Экстракция молекул гликогена печени для определения структуры гликогена

Резюме

Определена оптимальная концентрация сахарозы для экстракции гликогена печени с помощью центрифугирования градиента плотности сахарозы. Добавление 10-минутной стадии кипячения для ингибирования ферментов, расщепляющих гликоген, оказалось полезным.

Аннотация

Гликоген печени представляет собой гиперразветвленный полимер глюкозы, который участвует в поддержании уровня сахара в крови у животных. На свойства гликогена влияет его структура. Следовательно, подходящий метод экстракции, который выделяет репрезентативные образцы гликогена, имеет решающее значение для изучения этой макромолекулы. По сравнению с другими методами экстракции, метод, использующий стадию центрифугирования с градиентом плотности сахарозы, может свести к минимуму молекулярное повреждение. Основываясь на этом методе, в недавней публикации описывается, как изменялась плотность раствора сахарозы, используемого во время центрифугирования (30%, 50%, 72,5%), чтобы найти наиболее подходящую концентрацию для извлечения частиц гликогена самых разных размеров, ограничивая потери более мелких частиц. Была введена 10-минутная стадия кипячения, чтобы проверить его способность денатурировать ферменты, разрушающие гликоген, тем самым сохраняя гликоген. Было показано, что самая низкая концентрация сахарозы (30%) и добавление стадии кипячения позволяют извлечь наиболее репрезентативные образцы гликогена.

Введение

Гликоген представляет собой сложный, гиперразветвленный полимер глюкозы, содержащийся в животных, грибах и бактериях¹. У млекопитающих гликоген печени функционирует как буфер глюкозы в крови, сохраняя гомеостаз, в то время как мышечный гликоген действует как кратковременный резервуар глюкозы, обеспечивая^{энергию напрямую.} Структуру гликогена часто описывают тремя уровнями (см. рис. 1): 1. Линейные цепи образуются мономерами глюкозы через гликозидные связи (1→4)-α, причем точки разветвления соединяются гликозидными связями (1→6)-α; 2. сильно разветвленные частицы β (~20 нм в диаметре), которые, особенно в таких тканях, как скелетные мышцы, действуют как независимые молекулы гликогена ^3,4; 3. Более крупные частицы гликогена α (до 300 нм в диаметре), состоящие из более мелких β единиц гликогена, которые обнаруживаются в печени⁵, сердце⁶ и у^{некоторых видов,} не относящихся к млекопитающим7. Частицы печеночных α от мышей с диабетом молекулярно хрупкие, со склонностью разлагаться до β-частиц при растворении в диметилсульфоксиде (ДМСО), в то время как частицы α из контрольной группы, не страдающей диабетом, обычно остаются неизменными. Одна из гипотез заключается в том, что эта хрупкость может усугубить плохой баланс глюкозы в крови, наблюдаемый при диабете, при этом хрупкие частицы α потенциально могут привести к более высоким долям более быстро разлагающихся частиц^β 8,9,10,11.

Традиционные методы экстракции гликогена используют относительно жесткие условия воздействия на ткани печени горячего щелочного раствора¹² или кислотных растворов, таких как трихлоруксусная кислота (ТСА)¹³ или хлорная кислота (РСА)¹⁴. Несмотря на то, что эти методы эффективны для отделения гликогена от других компонентов ткани печени, они неизбежно разрушают структуру гликогена в некоторой^{степени.} Хотя эти методы подходят для количественного измерения содержания гликогена, они не идеальны для исследований, ориентированных на получение структурной информации о гликогене из-за этого структурного повреждения. С момента разработки этих методов была разработана более мягкая процедура экстракции, в которой используется холодный буфер Tris (показано, что он ингибирует деградацию глюкозидазы) с ультрацентрифугированием градиента плотности сахарозы 17,18,19. При контролируемом pH ~8 этот метод не подвергает гликоген кислотному или щелочному гидролизу, наблюдаемому в предыдущих процедурах.

Ультрацентрифугирование градиента плотности сахарозы гомогенизированной ткани печени может отделить частицы гликогена от большей части клеточного материала. При необходимости дополнительную очистку можно выполнить препаративной эксклюзионной хроматографией, в результате которой получается сбор очищенного гликогена с присоединенными гликогенассоциирующими белками²⁰. Хотя этот метод, при более мягких условиях, с большей вероятностью сохраняет структуру гликогена, трудно предотвратить потерю некоторой части гликогена в надосадочной жидкости, особенно более мелких частиц гликогена, которые^{менее плотны}. Другая потенциальная причина потери гликогена заключается в том, что более мягкие условия допускают некоторую ферментативную деградацию, что приводит к более низкому выходу гликогена по сравнению с более жесткими методами экстракции. В недавних исследованиях сообщалось об оптимизации метода экстракции гликогена из печени для сохранения структуры гликогена²¹. Здесь были проверены различные концентрации сахарозы (30%, 50%, 72,5%), чтобы определить, минимизирует ли более низкая концентрация сахарозы потерю более мелких частиц гликогена. Обоснование заключалось в том, что более низкая плотность позволит более мелким, менее плотным частицам проникать в слой сахарозы и агрегировать в грануле с остальной частью гликогена.

В этом исследовании методы экстракции с 10-минутной стадией кипячения и без нее сравнивались, чтобы проверить, можно ли денатурировать ферменты деградации гликогена, что привело бы к извлечению большего количества гликогена, который также не подвергался частичному разложению. Для определения структуры экстрагированного гликогена использовали распределение целых молекул по размерам и распределение длины цепи гликогена, аналогично оптимизации экстракции крахмала, опубликованной ранее²². Методом размерной эксклюзионной хроматографии (SEC) с детектированием дифференциального показателя преломления (DRI) было получено распределение гликогена по размерам, которое описывает общую молекулярную массу в зависимости от размера молекулы. Для анализа распределений длины цепей, которые описывают относительное количество цепных цепей каждого заданного размера (или степени полимеризации), был использован электрофорез углеводов с помощью флуорофора (FACE). В данной работе описана методика извлечения гликогена из тканей печени на основе предыдущего оптимизационного исследования²¹. Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее подходящим методом для сохранения структуры гликогена является концентрация сахарозы 30% с 10-минутной стадией кипячения.

протокол

Печень мышей, использованная для оптимизации^{этой процедуры,} была взята у 12 самцов мышей BKS-DB/Nju (7,2 недели, см. таблицу материалов). Использование животных было одобрено Комитетом по уходу за животными и этике Народной больницы Уханьского университета, IACUC Issue No. WDRM 20181113.

1 Ткани животного происхождения

1. Взвесьте печень мыши (1-1,8 г цельной печени от каждой мыши).
2. Быстро заморозьте печень мыши в жидком азоте и храните ее при температуре -80 °C.

2. Приготовление буфера и реагентов

1. Приготовьте буфер для выделения гликогена, содержащий 5 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 50 мМ NaF и 5 мМ пирофосфата натрия с деионизированной водой, и отрегулируйте pH до 8.
2. Приготовьте 30% (по массе) раствор сахарозы (признан наиболее оптимальным для гликогена²¹ в печени).
3. Готовят буфер ацетата натрия (1 М, рН 4,5), уксуснокислый буфер (0,1 М, рН 3,5), раствор гидроксида натрия (0,1 М) и цианоборогидрид натрия (1 М).
4. Приготовьте раствор 8-аминопирена-1,3,6-трисульфоната (АПТС), добавив 5 мг АПТС к 50 мкл 15% ледяной уксусной кислоты.
5. Приготовьте раствор аммиачной селитры, содержащий 50 мМ аммиачной селитры с 0,02% азидом натрия.

3. Экстракция гликогена (рисунок 2)

1. Перенесите замороженную ткань печени (~1 г) в пробирку объемом 15 мл, содержащую 6 мл буфера для выделения гликогена.
2. Держа его на льду, гомогенизируйте ткани печени с помощью тканевого гомогенизатора.
3. Переложите половину суспензии (3 мл) в новую пробирку и кипятите в течение 10 мин (показано, что оптимально для структурных исследований гликогена²¹). Вторую половину суспензии (3 мл) держите на льду, чтобы извлечь гликоген, содержащий сопутствующие белки, которые не денатурированы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некипяченые образцы всегда следует держать на льду во время этапов экстракции гликогена. Если белки гликогена не важны для исследования, весь образец может пройти 10-минутную стадию кипячения.
4. Извлеките из каждой пробирки аликвоту объемом 8 мкл, держите ее на льду и используйте для определения содержания гликогена (см. раздел 4).
5. Центрифугу оставшейся суспензии при 6 000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
6. Переложите надосадочную жидкость в ультрацентрифужные пробирки и центрифугируйте их при 3,6 × 10⁵ г в течение 90 мин при 4 °С.
7. Выбросьте оставшиеся надосадочные жидкости и повторно суспендируйте гранулы в 1,5 мл буфера для выделения гликогена.
8. Образцы наслаивают на 1,5 мл 30% раствора сахарозы в ультрацентрифужных пробирках по 4 мл и центрифуге при 3,6 × 10,5г в течение 2 ч при 4 °C. 
9. Выбросьте оставшиеся надосадочные жидкости и повторно суспендируйте гранулы в 200 мкл деионизированной воды.
10. Добавьте к суспензиям 800 мкл абсолютного этанола и хорошо перемешайте до осаждения гликогена^23,24. Храните смеси при температуре -20 °C не менее 1 ч для выпадения осадков.
11. Центрифугируют образцы при 6 000 × г в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы в 200 мкл деионизированной воды.
12. Повторите этот процесс осаждения этанола 3 раза и повторно суспендируйте конечную гранулу гликогена в 200 мкл деионизированной воды.
13. Удалите аликвоту 8 мкл из каждой пробирки для определения содержания гликогена (см. раздел 4).
14. Остальные надосадочные жидкости заморозить в жидком азоте и сублимировать (лиофилизировать) на ночь. Храните сухие образцы гликогена в морозильной камере при температуре -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сухие образцы гликогена должны быть стабильны при -20 °C; Однако нет данных, указывающих на то, как долго они сохраняются без каких-либо структурных изменений.

4. Определение содержания гликогена (рисунок 3)

1. Добавьте 8 мкл гликогенной надосадочной жидкости (см. разделы 3.13 и 3.4), 5 мкл амилоглюкозидазы (3269 Ед/мл) и 100 мкл буфера ацетата натрия (1 М, рН 4,5) в микроцентрифужную пробирку и заполните пробирку до отметки 500 мкл деионизированной водой.
2. Подготовьте контрольные средства, в которых вместо амилоглюкозидазы используется деионизированная вода.
3. Инкубируют образцы при 50 °C в течение 30 мин, держа контрольные элементы на льду.
4. Центрифугу при 6 000 × г при 4 °C в течение 10 мин и смешайте 300 мкл каждого полученного надосадочной жидкости с 1 мл реагента глюкозидоксидазы/пероксидазы (GOPOD).
5. Постройте градуировочную кривую, смешав 300 мкл денионизированной воды, содержащей 0, 10, 20, 30, 40 и 50 мкг D-глюкозы, с 1 мл реагента GOPOD.
6. Выдерживают смеси при температуре 50 °C еще 30 мин.
7. Считывание поглощения (510 нм) каждого образца с помощью 96-луночных планшетов (150 мкл на лунку) с помощью спектрофотометра УФ-видимого диапазона.
8. Вычтите абсорбцию контрольных образцов (без амилоглюкозидазы) из абсорбции экспериментальных образцов, затем рассчитайте содержание гликогена на основе стандартной кривой D-глюкозы.

5. Определение выхода сырой нефти, выхода гликогена и чистоты

1. Чтобы получить сырой выход, взвесьте образец лиофилизированного гликогена и рассчитайте выход в процентах от влажной ткани печени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот выход должен быть скорректирован с поправкой на аликвоты, взятые на каждом этапе содержания гликогена.
2. Для чистоты гликогена определите содержание гликогена в конечных гранулах, как описано в разделе 4. Рассчитайте чистоту в процентах от определенного содержания гликогена по отношению к выходу сырой нефти (см. шаг 5.1).
3. Для получения гликогена определяют содержание гликогена в гомогенизированных образцах без кипячения и перед центрифугированием, как описано в разделе 4. Рассчитайте выход гликогена в процентах от содержания гликогена в конечных гранулах (см. шаг 5.2) к проценту содержания гликогена, определенного в исходном гомогенате.

6. Анализ распределений по длине цепи (рис. 4)

1. Взвесьте 0,5 мг лиофилизированного гликогена в пробирках по 1,5 мл.
2. Добавьте в пробирки 90 мкл деионизированной воды и 1,5 мкл азида натрия (0,04 г/мл).
3. Добавьте 5 мкл уксуснокислого буфера (0,1 М, рН 3,5) и 2 мкл раствора изоамилазы (180 ЕД/мг) в пробирки для расщепления гликогена.
4. Инкубируют образцы при 37 °C в течение 3 ч.
5. Добавьте к образцам 5 мкл раствора гидроксида натрия (0,1 М) для повышения рН до 7,0.
6. Заморозьте образцы в жидком азоте и высушите (лиофилизируют) в течение ночи.
7. К лиофилизированному разветвленному гликогену добавляют 2 мкл раствора APTS (5 мг APTS в 50 мкл 15% ледяной уксусной кислоты) и 2 мкл цианоборогидрида натрия (1 М).
8. Центрифугируют образцы при 4 000 × г в течение 2 мин.
9. Инкубируют образцы при 60 °C в течение 3 ч в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тюбик можно накрыть алюминиевой фольгой, чтобы защитить содержимое от света.
10. Добавьте 200 мкл деионизированной воды к образцам и встряхните их до тех пор, пока весь осадок не растворится.
11. Центрифугируют образцы при 4 000 × г в течение 2 мин.
12. Перенесите аликвоты по 50 мкл в микрофлаконы с флуорофорным электрофорезом (FACE) для анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные представлены в виде относительного количества (разветвленных) цепей (N_de(X)) для каждой степени полимеризации (DP, символ X).

7. Анализ молекулярных распределений по размерам (рис. 5)

1. Растворяют 0,5 мг лиофилизированного гликогена в 50 мМ аммиачной селитре и 0,02% азида натрия в дозе 1 мг/мл.
2. Инкубируют образцы в термомиксере при 80 °C в течение 3 ч при 300 об/мин.
3. Вводят образцы в систему SEC с помощью предварительной колонны и колонок 1000 Å и 10 000 Å при 80 °C с расходом 0,3 мл/мин (см. таблицу материалов). Используйте детектор показателя преломления для определения относительного веса молекул в каждом объеме элюирования.
4. Используя пуллулановые стандарты (PSS) с молярными массами в диапазоне от 342 до 1,22 × 10⁶, постройте универсальную калибровочную кривую SEC для преобразования времени элюирования в R_h (гидродинамический радиус). Выразите данные детектора дифференциального показателя преломления (DRI) в виде распределения веса SEC w (log R_h) в зависимости от R_h.

Результаты

В то время как описанная выше процедура является наиболее оптимальным методом (30% сахарозы с добавлением 10-минутной стадии кипячения), здесь приведены данные для гликогена, экстрагированного с помощью трех концентраций сахарозы (30%, 50%, 72,5%), со стадией кипячения и без нее, как описано ран?...

Обсуждение

Предыдущие исследования показали, что структура гликогена важна для его свойств; Например, размер молекулы влияет на скорость деградации гликогена¹⁰, а распределение длины цепи влияет на его растворимость²⁶. Чтобы правильно понять эти взаимосвязи, важно экстра...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS)	SIGMA Aldrich	9341	0.1 M solution
Acetic acid	SIGMA Aldrich	695092	0.1 M, pH 3.5 solution
Agilent 1260 Infinity SEC system	Agilent, Santa Clara, CA, USA		Size-exclusion chromatography (SEC)
BKS-DB/Nju background mice	Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA)	SIGMA Aldrich	431788
Homogenizer	IKA	T 25
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
P/ACE MDQ plus system	Ab Sciex, US		Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
Refractive index detector	Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)		Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetate	SIGMA Aldrich	241245	1 M, pH 4.5 solution
Sodium azide	SIGMA Aldrich	S2002
Sodium chloride	SIGMA Aldrich	S9888
Sodium cyanoborohydride	SIGMA Aldrich	156159	1 M solution
Sodium fluoride	SIGMA Aldrich	201154
Sodium hydroxide	SIGMA Aldrich	43617	0.1 M solution
Sodium nitrate	SIGMA Aldrich	NISTRM8569
Sodium pyrophosphate	SIGMA Aldrich	221368
Sucrose	SIGMA Aldrich	V90016
SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns	Polymer Standards Services, Mainz, Germany		Size-exclusion chromatography (SEC)
Trizma	SIGMA Aldrich	T 1503
Ultracentrifuge tubes	Beckman		4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm