Síntesis y caracterización de nanopartículas de poli(beta aminoésteres) cargadas de ARNm con fines de vacunación

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo simple para producir nanopartículas de ARNm basadas en polímeros de poli(beta aminoéster), fáciles de adaptar cambiando el ARNm encapsulado. También se describe el flujo de trabajo para sintetizar los polímeros, las nanopartículas y su caracterización esencial in vitro. También se agrega una prueba de concepto con respecto a la inmunización.

Resumen

La vacunación ha sido uno de los mayores éxitos de la sociedad moderna y es indispensable para controlar y prevenir enfermedades. Las vacunas tradicionales estaban compuestas por enteros o fracciones del agente infeccioso. Sin embargo, siguen existiendo desafíos y las nuevas tecnologías de vacunación son obligatorias. En este contexto, el uso de ARNm con fines de inmunización ha demostrado un mejor rendimiento, como lo demuestra la rápida aprobación de dos vacunas de ARNm que previenen la infección por SARS-CoV-2. Más allá del éxito en la prevención de infecciones virales, las vacunas de ARNm también se pueden utilizar para aplicaciones terapéuticas contra el cáncer.

Sin embargo, la inestabilidad del ARNm y su rápida eliminación del cuerpo debido a la presencia de nucleasas hace que su entrega desnuda no sea posible. En este contexto, las nanomedicamentos, y específicamente las nanopartículas poliméricas, son sistemas críticos de administración de ARNm. Por lo tanto, el objetivo de este artículo es describir el protocolo para la formulación y prueba de un candidato a vacuna de ARNm basado en las nanopartículas poliméricas patentadas. La síntesis y caracterización química de los polímeros poli(beta aminoésteres) utilizados, su complejación con ARNm para formar nanopartículas y su metodología de liofilización se discutirán aquí. Este es un paso crucial para disminuir los costos de almacenamiento y distribución. Por último, se indicarán las pruebas necesarias para demostrar su capacidad de transfectar in vitro y madurar células dendríticas modelo. Este protocolo beneficiará a la comunidad científica que trabaja en la vacunación debido a su alta versatilidad que permite a estas vacunas prevenir o curar una amplia variedad de enfermedades.

Introducción

Las enfermedades infecciosas han representado una grave amenaza para millones de seres humanos en todo el mundo y siguen siendo una de las principales causas de muerte en algunos países en desarrollo. La vacunación profiláctica ha sido una de las intervenciones más eficaces de la sociedad moderna para prevenir y controlar las enfermedades^{infecciosas1,2}. Estos hitos críticos de la ciencia en relevancia del siglo^XXhan sido señalados por la reciente pandemia mundial de Covid-19 causada por el virus SARS-CoV-2³. Reconociendo la importancia de contar con vacunas eficientes para re....

Protocolo

1. Síntesis de polímero pBAE con oligopéptidos finales (OM-pBAE)

1. Polimerización de C6-pBAE
   1. Añadir 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103.16 Da) 1-hexilamina (38 mmol; MW = 101,19 Da) en un matraz de vidrio de fondo redondo (100 mL). Luego, agregue diacrilato de 1,4-butanediol (82 mmol; MW = 198,22 Da).
   2. Precaliente el baño de aceite de silicona a 90 °C, coloque el matraz de fondo redondo en el baño de aceite y revuelva la mezcla con la ayuda de una barra de agitación magnética durante la noche (~ 18 h). Luego, tome el producto del matraz de fondo redondo y colóquelo en el congelador a -20 ° C.
      NOTA: El producto tiene la forma de un polvo ....

Resultados

Síntesis y caracterización de polímeros
El procedimiento de síntesis OM-pBAE se da en la Figura 2. Como muestra la Figura 2A, el primer paso para obtener el OM-pBAE es sintetizar el C6-pBAE añadiendo las aminas (1-hexilamina y 5-amino-1-pentanol, relación 1:1) al diacrilato (diacrilato de 1,4-butanodiol). Esta reacción se lleva a cabo a 90 °C durante 20 h y con agitación constante. Posteriormente, se añade una solución de oligopép.......

Discusión

Después del brote de la pandemia de Covid-19 el año pasado, la importancia de las vacunas en términos de control de enfermedades infecciosas se ha manifestado como un componente crítico⁸. Los esfuerzos de científicos de todo el mundo han permitido el lanzamiento al mercado de muchas vacunas. Por primera vez en la historia, las vacunas de ARNm han demostrado su éxito previamente hipotético, gracias a su rápido diseño debido a su capacidad para adaptarse a cualquier antígeno nuevo en unos<.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-butanediol diacrylate	Sigma Aldrich	123048
1-hexylamine	Sigma Aldrich	219703
5-amino-1-pentanol	Sigma Aldrich	411744
Acetone	Panreac	141007
CD11b antibody	BD	550993
CD86 antibody	Bioligend	105007
Chlor hydroxhyde	Panreac	181023
Chloroform-d	Sigma Aldrich	151823
Cys-His-His-His peptide	Ontores	Custom
Cys-Lys-Lys-Lys peptide	Ontores	Custom
D2O	Sigma Aldrich	151882
DEPC reagent for Rnase free water	Sigma Aldrich	D5758	This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers
Diethyl eter	Panreac	212770
dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	276855
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
mRNA EGFP	TriLink Technologies	L-7601
mRNA OVA	TriLink Technologies	L-7610
RiboGreen kit	ThermoFisher	R11490
sodium acetate	Sigma Aldrich	71196
sucrose	Sigma Aldrich	S0389
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich	302031
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	11570626
α-mouse AlexaFluor488 antibody	Abcam	Ab450105
Equipment
Nanoparticle Tracking Analyzer	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer	Varian	400 MHz
ZetaSizer	Malvern Panalytical	Nano ZS	For zeta potential and hydrodynamic size determination
Software
NanoSight NTA software	Malvern Panalytical	MAN0515-02-EN-00
NovoExpress Software	Agilent	Not specified
ZetaSizer software	Malvern Panalytical	DTS Application	To analyze surface charge and hydrodynamic sizes