-F30CC
Olympus TH4-200 light source	Olympus	#TH4-200
Paraffin wax	Sigma-Aldrich	#03987
Periodic acid	Trajan	#PERI1%	Periodic acid 1%
Rotary Microtome CUT 4060	MicroTec	#4060R/F	Used to cut paraffin sections
Schiff’s reagent	Trajan	#SCHF
Scott's tap water	Amber Scientific	#SCOT	Potassium carbonate, magnesium sulphate, water
StereoInvestigator Stereological System	MBF Bioscience		Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick
Superfrost microscope slides	Thermo Scientific	#MENSF41296SP	1 mm, 72 pcs
Technovit 7100 Plastic embedding system	Emgrid Australia	#64709003	500 mL/5 x 1 g/40 mL
Technovit 3040 yellow	Emgrid Australia	#64708805	100 g/80 mL