La extracción de moléculas de glucógeno hepático para la determinación de la estructura del glucógeno

Resumen

Se determinó una concentración óptima de sacarosa para la extracción de glucógeno hepático mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. La adición de un paso de ebullición de 10 minutos para inhibir las enzimas que degradan el glucógeno resultó beneficiosa.

Resumen

El glucógeno hepático es un polímero de glucosa hiperramificado que interviene en el mantenimiento de los niveles de azúcar en sangre en los animales. Las propiedades del glucógeno están influenciadas por su estructura. Por lo tanto, un método de extracción adecuado que aísle muestras representativas de glucógeno es crucial para el estudio de esta macromolécula. En comparación con otros métodos de extracción, un método que emplea un paso de centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa puede minimizar el daño molecular. Basándose en este método, una publicación reciente describe cómo se varió la densidad de la solución de sacarosa utilizada durante la centrifugación (30%, 50%, 72,5%) para encontrar la concentración más adecuada para extraer partículas de glucógeno de una amplia variedad de tamaños, limitando la pérdida de partículas más pequeñas. Se introdujo un paso de ebullición de 10 minutos para probar su capacidad para desnaturalizar las enzimas que degradan el glucógeno, preservando así el glucógeno. Se demostró que la concentración más baja de sacarosa (30%) y la adición de la etapa de ebullición extraen las muestras más representativas de glucógeno.

Introducción

El glucógeno es un polímero complejo e hiperramificado de glucosa que se encuentra en animales, hongos^{y bacterias}. En los mamíferos, el glucógeno hepático funciona como un amortiguador de glucosa en sangre, preservando la homeostasis, mientras que el glucógeno muscular actúa como un reservorio de glucosa a corto plazo para proporcionar energía directamente². La estructura del glucógeno a menudo se describe por tres niveles (que se muestran en la Figura 1): 1. Las cadenas lineales están formadas por monómeros de glucosa a través de enlaces glucosídicos (1→4)-α, con puntos de ramificación conectados a través de enlaces glucosídicos (1→6)-α; 2. partículas β muy ramificadas (~20 nm de diámetro) que, especialmente en tejidos como el músculo esquelético, actúan como moléculas de glucógeno independientes ^3,4; 3. Partículas de glucógeno α más grandes (hasta 300 nm de diámetro) que consisten en unidades de glucógeno β más pequeñas, que se encuentran en el hígado⁵, el corazón⁶ y en algunas especies no mamíferas⁷. Las partículas de α hepáticas de ratones diabéticos son molecularmente frágiles, con una propensión a degradarse a partículas β cuando se disuelven en dimetilsulfóxido (DMSO), mientras que las partículas α de los controles no diabéticos generalmente permanecen sin cambios. Una hipótesis es que esta fragilidad puede exacerbar el pobre equilibrio de glucosa en sangre que se observa en la diabetes, ya que las partículas frágiles de α pueden resultar en proporciones más altas de la partícula^{de β} 8,9,10,11 que se degrada más rápidamente.

Los métodos tradicionales de extracción de glucógeno utilizan las condiciones relativamente duras de exponer el tejido hepático a una solución alcalina caliente¹² o soluciones ácidas como el ácido tricloroacético (TCA)¹³ o el ácido perclórico (PCA)¹⁴. Si bien son eficaces para separar el glucógeno de otros componentes del tejido hepático, estos métodos inevitablemente degradan la estructura del glucógeno hasta cierto punto^15,16. Aunque estos métodos son adecuados para la medición cuantitativa del contenido de glucógeno, no son ideales para estudios centrados en la obtención de información estructural sobre el glucógeno debido a este daño estructural. Desde el desarrollo de estos métodos, se ha desarrollado un procedimiento de extracción más suave que utiliza tampón Tris frío (que se ha demostrado que inhibe la degradación de la glucosidasa) con ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa 17,18,19. Con el pH controlado a ~8, este método no somete el glucógeno a la hidrólisis ácida o alcalina vista en procedimientos anteriores.

La ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa del tejido hepático homogeneizado puede separar las partículas de glucógeno de la mayor parte del material celular. Si es necesario, se puede realizar una purificación adicional mediante cromatografía de exclusión por tamaño preparativa, lo que da como resultado la recolección de glucógeno purificado con proteínas asociadas al glucógeno unidas²⁰. A pesar de que este método, en condiciones más leves, es más probable que preserve la estructura del glucógeno, es difícil evitar que una parte del glucógeno se pierda en el sobrenadante, especialmente las partículas de glucógeno más pequeñas que son menos densas¹⁵. Otra causa potencial de la pérdida de glucógeno es que las condiciones más suaves permiten cierta degradación enzimática, lo que resulta en menores rendimientos de glucógeno en comparación con los métodos de extracción más duros. Investigaciones recientes informaron de la optimización del método de extracción de glucógeno hepático para preservar la estructura del glucógeno²¹. Aquí, se probaron varias concentraciones de sacarosa (30%, 50%, 72,5%) para determinar si las concentraciones más bajas de sacarosa minimizaban la pérdida de partículas de glucógeno más pequeñas. La razón era que la densidad más baja permitiría que partículas más pequeñas y menos densas penetraran en la capa de sacarosa y se agregaran en el gránulo con el resto del glucógeno.

En este estudio, se compararon los métodos de extracción con y sin un paso de ebullición de 10 minutos para probar si las enzimas de degradación de glucógeno podían desnaturalizarse, lo que resultaría en la extracción de más glucógeno que también estaba libre de degradación parcial. Se utilizaron distribuciones de tamaño molecular completo y distribuciones de longitud de cadena de glucógeno para determinar la estructura del glucógeno extraído, similar a una optimización de la extracción de almidón publicada anteriormente²². Se utilizó la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) con detección de índice de refracción diferencial (DRI) para obtener las distribuciones de tamaño del glucógeno, que describen el peso molecular total en función del tamaño molecular. Se utilizó la electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE) para analizar las distribuciones de longitud de cadena, que describen el número relativo de cadenas de glucósidos de cada tamaño (o grado de polimerización) dado. En este trabajo se describe la metodología de extracción de glucógeno de los tejidos hepáticos basada en el estudio de optimización previo²¹. Los datos sugieren que el método más adecuado para preservar la estructura del glucógeno es una concentración de sacarosa del 30% con un paso de ebullición de 10 minutos.

Protocolo

Los hígados de ratón utilizados para optimizar este procedimiento,²¹ eran de 12 ratones machos de fondo BKS-DB/Nju (7,2 semanas de edad, véase la Tabla de Materiales). El uso de animales fue aprobado por el Comité de Ética y Cuidado de Animales del Hospital Renmin de la Universidad de Wuhan, IACUC Issue No. WDRM 20181113.

1 Tejidos animales

1. Pesar el hígado de ratón (1-1,8 g de hígado entero de cada ratón).
2. Congele rápidamente el hígado de ratón en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C.

2. Preparación de tampón y reactivos

1. Prepare un tampón de aislamiento de glucógeno que contenga 5 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 50 mM de NaF y 5 mM de pirofosfato de sodio con agua desionizada, y ajuste el pH a 8.
2. Prepare una solución de sacarosa al 30% (p/p) (que se considera más óptima para el glucógeno hepático²¹).
3. Prepare tampón de acetato de sodio (1 M, pH 4.5), tampón de ácido acético (0.1 M, pH 3.5), solución de hidróxido de sodio (0.1 M) y cianoborohidruro de sodio (1 M).
4. Prepare la solución de 8-aminopireno-1,3,6-trisulfonato (APTS) añadiendo 5 mg de APTS a 50 μL de ácido acético glacial al 15%.
5. Prepare una solución de nitrato de amonio que contenga 50 mM de nitrato de amonio con azida de sodio al 0,02%.

3. Extracción de glucógeno (Figura 2)

1. Transfiera el tejido hepático congelado (~ 1 g) a un tubo de 15 ml que contenga 6 ml de tampón de aislamiento de glucógeno.
2. Manteniéndolo en hielo, homogeneice el tejido hepático utilizando un homogeneizador de tejidos.
3. Transfiera la mitad de la suspensión (3 mL) a un tubo nuevo y hierva durante 10 min (se ha demostrado que es óptimo para estudios estructurales de glucógeno²¹). Mantenga la otra mitad de la suspensión (3 ml) en hielo para extraer el glucógeno que contiene proteínas asociadas que no están desnaturalizadas.
   NOTA: Las muestras sin hervir siempre deben mantenerse en hielo durante los pasos de extracción de glucógeno. Si las proteínas de glucógeno no son importantes para el estudio, toda la muestra puede someterse al paso de ebullición de 10 minutos.
4. Retire una alícuota de 8 μL de cada tubo, mantenga las alícuotas en hielo y utilícelas para la determinación del contenido de glucógeno (ver sección 4).
5. Centrifugar la suspensión restante a 6.000 × g durante 10 min a 4 °C.
6. Transferir los sobrenadantes a tubos de ultracentrífuga y centrifugarlos a 3,6 × 10⁵ g durante 90 min a 4 °C.
7. Deseche los sobrenadantes restantes y vuelva a suspender los gránulos en 1,5 ml de tampón de aislamiento de glucógeno.
8. Colocar las muestras en capas sobre 1,5 ml de solución de sacarosa al 30% en tubos de ultracentrífuga de 4 ml y centrifugar a 3,6 × 10⁵ g durante 2 h a 4 °C.
9. Deseche los sobrenadantes restantes y vuelva a suspender los gránulos en 200 μL de agua desionizada.
10. Añadir 800 μL de etanol absoluto a las suspensiones y mezclar bien para precipitar el glucógeno^23,24. Almacenar las mezclas a -20 °C durante al menos 1 h para permitir la precipitación.
11. Centrifugar las muestras a 6.000 × g durante 10 min a 4 °C. Deseche los sobrenadantes y vuelva a suspender los gránulos en 200 μL de agua desionizada.
12. Repita este proceso de precipitación de etanol 3 veces y vuelva a suspender el gránulo de glucógeno final en 200 μL de agua desionizada.
13. Extraer una alícuota de 8 μL de cada tubo para determinar el contenido de glucógeno (ver sección 4).
14. Congele los sobrenadantes restantes en nitrógeno líquido y liofilice (liofilice) durante la noche. Almacenar las muestras secas de glucógeno en el congelador a -20 °C.
    NOTA: Las muestras de glucógeno seco deben ser estables a -20 °C; sin embargo, no hay datos que indiquen cuánto duran sin ningún cambio estructural.

4. Determinación del contenido de glucógeno (Figura 3)

1. Añadir 8 μL de sobrenadantes de glucógeno (ver secciones 3.13 y 3.4), 5 μL de amiloglucosidasa (3269 U/mL) y 100 μL de tampón de acetato de sodio (1 M, pH 4,5) a un tubo de microcentrífuga y llenar el tubo hasta la marca de 500 μL con agua desionizada.
2. Prepare controles que usen agua desionizada en lugar de amiloglucosidasa.
3. Incubar las muestras a 50 °C durante 30 min, manteniendo los controles en hielo.
4. Centrifugar a 6.000 × g a 4 °C durante 10 min, y mezclar 300 μL de cada sobrenadante resultante con 1 mL de reactivo de glucosidasa oxidasa/peroxidasa (GOPOD).
5. Construya una curva de calibración mezclando 300 μL de agua denionizada que contenga 0, 10, 20, 30, 40 y 50 μg de D-glucosa con 1 mL de reactivo GOPOD.
6. Incubar las mezclas a 50 °C durante 30 min.
7. Lea la absorbancia (510 nm) de cada muestra utilizando placas de 96 pocillos (150 μL por pocillo) utilizando un espectrofotómetro UV-vis.
8. Reste las absorbancias de las muestras de control (sin amiloglucosidasa) de las absorbancias de las muestras experimentales, luego calcule el contenido de glucógeno en función de la curva estándar de D-glucosa.

5. Determinación del rendimiento bruto, del glucógeno y de la pureza

1. Para obtener el rendimiento bruto, pesar la muestra de glucógeno liofilizado y calcular el rendimiento como porcentaje del tejido hepático húmedo.
   NOTA: Este rendimiento debe ajustarse para corregir las alícuotas tomadas en cada paso del contenido de glucógeno.
2. Para obtener una pureza de glucógeno, determinar el contenido de glucógeno en los gránulos finales, tal como se describe en la sección 4. Calcule la pureza como un porcentaje del contenido de glucógeno determinado en relación con el rendimiento bruto (ver paso 5.1).
3. Para el rendimiento de glucógeno, determinar el contenido de glucógeno de las muestras homogeneizadas sin hervir y antes de cualquier centrifugación, como se describe en la sección 4. Calcular el rendimiento de glucógeno como porcentaje del contenido de glucógeno en los gránulos finales (véase el paso 5.2) con respecto al contenido de glucógeno determinado en el homogeneizado inicial.

6. Análisis de las distribuciones de longitud de cadena (Figura 4)

1. Pesar 0,5 mg de glucógeno liofilizado en tubos de 1,5 ml.
2. Añadir 90 μL de agua desionizada y 1,5 μL de azida sódica (0,04 g/mL) a los tubos.
3. Añadir 5 μL de tampón de ácido acético (0,1 M, pH 3,5) y 2 μL de solución de isoamilasa (180 U/mg) a los tubos para desramificar el glucógeno.
4. Incubar las muestras a 37 °C durante 3 h.
5. Añadir 5 μL de solución de hidróxido de sodio (0,1 M) a las muestras para aumentar el pH a 7,0.
6. Congele las muestras en nitrógeno líquido y liofilizarlas (liofilizarlas) durante la noche.
7. Añadir 2 μL de solución de APTS (5 mg de APTS en 50 μL de ácido acético glacial al 15%) y 2 μL de cianoborohidruro de sodio (1 M) al glucógeno desramificado liofilizado.
8. Centrifugar las muestras a 4.000 × g durante 2 min.
9. Incubar las muestras a 60 °C durante 3 h en la oscuridad.
   NOTA: El tubo se puede cubrir con papel de aluminio para proteger el contenido de la luz.
10. Agregue 200 μL de agua desionizada a las muestras y vórtelas hasta que se disuelva todo el precipitado.
11. Centrifugar las muestras a 4.000 × g durante 2 min.
12. Transfiera alícuotas de 50 μL a microviales de electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE) para su análisis.
    NOTA: Los datos se muestran como la abundancia relativa de cadenas (desramificadas) (N_de(X)) para cada grado de polimerización (DP, símbolo X).

7. Análisis de distribuciones moleculares por tamaño (Figura 5)

1. Disolver 0,5 mg de glucógeno liofilizado en 50 mM de nitrato de amonio y azida de sodio al 0,02% a 1 mg/mL.
2. Incubar las muestras en una termomezcladora a 80 °C durante 3 h a 300 rpm.
3. Inyectar las muestras en un sistema SEC utilizando una precolumna y columnas de 1000 Å y 10.000 Å a 80 °C con un caudal de 0,3 mL/min (ver Tabla de Materiales). Utilice un detector de índice de refracción para determinar el peso relativo de las moléculas en cada volumen de elución.
4. Utilizando patrones de pululano (PSS) con masas molares que oscilan entre 342 y 1,22 × 10⁶, trace una curva de calibración universal SEC para convertir el tiempo de elución a R_h (radio hidrodinámico). Exprese los datos del detector de índice de refracción diferencial (DRI) como una distribución de peso SEC w (log R_h) en función de R_h.

Resultados

Si bien el procedimiento descrito anteriormente es para el método más óptimo (sacarosa al 30% con la adición de un paso de ebullición de 10 minutos), aquí se proporcionan datos para el glucógeno extraído a través de tres concentraciones de sacarosa (30%, 50%, 72,5%), con y sin paso de ebullición, como se describió anteriormente²¹. Siguiendo el protocolo, la pureza, el rendimiento bruto y el rendimiento de glucógeno seco extraído en diferentes condiciones se dan en la Tabla 1

Discusión

Estudios previos han demostrado que la estructura del glucógeno es importante por sus propiedades; Por ejemplo, el tamaño molecular afecta la tasa de degradación del glucógeno¹⁰, y la distribución de la longitud de la cadena afecta su solubilidad²⁶. Para comprender correctamente estas relaciones, es importante extraer el glucógeno con un procedimiento que aísle, en la medida de lo posible, una muestra representativa y no dañada. Los métodos tradicionales de extracc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS)	SIGMA Aldrich	9341	0.1 M solution
Acetic acid	SIGMA Aldrich	695092	0.1 M, pH 3.5 solution
Agilent 1260 Infinity SEC system	Agilent, Santa Clara, CA, USA		Size-exclusion chromatography (SEC)
BKS-DB/Nju background mice	Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA)	SIGMA Aldrich	431788
Homogenizer	IKA	T 25
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
P/ACE MDQ plus system	Ab Sciex, US		Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
Refractive index detector	Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)		Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetate	SIGMA Aldrich	241245	1 M, pH 4.5 solution
Sodium azide	SIGMA Aldrich	S2002
Sodium chloride	SIGMA Aldrich	S9888
Sodium cyanoborohydride	SIGMA Aldrich	156159	1 M solution
Sodium fluoride	SIGMA Aldrich	201154
Sodium hydroxide	SIGMA Aldrich	43617	0.1 M solution
Sodium nitrate	SIGMA Aldrich	NISTRM8569
Sodium pyrophosphate	SIGMA Aldrich	221368
Sucrose	SIGMA Aldrich	V90016
SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns	Polymer Standards Services, Mainz, Germany		Size-exclusion chromatography (SEC)
Trizma	SIGMA Aldrich	T 1503
Ultracentrifuge tubes	Beckman		4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm