Etiquetado Covalente Con Dietilpirocarbonato Para El Estudio De La Estructura De Orden Superior De Proteínas Por Espectrometría De Masas

Resumen

Se describen los procedimientos experimentales para realizar el etiquetado covalente a base de dietilpirocarbonato con detección espectrométrica de masas. El dietilpirocarbonato simplemente se mezcla con la proteína o complejo proteico de interés, lo que lleva a la modificación de residuos de aminoácidos accesibles al disolvente. Los residuos modificados se pueden identificar después de la digestión proteolítica y la cromatografía líquida / análisis de espectrometría de masas.

Resumen

Caracterizar la estructura de orden superior de una proteína es esencial para comprender su función. La espectrometría de masas (EM) ha surgido como una poderosa herramienta para este propósito, especialmente para los sistemas de proteínas que son difíciles de estudiar por métodos tradicionales. Para estudiar la estructura de una proteína por EM, se realizan reacciones químicas específicas en solución que codifican la información estructural de una proteína en su masa. Un enfoque particularmente efectivo es utilizar reactivos que modifican covalentemente las cadenas laterales de aminoácidos accesibles con disolventes. Estas reacciones conducen a aumentos de masa que se pueden localizar con la resolución del nivel de residuos cuando se combinan con la digestión proteolítica y la espectrometría de masas en tándem. Aquí, se describen los protocolos asociados con el uso de dietilpirocarbonato (DEPC) como un reactivo de etiquetado covalente junto con la detección de MS. DEPC es una molécula altamente electrofílica capaz de etiquetar hasta el 30% de los residuos en la proteína media, proporcionando así una excelente resolución estructural. DEPC se ha utilizado con éxito junto con la EM para obtener información estructural de pequeñas proteínas de un solo dominio, como la β2-microglobulina, a grandes proteínas multidominio, como los anticuerpos monoclonales.

Introducción

Las proteínas son biomoléculas esenciales en prácticamente todos los procesos fisiológicos. La variedad de funciones que realizan las proteínas son posibles debido a las estructuras que adoptan y las interacciones que tienen con otras biomoléculas. Para entender la función de la proteína en un nivel más profundo, se necesitan herramientas bioquímicas y biofísicas para dilucidar estas importantes características e interacciones estructurales. Tradicionalmente, la cristalografía de rayos X, la microscopía electrónica criogénica y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) han proporcionado el detalle a nivel atómico deseado para revelar la estructura de la ....

Protocolo

1. Preparación de proteínas y reactivos

Nota : este protocolo incluye un flujo de trabajo de ejemplo para etiquetar una proteína con DEPC. Algunas condiciones y concentraciones de reactivos enumeradas pueden variar según la proteína de elección.

1. Prepare todas las soluciones de reactivos en tubos microcentrífugos de 1,5 mL.
2. Preparar una solución proteica de la concentración deseada, generalmente en el rango de decenas de μM, en un tampón de ácido 3-(N-morfolino)propanesulfónico (MOPS) de 10 mM a pH 7.4. Alternativamente, prepare una solución de proteína de intercambio tampón existente en 10 mM pH 7.4 MOPS si la muestra co....

Resultados

Identificación de sitios de modificación de DEPC y porcentajes de modificación
La adición de masa debida al etiquetado covalente puede medirse en los niveles (a) de proteínas intactas y (b)^{péptidos 8,9.} A nivel intacto, se puede obtener una distribución de especies de proteínas con diferentes números de etiquetas a partir del análisis directo o LC-MS de muestras de proteínas etiquetadas. Para obtener información estructural de mayor resolu.......

Discusión

Pasos críticos
Se deben considerar varios puntos relacionados con el diseño experimental para garantizar resultados de etiquetado confiables. En primer lugar, para maximizar el etiquetado de proteínas, es necesario evitar los tampones con grupos fuertemente nucleófilos (por ejemplo, Tris) porque pueden reaccionar con DEPC y reducir el alcance del etiquetado. También es concebible que tales tampones puedan reaccionar con residuos etiquetados, causando la eliminación de la etiqueta y, por lo tanto, la pé.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Millipore Sigma	M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt	Millipore Sigma	M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column	Thermo Scientific	164537	300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-1
Diethylpyrocarbonate	Millipore Sigma	D5758
HPLC-grade water	Fisher Scientific	W5-1
Imidazole	Millipore Sigma	I5513
Immobilized chymotrypsin	ProteoChem	g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated	Thermo Fisher Scientific	20230
Iodoacetamide	Millipore Sigma	I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine	Millipore Sigma	C4706