מיצוי מולקולות גליקוגן בכבד לקביעת מבנה הגליקוגן

Summary

ריכוז סוכרוז אופטימלי נקבע למיצוי גליקוגן בכבד באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז. תוספת של שלב רתיחה של 10 דקות לעיכוב אנזימים מפרקים גליקוגן הוכחה כמועילה.

Abstract

גליקוגן בכבד הוא פולימר גלוקוז היפר-מסועף המעורב בשמירה על רמות הסוכר בדם אצל בעלי חיים. תכונות הגליקוגן מושפעות מהמבנה שלו. לפיכך, שיטת מיצוי מתאימה המבודדת דגימות מייצגות של גליקוגן חיונית לחקר מקרומולקולה זו. בהשוואה לשיטות מיצוי אחרות, שיטה המשתמשת בשלב צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז יכולה למזער את הנזק המולקולרי. בהתבסס על שיטה זו, פורסם לאחרונה המתאר כיצד צפיפות תמיסת הסוכרוז המשמשת במהלך הצנטריפוגה השתנתה (30%, 50%, 72.5%) כדי למצוא את הריכוז המתאים ביותר לחילוץ חלקיקי גליקוגן במגוון רחב של גדלים, מה שהגביל את אובדן החלקיקים הקטנים יותר. שלב הרתחה של 10 דקות הוכנס כדי לבדוק את יכולתו לנטרל אנזימים מפרקים גליקוגן ובכך לשמר גליקוגן. ריכוז הסוכרוז הנמוך ביותר (30%) ותוספת שלב הרתיחה הוכחו כמיצוי הדגימות המייצגות ביותר של גליקוגן.

Introduction

גליקוגן הוא פולימר מורכב והיפר-מסועף של גלוקוז המצוי בבעלי חיים, פטריות וחיידקים¹. ביונקים, הגליקוגן בכבד מתפקד כחוצץ גלוקוז בדם, המשמר את ההומאוסטזיס, בעוד הגליקוגן בשריר פועל כמאגר גלוקוז לטווח קצר כדי לספק אנרגיה ישירות². מבנה הגליקוגן מתואר לעתים קרובות על-ידי שלוש רמות (מוצגות באיור 1): 1. שרשראות ליניאריות נוצרות על-ידי מונומרים של גלוקוז באמצעות (1→4)-α קשרים גליקוזידיים, כאשר נקודות ההסתעפות מחוברות באמצעות (1→6)-α קשרים גליקוזידיים; 2. חלקיקי β מסועפים מאוד (~ 20 ננומטר קוטר) אשר, במיוחד ברקמות כגון שרירי השלד, פועלים כמולקולות גליקוגן עצמאיות ^3,4; 3. חלקיקי גליקוגן α גדולים יותר (בקוטר של עד 300 ננומטר) המורכבים מיחידות גליקוגן β קטנות יותר, המצויות בכבד⁵, בלב⁶ ובכמה מינים שאינם יונקים⁷. חלקיקי α בכבד מעכברים סוכרתיים הם שבירים מולקולרית, עם נטייה להתפרק לחלקיקי β כאשר הם מומסים בדימתיל סולפוקסיד (DMSO), בעוד α חלקיקים מבקרות שאינן סוכרתיות נשארים בדרך כלל ללא שינוי. השערה אחת היא כי שבריריות זו עלולה להחמיר את מאזן הגלוקוז הלקוי בדם שנראה בסוכרת, כאשר חלקיקי α השבריריים עלולים לגרום לשיעורים גבוהים יותר^{של חלקיקי} β 8,9,10,11 המתפרקים במהירות רבה יותר.

שיטות מיצוי גליקוגן מסורתיות מנצלות את התנאים הקשים יחסית של חשיפת רקמת הכבד לתמיסת אלקליין חמה¹² או לתמיסות חומצה כגון חומצה טריכלורואצטית (TCA)¹³ או חומצה פרכלורית (PCA)¹⁴. בעוד שהן יעילות בהפרדת הגליקוגן ממרכיבים אחרים של רקמת הכבד, שיטות אלה בהכרח פוגעות במבנה הגליקוגן במידה מסוימת^15,16. למרות ששיטות אלה מתאימות למדידה כמותית של תכולת הגליקוגן, הן אינן אידיאליות למחקרים המתמקדים בקבלת מידע מבני על הגליקוגן עקב נזק מבני זה. מאז פיתוח שיטות אלה, פותח הליך מיצוי מתון יותר המשתמש בחיץ טריס קר (הוכח כמעכב פירוק גלוקוזידאז) עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז 17,18,19. כאשר ה- pH נשלט ב~8, שיטה זו אינה מכפיפה את הגליקוגן להידרוליזה חומצית או בסיסית שנצפתה בהליכים קודמים.

צפיפות סוכרוז אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של רקמת כבד הומוגנית יכולה להפריד חלקיקי גליקוגן מרוב חומר התא. במידת הצורך, ניתן לבצע טיהור נוסף על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל הכנה, וכתוצאה מכך איסוף של גליקוגן מטוהר עם חלבונים הקשורים לגליקוגן מחוברים²⁰. למרות ששיטה זו, בתנאים מתונים יותר, נוטה יותר לשמר את מבנה הגליקוגן, קשה למנוע אובדן חלק מהגליקוגן בסופרנטנט, במיוחד חלקיקי גליקוגן קטנים יותר שהם פחות צפופים¹⁵. גורם אפשרי נוסף לאובדן הגליקוגן הוא שהתנאים המתונים יותר מאפשרים פירוק אנזימטי מסוים, וכתוצאה מכך תפוקת הגליקוגן נמוכה יותר בהשוואה לשיטות מיצוי קשות יותר. מחקר שנערך לאחרונה דיווח על אופטימיזציה של שיטת מיצוי הגליקוגן בכבד כדי לשמר את המבנה של גליקוגן²¹. כאן נבדקו ריכוזי סוכרוז שונים (30%, 50%, 72.5%) כדי לקבוע אם ריכוזי סוכרוז נמוכים יותר מזערו את אובדן חלקיקי הגליקוגן הקטנים יותר. הרציונל היה שהצפיפות הנמוכה יותר תאפשר לחלקיקים קטנים וצפופים פחות לחדור את שכבת הסוכרוז ולהצטבר בכדורית עם שאר הגליקוגן.

במחקר זה, שיטות המיצוי עם ובלי שלב הרתחה של 10 דקות הושוו כדי לבדוק אם אנזימי פירוק גליקוגן יכולים להיות דנטורציה, וכתוצאה מכך מיצוי של יותר גליקוגן שהיה גם ללא פירוק חלקי. התפלגות גודל מולקולרית שלמה והתפלגויות אורך שרשרת הגליקוגן שימשו לקביעת מבנה הגליקוגן המופק, בדומה לאופטימיזציה של מיצוי עמילן שפורסמה קודם לכן²². כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC) עם זיהוי אינדקס שבירה דיפרנציאלי (DRI) שימשה להשגת התפלגות הגודל של הגליקוגן, המתארות את המשקל המולקולרי הכולל כפונקציה של גודל מולקולרי. אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE) שימשה לניתוח התפלגות אורך השרשרת, המתארות את המספר היחסי של שרשראות גלוקוזיד בכל גודל נתון (או מידת פילמור). מאמר זה מתאר את המתודולוגיה של חילוץ גליקוגן מרקמות הכבד בהתבסס על מחקר האופטימיזציה הקודם²¹. הנתונים מצביעים על כך שהשיטה המתאימה ביותר לשימור מבנה הגליקוגן היא ריכוז סוכרוז של 30% עם שלב רתיחה של 10 דקות.

Protocol

כבדי עכברים ששימשו לאופטימיזציה של הליך זה²¹ היו מ-12 עכברי רקע זכרים מסוג BKS-DB/Nju (בני 7.2 שבועות, ראו טבלת חומרים). השימוש בבעלי חיים אושר על ידי בית החולים רנמין של ועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים של אוניברסיטת ווהאן, גיליון IACUC מס '. WDRM 20181113.

1 רקמות בעלי חיים

1. לשקול כבד עכבר (1-1.8 גרם של כבד שלם מכל עכבר).
2. להקפיא במהירות את כבד העכבר בחנקן נוזלי ולאחסן אותו ב -80 ° C.

2. הכנת חיץ וריאגנטים

1. הכינו מאגר בידוד גליקוגן המכיל 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF ו-5 mM נתרן פירופוספט עם מים נטולי יונים, וכוונן את ה- pH ל- 8.
2. הכינו תמיסת סוכרוז 30% (w/w) (נמצאה האופטימלית ביותר עבור גליקוגן²¹ בכבד).
3. הכן מאגר נתרן אצטט (1 M, pH 4.5), מאגר חומצה אצטית (0.1 M, pH 3.5), תמיסת נתרן הידרוקסידי (0.1 M) ונתרן cyanoborohydride (1 M).
4. הכינו תמיסת 8-אמינופירן-1,3,6-טריסולפונט (APTS) על ידי הוספת 5 מ"ג APTS ל-50 מיקרוליטר של 15% חומצה אצטית קרחונית.
5. הכינו תמיסת אמוניום חנקתי המכילה 50 mM אמוניום חנקתי עם 0.02% נתרן אזיד.

3. מיצוי גליקוגן (איור 2)

1. העבר את רקמת הכבד הקפואה (~ 1 גרם) לצינור 15 מ"ל המכיל 6 מ"ל של מאגר בידוד גליקוגן.
2. שמירה על קרח, homogenize רקמת הכבד באמצעות homogenizer רקמות.
3. מעבירים מחצית מהמתלה (3 מ"ל) לצינור חדש ומרתיחים במשך 10 דקות (הוכח כאופטימלי למחקרי מבנה הגליקוגן²¹). שמור את החצי השני של התרחיף (3 מ"ל) על קרח כדי לחלץ חלבונים הקשורים המכילים גליקוגן שאינם מפורק .
   הערה: דגימות לא מבושלות תמיד צריכות להישמר על קרח במהלך שלבי מיצוי הגליקוגן. אם חלבוני הגליקוגן אינם חשובים למחקר, הדגימה כולה יכולה לעבור את שלב הרתיחה של 10 דקות.
4. הסר aliquot 8 μL מכל צינור, לשמור את aliquots על קרח, ולהשתמש בהם לקביעת תכולת הגליקוגן (ראה סעיף 4).
5. צנטריפוגה את המתלה הנותר ב 6,000 × גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C.
6. מעבירים את הסופרנאטנטים לצינורות אולטרה-צנטריפוגה, וצנטריפוגות אותם ב-3.6 × 10⁵ גרם למשך 90 דקות ב-4°C.
7. יש להשליך את הסופרנאטנטים הנותרים ולהשהות מחדש את הכדוריות ב-1.5 מ"ל של מאגר בידוד הגליקוגן.
8. שכב את הדגימות מעל 1.5 מ"ל של תמיסת 30% סוכרוז בצינורות אולטרה-צנטריפוגות 4 מ"ל וצנטריפוגות ב 3.6 × 10⁵ גרם במשך שעתיים ב 4 ° C.
9. השליכו את הסופרנאטנטים הנותרים והשהו מחדש את הכדוריות ב-200 מיקרוליטר של מים שעברו דה-יוניזציה.
10. מוסיפים 800 μL של אתנול מוחלט לתרחיפים ומערבבים היטב כדי לזרז גליקוגן^23,24. אחסנו את התערובות בטמפרטורה של -20°C למשך שעה לפחות כדי לאפשר משקעים.
11. צנטריפוגה הדגימות ב 6,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנטים והשהו מחדש את הכדוריות ב-200 מיקרוליטר מים שעברו דה-יוניזציה.
12. חזור על תהליך משקעים אתנול זה 3x והשהה מחדש את גלולת הגליקוגן הסופית ב 200 μL של מים deionized.
13. הסר אליציטוט של 8 μL מכל צינור לצורך קביעת תכולת הגליקוגן (ראה סעיף 4).
14. מקפיאים את הסופרנאטנטים הנותרים בחנקן נוזלי ומייבשים בהקפאה (ליופיליז) למשך הלילה. אחסנו את דגימות הגליקוגן היבש במקפיא בטמפרטורה של -20°C.
    הערה: דגימות הגליקוגן היבש צריכות להיות יציבות ב -20 °C; עם זאת, אין נתונים המציינים כמה זמן הם נמשכים ללא שינויים מבניים.

4. קביעת תכולת הגליקוגן (איור 3)

1. הוסף 8 μL של supernatants גליקוגן, (ראה סעיפים 3.13 ו 3.4), 5 μL של עמיloglucosidase (3269 U / mL), ו 100 μL של חיץ נתרן אצטט (1 M, pH 4.5) לצינור microcentrifuge ולמלא את הצינור עד 500 μL סימן עם מים deionized.
2. הכן פקדים המשתמשים במים נטולי יונים, במקום עמילוגלוקוזידאז.
3. יש לדגור על הדגימות בטמפרטורה של 50°C למשך 30 דקות, תוך שמירה על הבקרות על קרח.
4. צנטריפוגה בטמפרטורה של 6,000 × גרם ב-4°C למשך 10 דקות, וערבבו 300 מיקרוליטר של כל סופרנאטנט שנוצר עם 1 מ"ל של מגיב גלוקוזידאז אוקסידאז/פרוקסידאז (GOPOD).
5. בניית עקומת כיול על ידי ערבוב 300 μL של מים denionized המכילים 0, 10, 20, 30, 40, ו 50 מיקרוגרם של D-גלוקוז עם 1 מ"ל של מגיב GOPOD.
6. דוגרים על התערובות ב-50°C למשך 30 דקות נוספות.
7. קרא את הספיגה (510 ננומטר) של כל דגימה באמצעות לוחות 96 בארות (150 מיקרוליטר לבאר) באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis.
8. הפחת את הספיגות של דגימות ביקורת (ללא עמילוגלוקוזידאז) מהספיגות של דגימות ניסיוניות, ולאחר מכן חשב את תכולת הגליקוגן בהתבסס על עקומת תקן גלוקוז D.

5. תפוקת נפט גולמי, תפוקת גליקוגן וקביעת טוהר

1. עבור היבול הגולמי, שקול את דגימת הגליקוגן המיובש בהקפאה וחשב את התשואה כאחוז מרקמת הכבד הרטובה.
   הערה: יש להתאים תפוקה זו כדי לתקן את האליציטוטים שנלקחו בכל שלב בתכולת הגליקוגן.
2. לטוהר הגליקוגן, יש לקבוע את תכולת הגליקוגן בכדוריות הסופיות, כמתואר בסעיף 4. חשב את הטוהר כאחוז מתכולת הגליקוגן שנקבעה ביחס ליבול הגולמי (ראה שלב 5.1).
3. עבור תפוקת הגליקוגן, לקבוע את תכולת הגליקוגן של הדגימות ההומוגניות ללא רתיחה ולפני כל צנטריפוגה, כמתואר בסעיף 4. חישוב תפוקת הגליקוגן כאחוז מתכולת הגליקוגן בכדוריות הסופיות (ראה שלב 5.2) לזו של תכולת הגליקוגן שנקבעה בהומוגנט הראשוני.

6. ניתוח התפלגות אורך שרשרת (איור 4)

1. שוקלים 0.5 מ"ג גליקוגן מיובש בהקפאה בצינורות 1.5 מ"ל.
2. הוסף 90 μL של מים נטולי יונים, ו 1.5 μL של נתרן אזיד (0.04 גרם / מ"ל) לצינורות.
3. הוסף 5 μL של חוצץ חומצה אצטית (0.1 M, pH 3.5) ו 2 μL של תמיסת איזועמילאז (180 U / mg) לצינורות כדי לפרק את הגליקוגן.
4. לדגור את הדגימות ב 37 ° C במשך 3 שעות.
5. הוסף 5 μL של תמיסת נתרן הידרוקסידי (0.1 M) לדגימות כדי להגדיל את ה- pH ל -7.0.
6. יש להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי ולייבש בהקפאה (ליופיליזציה) למשך הלילה.
7. הוסף 2 μL של תמיסת APTS (5 מ"ג של APTS ב 50 μL של 15% חומצה אצטית קרחונית) ו 2 μL נתרן cyanoborohydride (1 M) לגליקוגן מיובש בהקפאה.
8. צנטריפוגה את הדגימות ב 4,000 × גרם במשך 2 דקות.
9. לדגור את הדגימות ב 60 ° C במשך 3 שעות בחושך.
   הערה: ניתן לכסות את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להגן על התכולה מפני אור.
10. הוסף 200 μL של מים deionized לדגימות ולערבל אותם עד כל המשקע מומס.
11. צנטריפוגה את הדגימות ב 4,000 × גרם במשך 2 דקות.
12. העברת aliquots של 50 μL מיקרו-בקבוקונים אלקטרופורזה פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE) לניתוח.
    הערה: הנתונים מוצגים כשפע היחסי של שרשראות (מסועפות) (N_de(X)) עבור כל דרגת פילמור (DP, סמל X).

7. ניתוח התפלגות גודל מולקולרית (איור 5)

1. ממיסים 0.5 מ"ג גליקוגן מיובש בהקפאה ב-50 מ"מ אמוניום חנקתי ו-0.02% נתרן אזיד ב-1 מ"ג/מ"ל.
2. לדגור את הדגימות בתרמומיסר ב 80 ° C במשך 3 שעות ב 300 סל"ד.
3. הזריקו את הדגימות למערכת SEC באמצעות עמודות קדם-עמודה ועמודות 1000 Å ו-10,000 Å ב-80°C עם קצב זרימה של 0.3 מ"ל/דקה (ראו טבלת חומרים). השתמש בגלאי אינדקס שבירה כדי לקבוע את המשקל היחסי של מולקולות בכל נפח אלוציה.
4. באמצעות תקני פולולן (PSS) עם מסות טוחנות הנעות בין 342 ל -1.22 × 10⁶, התווה עקומת כיול אוניברסלית של SEC כדי להמיר את זמן האלוציה ל - R_h (רדיוס הידרודינמי). בטא את הנתונים מגלאי אינדקס השבירה הדיפרנציאלי (DRI) כהתפלגות משקל SEC w (log R_h) כפונקציה של R_h.

תוצאות

בעוד שההליך המתואר לעיל הוא לשיטה האופטימלית ביותר (30% סוכרוז בתוספת שלב רתיחה של 10 דקות), הנתונים מסופקים כאן עבור גליקוגן המופק באמצעות שלושה ריכוזי סוכרוז (30%, 50%, 72.5%), עם וללא שלב רותח, כפי שתואר קודם לכן²¹. בעקבות הפרוטוקול, הטוהר, התפוקה הגולמית ותפוקת הגליקוגן של גליקוגן יבש...

Discussion

מחקרים קודמים הראו כי מבנה הגליקוגן חשוב לתכונותיו; לדוגמה, הגודל המולקולרי משפיע על קצב ההתפרקות של גליקוגן¹⁰, והתפלגות אורך השרשרת משפיעה על מסיסותו²⁶. כדי להבין כראוי את היחסים הללו, חשוב לחלץ גליקוגן בהליך המבודד, ככל האפשר, דגימה מייצגת ולא פגומה. שיטות מיצוי מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS)	SIGMA Aldrich	9341	0.1 M solution
Acetic acid	SIGMA Aldrich	695092	0.1 M, pH 3.5 solution
Agilent 1260 Infinity SEC system	Agilent, Santa Clara, CA, USA		Size-exclusion chromatography (SEC)
BKS-DB/Nju background mice	Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA)	SIGMA Aldrich	431788
Homogenizer	IKA	T 25
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
Hydrochloric acid	SIGMA Aldrich	2104	0.1 M solution
P/ACE MDQ plus system	Ab Sciex, US		Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
Refractive index detector	Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)		Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetate	SIGMA Aldrich	241245	1 M, pH 4.5 solution
Sodium azide	SIGMA Aldrich	S2002
Sodium chloride	SIGMA Aldrich	S9888
Sodium cyanoborohydride	SIGMA Aldrich	156159	1 M solution
Sodium fluoride	SIGMA Aldrich	201154
Sodium hydroxide	SIGMA Aldrich	43617	0.1 M solution
Sodium nitrate	SIGMA Aldrich	NISTRM8569
Sodium pyrophosphate	SIGMA Aldrich	221368
Sucrose	SIGMA Aldrich	V90016
SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns	Polymer Standards Services, Mainz, Germany		Size-exclusion chromatography (SEC)
Trizma	SIGMA Aldrich	T 1503
Ultracentrifuge tubes	Beckman		4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm