Glikojen Yapısının Belirlenmesi için Karaciğer Glikojen Moleküllerinin Ekstraksiyonu

Özet

Sükroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi kullanılarak karaciğer glikojeninin ekstraksiyonu için optimal bir sükroz konsantrasyonu belirlendi. Glikojen parçalayıcı enzimleri inhibe etmek için 10 dakikalık bir kaynatma adımının eklenmesinin faydalı olduğu kanıtlandı.

Özet

Karaciğer glikojeni, hayvanlarda kan şekeri seviyelerinin korunmasında rol oynayan hiperdallı bir glikoz polimeridir. Glikojenin özellikleri yapısından etkilenir. Bu nedenle, temsili glikojen örneklerini izole eden uygun bir ekstraksiyon yöntemi, bu makromolekülün incelenmesi için çok önemlidir. Diğer ekstraksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, sükroz yoğunluk gradyanlı santrifüjleme adımı kullanan bir yöntem moleküler hasarı en aza indirebilir. Bu yönteme dayanarak, yakın tarihli bir yayın, santrifüjleme sırasında kullanılan sakaroz çözeltisinin yoğunluğunun, çok çeşitli boyutlardaki glikojen parçacıklarını ekstrakte etmek için en uygun konsantrasyonu bulmak için nasıl değiştirildiğini (%30, %50, %72.5) açıklamaktadır. Glikojen parçalayıcı enzimleri denatüre etme yeteneğini test etmek ve böylece glikojeni korumak için 10 dakikalık bir kaynatma aşaması tanıtıldı. En düşük sükroz konsantrasyonunun (% 30) ve kaynatma aşamasının eklenmesinin, en temsili glikojen örneklerini çıkardığı gösterilmiştir.

Giriş

Glikojen, hayvanlarda, mantarlarda ve bakterilerde bulunan karmaşık, hiperdallı bir glikoz polimeridir¹. Memelilerde, karaciğer glikojeni, homeostazı koruyan bir kan şekeri tamponu olarak işlev görürken, kas glikojeni, doğrudan enerji sağlamak için kısa süreli bir glikoz rezervuarı görevi görür². Glikojenin yapısı genellikle üç seviye ile tanımlanır (Şekil 1'de gösterilmiştir): 1. Doğrusal zincirler, (1→4)-α glikozidik bağlar yoluyla glikoz monomerleri tarafından oluşturulur ve dallanma noktaları (1→6)-α glikozidik bağlarla bağlanır; 2. Özellikle iskelet kası gibi dokularda bağımsız glikojen molekülleri olarak işlev gören çok dallı β parçacıkları (~20 nm çapında) ^3,4; 3. Karaciğerde⁵, kalpte 6 ve bazı memeli olmayan türlerde bulunan daha küçük β glikojen birimlerinden oluşan daha büyük α glikojen parçacıkları (çapı³⁰⁰ nm'ye kadar)⁷. Diyabetik farelerden elde edilen hepatik α partikülleri moleküler olarak kırılgandır, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözündüğünde β partiküllere bozunma eğilimi gösterirken, diyabetik olmayan kontrollerden α partiküller genellikle değişmeden kalır. Bir hipotez, bu kırılganlığın diyabette görülen zayıf kan şekeri dengesini daha da kötüleştirebileceğidir, kırılgan α partikülleri potansiyel olarak daha hızlı bozunan β partikülünün daha yüksek oranlarına neden olur 8,9,10,11.

Geleneksel glikojen ekstraksiyon yöntemleri, karaciğer dokusunu sıcak alkali çözeltiye (TCA)¹² veya trikloroasetik asit (TCA) ¹³ veya perklorik asit (PCA) ¹⁴ gibi asit çözeltilerine maruz bırakmanın nispeten sert koşullarını kullanır. Glikojeni karaciğer dokusunun diğer bileşenlerinden ayırmada etkili olmakla birlikte, bu yöntemler kaçınılmaz olarak glikojen yapısını bir dereceye kadar bozar^15,16. Bu yöntemler, glikojen içeriğinin kantitatif ölçümü için uygun olsa da, bu yapısal hasar nedeniyle glikojen hakkında yapısal bilgi elde etmeye odaklanan çalışmalar için ideal değildir. Bu yöntemlerin geliştirilmesinden bu yana, sükroz yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme ^17,18,19 ile soğuk Tris tamponu (glukozidaz bozunmasını inhibe ettiği gösterilmiştir) kullanan daha hafif bir ekstraksiyon prosedürü geliştirilmiştir. PH ~8'de kontrol edildiğinde, bu yöntem glikojeni önceki prosedürlerde görülen asit veya alkali hidrolize maruz bırakmaz.

Homojenize karaciğer dokusunun sükroz yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjü, glikojen partiküllerini hücre materyalinin çoğundan ayırabilir. Gerekirse, hazırlayıcı boyut dışlama kromatografisi ile ek saflaştırma gerçekleştirilebilir, bu da saflaştırılmış glikojenin bağlı glikojen ile ilişkili proteinlerle^{toplanmasıyla sonuçlanır 20}. Daha hafif koşullara sahip bu yöntemin glikojenin yapısını koruma olasılığı daha yüksek olsa da, glikojenin bir kısmının süpernatantta, özellikle daha az yoğun olan daha küçük glikojen parçacıklarında kaybolmasını önlemek zordur¹⁵. Glikojen kaybının bir başka potansiyel nedeni, daha ılıman koşulların bir miktar enzimatik bozunmaya izin vermesi ve bunun sonucunda daha sert ekstraksiyon yöntemlerine kıyasla daha düşük glikojen verimine neden olmasıdır. Son araştırmalar, glikojen^21'in yapısını korumak için karaciğer-glikojen ekstraksiyon yönteminin optimizasyonunu bildirmiştir. Burada, daha düşük sakaroz konsantrasyonlarının daha küçük glikojen partiküllerinin kaybını en aza indirip indirmediğini belirlemek için çeşitli sükroz konsantrasyonları (%30, %50, %72.5) test edildi. Gerekçe, daha düşük yoğunluğun daha küçük, daha az yoğun parçacıkların sakaroz tabakasına nüfuz etmesine ve glikojenin geri kalanıyla birlikte pelette toplanmasına izin vermesiydi.

Bu çalışmada, glikojen bozunma enzimlerinin denatüre olup edilemeyeceğini test etmek için 10 dakikalık kaynatma aşaması olan ve olmayan ekstraksiyon yöntemleri karşılaştırıldı ve bu da kısmi bozunmadan arınmış daha fazla glikojenin ekstraksiyonu ile sonuçlandı. Daha önce yayınlanan bir nişasta ekstraksiyon optimizasyonuna benzer şekilde, ekstrakte edilen glikojenin yapısını belirlemek için tüm moleküler boyut dağılımları ve glikojen zincir uzunluğu dağılımları kullanıldı²². Diferansiyel kırılma indisi (DRI) algılamalı boyut dışlama kromatografisi (SEC), toplam moleküler ağırlığı moleküler boyutun bir fonksiyonu olarak tanımlayan glikojenin boyut dağılımlarını elde etmek için kullanıldı. Florofor destekli karbonhidrat elektroforezi (FACE), verilen her bir boyuttaki (veya polimerizasyon derecesinin) nispi glukozit zincirlerinin nispi sayısını tanımlayan zincir uzunluğu dağılımlarını analiz etmek için kullanıldı. Bu makale, önceki optimizasyon çalışmasına dayalı olarak karaciğer dokularından glikojen ekstraksiyon metodolojisini açıklamaktadır²¹. Veriler, glikojen yapısını korumak için en uygun yöntemin, 10 dakikalık bir kaynatma adımı ile% 30'luk bir sükroz konsantrasyonu olduğunu göstermektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu prosedürü optimize etmek için kullanılan fare karaciğerleri²¹ , 12 erkek BKS-DB / Nju arka plan faresinden alınmıştır (7.2 haftalık, Malzeme Tablosuna bakınız). Hayvan kullanımı, Wuhan Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Etik Komitesi, IACUC Sayı No. WDRM 20181113.

1 Hayvan dokuları

1. Fare karaciğerini tartın (her fareden 1-1.8 g tam karaciğer).
2. Fare karaciğerini sıvı nitrojen içinde hızla dondurun ve -80 °C'de saklayın.

2. Tampon ve reaktiflerin hazırlanması

1. Deiyonize su ile 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF ve 5 mM sodyum pirofosfat içeren glikojen izolasyon tamponu hazırlayın ve pH'ı 8'e ayarlayın.
2. % 30 (a/a) sükroz çözeltisi hazırlayın (karaciğer glikojeni²¹ için en uygun olduğu bulunmuştur).
3. Sodyum asetat tamponu (1 M, pH 4.5), asetik asit tamponu (0.1 M, pH 3.5), sodyum hidroksit çözeltisi (0.1 M) ve sodyum siyanoborohidrit (1 M) hazırlayın.
4. 50 μL% 15 buzlu asetik aside 5 mg APTS ekleyerek 8-aminopiren-1,3,6-trisülfonat (APTS) çözeltisi hazırlayın.
5. % 0.02 sodyum azid içeren 50 mM amonyum nitrat içeren amonyum nitrat çözeltisi hazırlayın.

3. Glikojen ekstraksiyonu (Şekil 2)

1. Donmuş karaciğer dokusunu (~ 1 g) 6 mL glikojen izolasyon tamponu içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
2. Buz üzerinde tutarak, bir doku homojenizatörü kullanarak karaciğer dokusunu homojenize edin.
3. Süspansiyonun yarısını (3 mL) yeni bir tüpe aktarın ve 10 dakika kaynatın (glikojen yapısal çalışmaları için en uygun olduğu gösterilmiştir²¹). Denatüre olmayan ilişkili proteinleri içeren glikojeni çıkarmak için süspansiyonun diğer yarısını (3 mL) buz üzerinde tutun.
   NOT: Kaynatılmamış numuneler, glikojen ekstraksiyon adımları sırasında her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Glikojen proteinleri çalışma için önemli değilse, tüm numune 10 dakikalık kaynatma adımından geçebilir.
4. Her tüpten 8 μL'lik bir alikot çıkarın, alikotları buz üzerinde tutun ve glikojen içeriği tayini için kullanın (bkz. bölüm 4).
5. Kalan süspansiyonu 6.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
6. Süpernatanları ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve 4 ° C'de 90 dakika boyunca 3.6 ×^{10 5} g'da santrifüjleyin.
7. Kalan süpernatanları atın ve peletleri 1.5 mL glikojen izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin.
8. Numuneleri 4 mL ultrasantrifüj tüplerinde 1,5 mL %30 sükroz çözeltisi üzerine koyun ve 4 °C'de 2 saat boyunca 3,6 ×^{10 5} g'da santrifüjleyin.
9. Kalan süpernatanları atın ve peletleri 200 μL deiyonize suda yeniden süspanse edin.
10. Süspansiyonlara 800 μL mutlak etanol ekleyin ve glikojen ^23,24'ü çökeltmek için iyice karıştırın. Karışımları -20 °C'de en az 1 saat bekletin.
11. Numuneleri 6.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları atın ve peletleri 200 μL deiyonize suda yeniden süspanse edin.
12. Bu etanol çökeltme işlemini 3 kez tekrarlayın ve son glikojen peletini 200 μL deiyonize suda yeniden süspanse edin.
13. Glikojen içeriğinin belirlenmesi için her tüpten 8 μL'lik bir alikot çıkarın (bkz. bölüm 4).
14. Kalan süpernatanları sıvı nitrojen içinde dondurun ve gece boyunca dondurarak kurutun (liyofilize). Kuru glikojen örneklerini dondurucuda -20 °C'de saklayın.
    NOT: Kuru glikojen numuneleri -20 °C'de stabil olmalıdır; Bununla birlikte, herhangi bir yapısal değişiklik olmadan ne kadar sürdüklerini gösteren hiçbir veri yoktur.

4. Glikojen miktarı tayini (Şekil 3)

1. Bir mikrosantrifüj tüpüne 8 μL glikojen süpernatan, (bkz. bölüm 3.13 ve 3.4), 5 μL amiloglukozidaz (3269 U/mL) ve 100 μL sodyum asetat tamponu (1 M, pH 4.5) ekleyin ve tüpü deiyonize su ile 500 μL işaretine kadar doldurun.
2. Amiloglucosidaz yerine deiyonize su kullanan kontroller hazırlayın.
3. Numuneleri 50 °C'de 30 dakika inkübe edin ve kontrolleri buz üzerinde tutun.
4. 10 dakika boyunca 4 ° C'de 6.000 × g'da santrifüjleyin ve elde edilen her süpernatantın 300 μL'sini 1 mL glukozidaz oksidaz / peroksidaz (GOPOD) reaktifi ile karıştırın.
5. 0, 10, 20, 30, 40 ve 50 μg D-glikoz içeren 300 μL deniyonize suyu 1 mL GOPOD reaktifi ile karıştırarak bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
6. Karışımları 50 °C'de 30 dakika daha inkübe edin.
7. Bir UV-vis spektrofotometresi kullanarak 96 oyuklu plakalar (kuyucuk başına 150 μL) kullanarak her numunenin absorbansını (510 nm) okuyun.
8. Kontrol numunelerinin absorbanslarını (amiloglukozidaz içermeyen) deneysel numunelerin absorbanslarından çıkarın, ardından D-glikoz standart eğrisine dayalı olarak glikojen içeriğini hesaplayın.

5. Ham verim, glikojen verimi ve saflık tayini

1. Ham verim için, dondurularak kurutulmuş glikojen örneğini tartın ve verimi ıslak karaciğer dokusunun yüzdesi olarak hesaplayın.
   NOT: Bu verim, her glikojen içeriği adımında alınan alikotları düzeltecek şekilde ayarlanmalıdır.
2. Glikojen saflığı için, bölüm 4'te açıklandığı gibi nihai peletlerdeki glikojen içeriğini belirleyin. Saflığı, ham verime göre belirlenen glikojen içeriğinin yüzdesi olarak hesaplayın (bkz. adım 5.1).
3. Glikojen verimi için, homojenize numunelerin glikojen içeriğini kaynatmadan ve herhangi bir santrifüjlemeden önce, bölüm 4'te açıklandığı gibi belirleyin. Glikojen verimini, son peletlerdeki glikojen içeriğinin yüzdesi olarak hesaplayın (bkz. adım 5.2) ilk homojenatta belirlenen glikojen içeriğinin yüzdesi.

6. Zincir uzunluğu dağılımlarının analizi (Şekil 4)

1. 1,5 mL'lik tüplerde 0,5 mg dondurularak kurutulmuş glikojen tartın.
2. Tüplere 90 μL deiyonize su ve 1.5 μL sodyum azid (0.04 g/mL) ekleyin.
3. Glikojeni ayırmak için tüplere 5 μL asetik asit tamponu (0.1 M, pH 3.5) ve 2 μL izoamilaz çözeltisi (180 U / mg) ekleyin.
4. Numuneleri 37 °C'de 3 saat inkübe edin.
5. pH'ı 7.0'a çıkarmak için numunelere 5 μL sodyum hidroksit çözeltisi (0.1 M) ekleyin.
6. Numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun ve gece boyunca dondurarak kurutun (liyofilize edin).
7. Dondurularak kurutulmuş dalları alınmış glikojene 2 μL APTS çözeltisi (50 μL %15 buzlu asetik asit içinde 5 mg APTS) ve 2 μL sodyum siyanobororohidrit (1 M) ekleyin.
8. Numuneleri 4.000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin.
9. Numuneleri karanlıkta 60 °C'de 3 saat inkübe edin.
   NOT: İçeriği ışıktan korumak için tüp alüminyum folyo ile kaplanabilir.
10. Numunelere 200 μL deiyonize su ekleyin ve tüm çökelti çözülene kadar vorteksleyin.
11. Numuneleri 4.000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin.
12. Analiz için 50 μL'lik alikotları florofor destekli karbonhidrat elektroforezi (FACE) mikro şişelerine aktarın.
    NOT: Veriler, her polimerizasyon derecesi için (dallanmış) zincirlerin (N_de(X)) nispi bolluğu olarak gösterilir (DP, sembol X).

7. Moleküler boyut dağılımlarının analizi (Şekil 5)

1. 0.5 mg dondurularak kurutulmuş glikojeni 50 mM amonyum nitrat ve 1 mg / mL'de% 0.02 sodyum azid içinde çözün.
2. Numuneleri bir termomikserde 80 °C'de 300 rpm'de 3 saat inkübe edin.
3. Numuneleri, 0,3 mL/dak akış hızıyla 80 °C'de bir ön kolon ve 1000 şve 10.000 şkolon kullanarak bir SEC sistemine enjekte edin ( Malzeme Tablosuna bakın). Her elüsyon hacmindeki moleküllerin bağıl ağırlığını belirlemek için bir kırılma indisi detektörü kullanın.
4. Molar kütleleri 342 ila 1.22 × 10⁶ arasında değişen pullulan standartlarını (PSS) kullanarak, elüsyon süresini RH'ye₍hidrodinamik yarıçap) dönüştürmek için bir SEC evrensel kalibrasyon eğrisi çizin. Diferansiyel kırılma indisi (DRI) detektöründen gelen verileri, Rh'nin bir fonksiyonu olarak bir SEC ağırlık dağılımı w (log Rh_{) olarak} ifade _edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan prosedür en uygun yöntem için olsa da (10 dakikalık bir kaynatma aşamasının eklenmesiyle% 30 sakaroz), burada daha önce açıklandığı gibi kaynatma aşaması olan ve olmayan üç sükroz konsantrasyonu (% 30,% 50,% 72.5) yoluyla ekstrakte edilen glikojen için veriler sağlanmaktadır²¹. Protokolü takiben, farklı koşullarla ekstrakte edilen kuru glikojenin saflığı, ham verimi ve glikojen verimi,^21'den çoğaltılan Tablo 1'de

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Önceki çalışmalar, glikojenin yapısının özellikleri için önemli olduğunu göstermiştir; Örneğin, moleküler boyut, glikojen^10'un bozunma hızını etkiler ve zincir uzunluğu dağılımı, çözünürlüğünü²⁶ etkiler. Bu ilişkileri doğru bir şekilde anlamak için, glikojeni, mümkün olduğunca temsili ve hasarsız bir numuneyi izole eden bir prosedürle ekstrakte etmek önemlidir. Geleneksel ekstraksiyon yöntemlerinde ya sıcak alkali koşullar ya da ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS)	SIGMA Aldrich	9341	0.1 M solution
Acetic acid	SIGMA Aldrich	695092	0.1 M, pH 3.5 solution
Agilent 1260 Infinity SEC system	Agilent, Santa Clara, CA, USA		Size-exclusion chromatography (SEC)
BKS-DB/Nju background mice	Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA)	SIGMA Aldrich	431788
Homogenizer	IKA	T 25
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
P/ACE MDQ plus system	Ab Sciex, US		Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
Refractive index detector	Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)		Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetate	SIGMA Aldrich	241245	1 M, pH 4.5 solution
Sodium azide	SIGMA Aldrich	S2002
Sodium chloride	SIGMA Aldrich	S9888
Sodium cyanoborohydride	SIGMA Aldrich	156159	1 M solution
Sodium fluoride	SIGMA Aldrich	201154
Sodium hydroxide	SIGMA Aldrich	43617	0.1 M solution
Sodium nitrate	SIGMA Aldrich	NISTRM8569
Sodium pyrophosphate	SIGMA Aldrich	221368
Sucrose	SIGMA Aldrich	V90016
SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns	Polymer Standards Services, Mainz, Germany		Size-exclusion chromatography (SEC)
Trizma	SIGMA Aldrich	T 1503
Ultracentrifuge tubes	Beckman		4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm