グリコーゲン構造決定のための肝臓グリコーゲン分子の抽出

要約

スクロース密度勾配遠心分離を用いた肝グリコーゲンの抽出に最適なスクロース濃度を決定しました。グリコーゲン分解酵素を阻害するために10分間の煮沸ステップを加えると、有益であることが証明されました。

要約

肝グリコーゲンは、動物の血糖値の維持に関与する高分岐グルコースポリマーです。グリコーゲンの特性は、その構造の影響を受けます。したがって、グリコーゲンの代表的なサンプルを単離する適切な抽出方法は、この高分子の研究に不可欠です。他の抽出方法と比較して、ショ糖密度勾配遠心分離ステップを採用する方法は、分子損傷を最小限に抑えることができます。この方法に基づいて、最近の論文では、遠心分離中に使用するスクロース溶液の密度を変化させて(30%、50%、72.5%)、さまざまなサイズのグリコーゲン粒子を抽出するのに最も適した濃度を見つけ、より小さな粒子の損失を制限する方法が説明されています。グリコーゲン分解酵素を変性させ、グリコーゲンを保存する能力をテストするために、10分間の沸騰ステップを導入しました。最も低いショ糖濃度(30%)と煮沸工程の添加により、グリコーゲンの最も代表的なサンプルが抽出されることが示されました。

概要

グリコーゲンは、動物、真菌、バクテリアに見られるグルコースの複雑な高分岐ポリマーです¹。哺乳類では、肝臓グリコーゲンは血糖緩衝液として機能し、恒常性を維持し、筋グリコーゲンは短期的なグルコースリザーバーとして機能し、エネルギーを直接供給します²。グリコーゲンの構造は、多くの場合、3つのレベルで説明されます(図1を参照)。 1.直鎖は、(1→4)-αグリコシド結合を介してグルコースモノマーによって形成され、分岐点は(1→6)-αグリコシド結合を介して接続されています。2.特に骨格筋などの組織において、独立したグリコーゲン分子として作用する高度に分岐したβ粒子(直径~20 nm)^3,4;3.肝臓⁵、心臓⁶、および一部の非哺乳類種⁷に見られる小さなβグリコーゲン単位で構成される、より大きなαグリコーゲン粒子(直径300nmまで)。糖尿病マウス由来の肝α粒子は分子的に脆弱であり、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解するとβ粒子に分解される傾向がありますが、非糖尿病対照由来のα粒子は一般に変化しません。1つの仮説は、この脆弱性が糖尿病に見られる血糖バランスの悪さを悪化させる可能性があり、壊れやすいα粒子は、より急速に分解されたβ粒子^8,9,10,11の割合が高くなる可能性があるというものです。

従来のグリコーゲン抽出法は、肝臓組織を高温のアルカリ溶液¹²またはトリクロロ酢酸(TCA)¹³または過塩素酸(PCA)¹⁴などの酸性溶液に曝露する比較的過酷な条件を利用する。グリコーゲンを肝臓組織の他の成分から分離するのに効果的であるが、これらの方法は必然的にグリコーゲン構造をある程度分解する^15,16。これらの方法はグリコーゲン含量の定量測定には適していますが、この構造損傷によるグリコーゲンの構造情報を得ることに焦点を当てた研究には理想的ではありません。これらの方法の開発以来、スクロース密度勾配超遠心分離17,18,19でコールドトリスバッファー(グルコシダーゼ分解を阻害することが示されている)を利用する、より穏やかな抽出手順が開発されました。pH を ~8 に制御すると、この方法では、以前の手順で見られた酸またはアルカリの加水分解にグリコーゲンがかかりません。

ホモジナイズされた肝臓組織のショ糖密度勾配超遠心分離は、細胞材料の大部分からグリコーゲン粒子を分離することができます。必要に応じて、分取サイズ排除クロマトグラフィーによって追加の精製を行うことができ、その結果、グリコーゲン会合タンパク質が結合した精製グリコーゲンの収集が得られます²⁰。この方法は、より穏やかな条件では、グリコーゲンの構造を保存する可能性が高くなりますが、グリコーゲンの一部、特に密度の低い小さなグリコーゲン粒子でグリコーゲンの一部が失われるのを防ぐことは困難です¹⁵。グリコーゲン損失のもう一つの潜在的な原因は、穏やかな条件では酵素分解がある程度可能になり、その結果、より厳しい抽出方法と比較してグリコーゲン収量が低下することです。最近の研究では、グリコーゲンの構造を保存するための肝臓グリコーゲン抽出法の最適化が報告されています²¹。ここでは、さまざまなスクロース濃度(30%、50%、72.5%)をテストして、スクロース濃度が低いほど小さなグリコーゲン粒子の損失が最小限に抑えられるかどうかを判断しました。理論的根拠は、密度が低いほど、より小さく、密度の低い粒子がスクロース層に浸透し、残りのグリコーゲンとペレット内で凝集することを可能にするというものでした。

本研究では、10分間の煮沸工程がある場合とない場合の抽出方法を比較し、グリコーゲン分解酵素を変性させることができるかどうかを検証し、その結果、部分分解のないグリコーゲンをより多く抽出することができました。全分子サイズ分布とグリコーゲン鎖長分布を使用して、以前に発表されたデンプン抽出の最適化と同様に、抽出されたグリコーゲンの構造を決定しました²²。示差屈折率(DRI)検出を備えたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を使用して、全分子量を分子サイズの関数として記述するグリコーゲンのサイズ分布を取得しました。フルオロフォア支援糖鎖電気泳動(FACE)を使用して、各サイズ(または重合度)のグルコシド鎖の相対数を表す鎖長分布を分析しました。この論文では、以前の最適化研究²¹に基づいて、肝臓組織からグリコーゲンを抽出する方法論について説明します。このデータは、グリコーゲン構造を保存するのに最も適した方法は、10分間の煮沸ステップでスクロース濃度を30%にすることであることを示唆しています。

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プロトコル

この手順²¹ を最適化するために使用したマウス肝臓は、12匹の雄のBKS-DB/Njuバックグラウンドマウス(7.2週齢、 材料表を参照)からのものであった。動物の使用は、武漢大学動物管理倫理委員会、IACUC問題番号の人民病院によって承認されました。WDRM 20181113。

1 動物組織

1. マウスの肝臓(各マウスから1〜1.8 gの全肝臓)を計量します。
2. マウス肝臓を液体窒素中で急速凍結し、-80°Cで保存します。

2. 緩衝液・試薬の調製

1. 5 mM Tris、150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM NaF、5 mM ピロリン酸ナトリウムを含むグリコーゲン単離バッファーを脱イオン水で調製し、pH を 8 に調整します。
2. 30%(w / w)のスクロース溶液を調製します(肝臓グリコーゲン²¹に最も最適であることがわかっています)。
3. 酢酸ナトリウム緩衝液(1 M、pH 4.5)、酢酸緩衝液(0.1 M、pH 3.5)、水酸化ナトリウム溶液(0.1 M)、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(1 M)を調製する。
4. 50 μLの15%氷酢酸に5 mgのAPTSを添加して、8-アミノピレン-1,3,6-トリスルホン酸(APTS)溶液を調製します。
5. 50 mMの硝酸アンモニウムと0.02%アジ化ナトリウムを含む硝酸アンモニウム溶液を調製します。

3. グリコーゲン抽出(図2)

1. 凍結肝組織(~1 g)を、6 mLのグリコーゲン単離バッファーを含む15 mLチューブに移します。
2. 氷上に保管し、組織ホモジナイザーを使用して肝臓組織を均質化します。
3. 懸濁液の半分(3 mL)を新しいチューブに移し、10分間煮沸します(グリコーゲン構造研究に最適であることが示され^{ています21})。懸濁液の残りの半分(3 mL)を氷上に置いて、変性していない関連タンパク質を含むグリコーゲンを抽出します。
   注:未沸騰のサンプルは、グリコーゲン抽出ステップ中は常に氷上に保管する必要があります。グリコーゲンタンパク質が研究に重要でない場合は、サンプル全体を10分間の煮沸ステップにかけることができます。
4. 各チューブから 8 μL のアリコートを取り出し、氷上に保管し、グリコーゲン含有量の測定に使用します(セクション 4 を参照)。
5. 残りの懸濁液を6,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
6. 上清を超遠心チューブに移し、3.6×10^5g、4°Cで90分間遠心分離します。 
7. 残りの上清を廃棄し、ペレットを1.5 mLのグリコーゲン単離バッファーに再懸濁します。
8. サンプルを4 mLの超遠心チューブに1.5 mLの30%ショ糖溶液で重ね、3.6 × 10⁵ g で4°Cで2時間遠心分離します。
9. 残りの上清を廃棄し、ペレットを200μLの脱イオン水に再懸濁します。
10. 懸濁液に800μLの無水エタノールを加え、よく混合してグリコーゲン^23,24を沈殿させます。混合物を-20°Cで少なくとも1時間保存し、沈殿させます。
11. サンプルを6,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を廃棄し、ペレットを200μLの脱イオン水に再懸濁します。
12. このエタノール沈殿プロセスを3回繰り返し、最終グリコーゲンペレットを200μLの脱イオン水に再懸濁します。
13. グリコーゲン含有量を測定するために、各チューブから 8 μL のアリコートを取り出します(セクション 4 を参照)。
14. 残りの上清を液体窒素で凍結し、一晩凍結乾燥(凍結乾燥)します。乾燥グリコーゲンサンプルは、-20°Cの冷凍庫で保管してください。
    注:乾燥グリコーゲンサンプルは-20°Cで安定している必要があります。しかし、構造的な変化がなくてもどのくらい続くかを示すデータはありません。

4. グリコーゲン含量の測定(図3)

1. グリコーゲン上清 8 μL(セクション 3.13 および 3.4 を参照)、アミログルコシダーゼ 5 μL(3269 U/mL)、酢酸ナトリウムバッファー(1 M、pH 4.5)100 μL を微量遠心チューブに加え、チューブを 500 μL まで脱イオン水で満たします。
2. アミログルコシダーゼの代わりに脱イオン水を使用するコントロールを準備します。
3. サンプルを 50 °C で 30 分間インキュベートし、コントロールを氷上に保持します。
4. 6,000 × g 、4°C、10分間遠心分離し、得られた上清300 μLを1 mLのグルコシダーゼオキシダーゼ/ペルオキシダーゼ(GOPOD)試薬と混合します。
5. 0、10、20、30、40、50 μgのD-グルコースを含む脱イオン水300 μLとGOPOD試薬1 mLを混合して検量線を作成します。
6. 混合物を50°Cでさらに30分間インキュベートします。
7. 紫外可視分光光度計を用いて、96ウェルプレート(1ウェルあたり150 μL)を用いて各サンプルの吸光度(510 nm)を読み取ります。
8. 実験サンプルの吸光度から対照サンプル(アミログルコシダーゼなし)の吸光度を差し引き、D-グルコース標準曲線に基づいてグリコーゲン含有量を計算します。

5.粗収率、グリコーゲン収量、および純度測定

1. 粗収量については、凍結乾燥グリコーゲンサンプルを秤量し、湿潤肝組織に対する収量の割合として計算します。
   注:この収率は、各グリコーゲン含有量ステップで摂取したアリコートを補正するように調整する必要があります。
2. グリコーゲンの純度については、セクション 4 で説明するように、最終ペレット中のグリコーゲン含有量を決定します。粗収率に対する測定されたグリコーゲン含有量のパーセンテージとして純度を計算します(ステップ5.1を参照)。
3. グリコーゲン収量については、セクション4で説明するように、煮沸せずに遠心分離する前に、ホモジナイズしたサンプルのグリコーゲン含有量を測定します。グリコーゲン収量は、最終ペレット(ステップ5.2を参照)中のグリコーゲン含有量と、初期ホモジネートで測定されたグリコーゲン含有量のパーセンテージとして計算します。

6. 鎖長分布の解析(図4)

1. 1.5 mLチューブに0.5 mgの凍結乾燥グリコーゲンを秤量します。
2. 90 μL の脱イオン水と 1.5 μL のアジ化ナトリウム(0.04 g/mL)をチューブに加えます。
3. 5 μLの酢酸バッファー(0.1 M、pH 3.5)と2 μLのイソアミラーゼ溶液(180 U/mg)をチューブに添加し、グリコーゲンを分岐させます。
4. サンプルを37°Cで3時間インキュベートします。
5. 5 μL の水酸化ナトリウム溶液(0.1 M)をサンプルに加え、pH を 7.0 に上げます。
6. サンプルを液体窒素で凍結し、一晩凍結乾燥(凍結乾燥)します。
7. 2 μLのAPTS溶液(50 μLの15%氷酢酸中のAPTS5 mg)とシアノ水素化ホウ素ナトリウム(1 m)2 μLを凍結乾燥脱分岐グリコーゲンに加えます。
8. サンプルを4,000 × g で2分間遠心分離します。
9. サンプルを60°Cで暗所で3時間インキュベートします。
   注意: チューブをアルミホイルで覆って、内容物を光から保護することができます。
10. 200 μLの脱イオン水をサンプルに加え、すべての沈殿物が溶解するまでボルテックスします。
11. サンプルを4,000 × g で2分間遠心分離します。
12. 50 μL のアリコートを蛍光色素支援糖質電気泳動(FACE)マイクロバイアルに移し、分析します。
    注:データは、重合度(DP、記号X)ごとの(分岐した)鎖(N_de(X))の相対存在量として示されています。

7. 分子サイズ分布の解析(図5)

1. 0.5 mg の凍結乾燥グリコーゲンを 50 mM 硝酸アンモニウムと 0.02% アジ化ナトリウムに 1 mg/mL で溶解します。
2. サンプルをサーモミキサーで80°C、300rpmで3時間インキュベートします。
3. プレカラムと 1000 Å および 10,000 Å カラムを使用して、80 °C、流速 0.3 mL/分でサンプルを SEC システムに注入します( 材料表を参照)。屈折率検出器を使用して、各溶出量における分子の相対重量を測定します。
4. モル質量が 342 から 1.22 × 10⁶ の範囲のプルラン標準試料(PSS)を使用して、SEC ユニバーサル検量線をプロットし、溶出時間を Rh(流体力学的半径)に変換します。示差屈折率 (DRI) 検出器からのデータを SEC 重み分布 w (log R_h) として R_h の関数として表します。

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結果

上記の手順は、最も最適な方法(30%スクロースに10分間の煮沸工程を加えたもの)のためのものですが、ここでは、前述のように、3つのショ糖濃度(30%、50%、72.5%)で抽出されたグリコーゲンについて、煮沸工程の有無にかかわらず、データを提供します²¹。プロトコルに続いて、異なる条件で抽出された乾燥グリコーゲンの純度、粗収率、およびグリコーゲン収率を 表1

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ディスカッション

以前の研究では、グリコーゲンの構造がその特性にとって重要であることが示されています。例えば、分子サイズはグリコーゲン¹⁰の分解速度に影響を与え、鎖長分布はその溶解度^{に影響を与える26}。これらの関係を正しく理解するためには、代表的で損傷のないサンプルを可能な限り分離する手順でグリコーゲンを抽出することが重要です。従来の抽出方...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS)	SIGMA Aldrich	9341	0.1 M solution
Acetic acid	SIGMA Aldrich	695092	0.1 M, pH 3.5 solution
Agilent 1260 Infinity SEC system	Agilent, Santa Clara, CA, USA		Size-exclusion chromatography (SEC)
BKS-DB/Nju background mice	Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA)	SIGMA Aldrich	431788
Homogenizer	IKA	T 25
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
P/ACE MDQ plus system	Ab Sciex, US		Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
Refractive index detector	Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)		Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetate	SIGMA Aldrich	241245	1 M, pH 4.5 solution
Sodium azide	SIGMA Aldrich	S2002
Sodium chloride	SIGMA Aldrich	S9888
Sodium cyanoborohydride	SIGMA Aldrich	156159	1 M solution
Sodium fluoride	SIGMA Aldrich	201154
Sodium hydroxide	SIGMA Aldrich	43617	0.1 M solution
Sodium nitrate	SIGMA Aldrich	NISTRM8569
Sodium pyrophosphate	SIGMA Aldrich	221368
Sucrose	SIGMA Aldrich	V90016
SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns	Polymer Standards Services, Mainz, Germany		Size-exclusion chromatography (SEC)
Trizma	SIGMA Aldrich	T 1503
Ultracentrifuge tubes	Beckman		4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm